CC BY
16
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
НАУЧНАЯ СТАТЬЯ
https://doi.oig/10.36233/0507-4088-141 в КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2022
Генетический полиморфизм сибирских изолятов коронавируса крупного рогатого скота (Coronaviridae: Betacoronavirus: Betacoronavirus-1 )
Глотов А.Г.1, Нефедченко А.В.1, Южаков А.Г.2, Котенева С.В.1, Глотова Т.И.1, Комина А.К.2, Красников Н.Ю.2
1ФГБУН «Сибирский федеральный научный центр агробиотехнологий Российской академии наук (СФНЦА РАН)», Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока, 630501, Новосибирская обл., Новосибирский район, пос. Краснообск, Россия;
2ФГБНУ «Федеральный научный центр Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской академии наук», 109428, г. Москва, Россия
Введение. Коронавирусы крупного рогатого скота (BCoV) - причина диарей, респираторных болезней телят и зимней дизентерии коров. Актуально изучение генетического разнообразия этих вирусов. Цель работы - изучение генетического полиморфизма изолятов BCoV, циркулирующих среди молочного скота в Сибири.
Материалы и методы. В работе использован биоматериал, взятый у падших или вынужденно забитых животных до начала исследования. Мишень для амплификации - нуклеотидные последовательности участков генов S и N. Филогенетические дендрограммы строили с использованием метода максимального правдоподобия в программе MEGA 7.0.
Результаты. По результатам ОТ-ПЦР геном вируса присутствовал в пробах биоматериала от телят с ди-арейным (16,3%) и респираторным (9,9%) синдромами. Первичные нуклеотидные последовательности участка гена S определили для 18, а гена N - для 12 изолятов. На основе гена S изоляты разделились на две клады с двумя подкладами в каждой. В первую подкладу первой клады (европейская линия) вошли 11 изолятов. Во вторую подкладу, включающую классические штаммы Квебек и Мёбус, исследуемые изоляты не входили. В первой подкладе второй клады (американо-азиатская линия) оказались 6 исследованных изолятов. Ко второй подкладе (смешанная линия) отнесли один изолят. На основе гена N получили две клады, одна из которых включала две подклады. В первую подкладу первой клады вошли 3 изолята (американо-азиатская линия), а во вторую - один (смешанная линия). Во второй кладе (смешанная) оказались 8 изолятов. Различий между диарейными и респираторными изолятами, а также зависимости от их географического местоположения не установили.
Заключение. Исследованная популяция изолятов BCoV носит неоднородный характер. Анализ нуклеотид-ных последовательностей является полезным инструментом для изучения молекулярной эпизоотологии коронавирусных инфекций и решения вопроса о применении вакцин в конкретном регионе.
Ключевые слова: крупный рогатый скот; коронавирусы; секвенирование; филогенетический анализ Для цитирования: Глотов А.Г., Нефедченко А.В., Южаков А.Г., Котенева С.В., Глотова Т.И., Комина А.К., Красников Н.Ю. Генетический полиморфизм сибирских изолятов коронавируса крупного рогатого скота (Coronaviridae: Betacoronavirus: Betacoronavirus-1). Вопросы вирусологии. 2022; 67(6): 465-474. DOI: https:// doi.org/10.36233/0507-4088-141
Для корреспонденции: Глотов Александр Гаврилович, д-р вет. наук, профессор, главный научный сотрудник - заведующий лабораторией биотехнологии диагностическим центром ФГБУН «Сибирский федеральный научный центр агробиотехнологий (СФНЦА) РАН», Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока, 630501, Новосибирская область, Новосибирский р-н, пос. Краснообск, Россия. E-mail: [email protected]
Участие авторов: Глотов А.Г. - идея и дизайн исследования, систематизация результатов, написание текста, утверждение окончательного варианта статьи; Нефедченко А.В. - молекулярно-генетические исследования; Южаков А.Г. - молекулярно-генетические исследования, анализ сиквенсов; Котенева С.В. - обработка биологического материала; Глотова Т.И. - анализ литературы, редактирование статьи; Комина А.К. - обработка биологического материала, секвенирование; Красников Н.Ю. - обработка биологического материала, секвенирование. Финансирование. Исследование выполнено за счёт государственного бюджета в рамках выполнения задания № 0533-2021-0018 (СФНЦА РАН) и части работы по теме № FGUG-2022-18 (ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН).
ORIGINAL RESEARCH
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Этическое утверждение. Авторы подтверждают соблюдение институциональных и национальных стандартов по использованию лабораторных животных в соответствии с CONSENSUS AUTHOR GUIDELINES FOR ANIMAL USE (IAVES 23 JULY 2010).
Поступила 25.09.2022 Принята в печать 21.11.2022 Опубликована 30.12.2022
ORIGINAL ARTICLE
https://doi.org/10.36233/0507-4088-141
Genetic diversity of Siberian bovine coronavirus isolates (Coronaviridae: Betacoronavirus: Betacoronavirus-1)
Alexander G. Glotov1, Alexey V. Nefedchenko1, Anton G. Yuzhakov2, Svetlana V. Koteneva1, Tatyana I. Glotova1, Alina K. Komina2, Nikita Yu. Krasnikov2
1Siberian Federal Scientific Centre of Agro-Biotechnologies of the Russian Academy of Science, Institute of Experimentally Veterinary Medicine of Siberia and Far East, Krasnoobsk, Novosibirsk Region, 630501, Russia; 2Federal Scientific Center All-Russian Research Institute of Experimental Veterinary named after K.I. Scriabin and Ya.R. Kovalenko of the Russian Academy of Sciences, 109428, Moscow, Russia
Introduction. Bovine coronaviruses (BCoVs) are causative agents of diarrhea, respiratory diseases in calves and winter cow dysentery. The study of genetic diversity of these viruses is topical issue.
The purpose of the research is studying the genetic diversity of BCoV isolates circulating among dairy cattle in Siberia. Materials and methods. Specimens used in this study were collected from animals that died or was forcedly slaughtered before the start of the study. The target for amplification were nucleotide sequences of S and N gene regions.
Results. Based on the results of RT-PCR testing, virus genome was present in 16.3% of samples from calves with diarrheal syndrome and in 9.9% with respiratory syndrome. The nucleotide sequences of S gene region were determined for 18 isolates, and N gene sequences - for 12 isolates. Based on S gene, isolates were divided into two clades each containing two subclades. First subclade of first clade (European line) included 11 isolates. Second one included classic strains Quebec and Mebus, strains from Europe, USA and Korea, but none of sequences from this study belonged to this subclade. 6 isolates belonged to first subclade of second clade (American-Asian line). Second subclade (mixed line) included one isolate. N gene sequences formed two clades, one of them included two subclades. First subclade included 3 isolates (American-Asian line), and second subclade (mixed) included one isolate. Second clade (mixed) included 8 sequences. No differences in phylogenetic grouping between intestinal and respiratory isolates, as well as according to their geographic origin were identified.
Conclusion. The studied population of BCoV isolates is heterogeneous. Nucleotide sequence analysis is a useful tool for studying molecular epidemiology of BCoV. It can be beneficial for choice of vaccines to be used in a particular geographic region.
Keywords: cattle; coronaviruses; sequencing; phylogenetic analysis
For citation: Glotov A.G., Nefedchenko A.V., Yuzhakov A.G., Koteneva S.V. Glotova T.I., Komina K.A., Krasnikov N.Y. Genetic polymorphism of Siberian bovine coronavirus isolates (Coronaviridae: Betacoronavirus: Betacoronavirus-1). Problems of Virology (Voprosy Virusologii). 2022; 67(6): 465-474 (In Russ.). DOI: https://doi. org/10.36233/0507-4088-141
For correspondence: Alexander G. Glotov, Dr. Sci. (Vet.), Professor, Chief Researcher - Head of Biotechnology
Laboratory, Diagnostic Center, FSBIS Siberian Federal Scientific Center for Agrobiotechnologies of the Russian
Academy of Sciences, Institute of Experimental Veterinary Medicine of Siberia and the Far East, Krasnoobsk,
Novosibirsk Region, 630501, Russia. E-mail: [email protected]
Information about the authors:
Glotov A.G., https://orcid.org/0000-0002-2006-0196
Nefedchenko A.V., https://orcid.org/0000-0002-4181-4268
Yuzhakov A.G., https://orcid.org/0000-0002-0426-9678
Koteneva S.V., https://orcid.org/0000-0003-2649-7505
Glotova T.I., https://orcid.org/0000-0003-3538-8749
Komina K.A., https://orcid.org/0000-0002-7173-5501
Krasnikov N.Y., https://orcid.org/0000-0001-8148-3080
Contribution: Glotov A.G. - the idea and design of the study, systematization of the results, writing the text, approval of the final version of the article; Nefedchenko A.V. - molecular genetic studies; Yuzhakov A.G. - molecular genetic studies, sequence analysis; Koteneva S.V. - processing of biological material; Glotova T.I. - literature analysis, article editing; Komina A.K. - processing of biological material, sequencing; Krasnikov N.Yu. - processing of biological material, sequencing.
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Funding. The research was carried out at the expense of the state budget within the framework of assignment No. 0533-2021-0018 (SFSC RAS) and the part of the work on the topic No. FGUG-2022-18 (VIEV RAS). Conflict of interest. The author declares no conflict of interest.
Ethics approval. Authors confirm compliance with institutional and national standards for the use of laboratory animals in accordance with CONSENSUS AUTHOR GUIDELINES FOR ANIMAL USE (IAVES 23 JULY 2010).
Received 25 September 2022 Accepted 21 November 2022 Published 30 December 2022
Введение
Коронавирус крупного рогатого скота (Bovine Coronavirus - BCoV) принадлежит к порядку Nidovirales, семейству Coronaviridae, роду Betacoronavirus-1 [1]. Геном вируса представлен одноцепочечной положительно заряженной РНК (рибонуклеиновая кислота) размером около 32 Kb и включает 10 открытых рамок считывания (ORF), фланкированных 5'- и З'-нетранс-лируемыми областями [2]. Это оболочечный вирус диаметром примерно 100-120 нм с пятью структурными белками:
- шиповидный гликопротеин (S);
- интегральный мембранный белок (М);
- гликопротеин - гемагглютинин-эстераза (HE);
- малый мембранный белок (E);
- нуклеокапсидный фосфопротеин (N) [3].
Белок N богат основными аминокислотами и напрямую связан с геномной РНК, образуя геликоидальный нуклеокапсид. Он выполняет функции, связанные с вирусным патогенезом, транскрипцией и репликацией. Его часто используют для молекулярной диагностики BCoV, поскольку это высококонсервативный белок, экспрессирующийся в больших количествах во время репликации вируса [4, 5]. Гликопротеин S выполняет две основные биологические функции -прикрепление вируса к клеткам-мишеням и слияние с клеточной мембраной. Ген этого белка менее консервативен, подвергается селективному прессингу со стороны иммунной системы, что используется вирусом для уклонения от иммунного ответа организма, но также пригоден в качестве мишени для молекулярного анализа [6].
BCoV распространены повсеместно [7-11] и, кроме основного хозяина, инфицируют широкий спектр домашних и диких жвачных животных и даже человека, вызывая у них сходный симптомокомплекс [5, 12-15].
Предполагается, что генетическое разнообразие BCoV является низким по сравнению с другими членами семейства, но они принадлежат к группе быстро развивающихся вирусов, для которых характерно постоянное создание новых вариантов [16]. Эта пластичность может обеспечить эволюционное преимущество в быстро меняющихся условиях, позволяя адаптироваться к различным тканям и хозяевам, избегать иммунного ответа хозяина и даже преодолевать межвидовые барьеры [16-18].
Инфекции BCoV связаны с диарейным синдромом у новорождённых телят [19, 20, 26], заболеваниями дыхательных путей у молочных телят и откормочного скота [21-24], а также зимней дизентерией у взрослых животных [5] и приводят к значитель-
ным экономическим потерям в промышленном животноводстве [9].
Несмотря на некоторые различия в гене 5" между кишечными и респираторными изолятами, до сих пор не выявлены маркеры (антигенные или генетические), позволяющие различать их между собой [14, 15, 18].
Недавнее появление и распространение SARS-Со^2 вновь привлекло внимание к коронавирусам и их эволюционному потенциалу [25]. Было продемонстрировано, что высокая скорость мутаций и рекомбинаций способствует возникновению генотипи-ческой и фенотипической изменчивости коронавиру-сов других родов [18].
Изменения в различных частях генома этих вирусов являются результатом протяжённых генных де-леций, гомологичных рекомбинаций РНК и мутаций, напрямую влияющих на тканевый тропизм. Частота мутаций у BCoV является довольно высокой. Независимо от рассматриваемого гена, скорость эволюции оценивается примерно в 10-3-10-4 замен/участок/год, что находится в пределах типичного диапазона этих вирусов [15, 16, 18].
Оценка картины географического распространения свидетельствует о двух генетических кластерах - европейском и американо-азиатском [16], отличающихся друг от друга [18]. Считается, что предок BCoV появился в 1940-е гг. в США и что две географически разные линии разошлись в 1960-1970-е гг., при этом до сих пор не обнаружено генетического смешения [18].
Несмотря на то что коронавирусная инфекция крупного рогатого скота регистрируется в нашей стране с прошлого века [26], исследования по филогенетическому анализу изолятов вируса не проводились.
В связи с этим целью настоящей работы являлось изучение генетического полиморфизма изолятов ВСоУ, циркулирующих среди высокопродуктивного молочного скота в Сибири.
Материалы и методы
Исследования проводили в течение 5 лет на крупных молочных комплексах и молочно-товарных хозяйствах, расположенных в Тюменской, Омской, Томской, Новосибирской, Иркутской областях, Алтайском и Красноярском краях в период вспышек массовых желудочно-кишечных и респираторных болезней животных. На момент исследований вакцинация против данной инфекции не проводилась. Работу вели во время массовых эпизоотологических обследований на наличие возбудителей вирусно-бак-териальных инфекций крупного рогатого скота. Всего исследовали 1508 проб биоматериала, полученных до начала исследования от 116 вынужденно убитых и павших телят в возрасте от 10 дней до 6 месяцев.
От каждого животного отбирали пробы органов желудочно-кишечного и респираторного трактов (не менее 15), доставляли в лабораторию в замороженном состоянии или транспортной среде в течение не более 12 ч с момента отбора, где хранили при -80 °C. Перед исследованием их гомогенизировали и готовили 10% суспензии на физиологическом растворе, которые центрифугировали в течение 15 мин при 3000 об/мин. Для выделения РНК использовали по 100 мкл осветлённого супернатанта.
Авторы подтверждают соблюдение институциональных и национальных стандартов по использованию лабораторных животных в соответствии с CONSENSUS AUTHOR GUIDELINES FOR ANIMAL USE (IAVES 23 JULY 2010).
Экстракция РНК и обратная транскрипция
РНК выделяли из 100 мкл гомогенизата органов с помощью набора «РИБО-преп» (производства ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) в соответствии с рекомендациями производителя. Очищенную РНК ресуспендировали в 50 мкл РНК-буфера. Для проведения обратной транскрипции (ОТ) использовали 10 мкл выделенной РНК. Реакцию проводили с помощью набора «Реверта-L» (производства ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) в соответствии с рекомендациями производителя. После проведения реакции объём пробы составлял 40 мкл.
Выявление B^Vс помощью ПЦР
Для выявления РНК BCoV использовали праймеры и зонд 5-CTAGTAACCAGGCTGATGTCAATACC-3, 5-GGCGGAAACCTAGTCGGAATA-3, 5-(FAM)CG-GCTGACATTCTCGATC-(BHQ1)-3 [27]. Для контроля эффективности полимеразной цепной реакции (ПЦР) использовали праймеры и зонд на ген GAPDH крупного рогатого скота (5-GATGGTGAAGGTCGGAGT-GAAC-3,5-GTCATTGATGGCGACGATGT-3,5-(ROX)-CTGGTCACCAGGGCTGCTT-3(BHQ2)) [28]. ПЦР проводили в 30 мкл смеси, содержащей 5 мкл кДНК (комплементарная дезоксири-бонуклеиновая кислота), 10 пмоль каждого прай-мера и зонда, готовую смесь реактивов «БиоМастер ОТ-ПЦР-РВ» («Биолабмикс», Россия). Программа амплификации: 5 мин 95 °C, затем 45 циклов 95 °C 15 с и 60 °C 1 мин.
ПЦР-амплификация генов S и N
Фрагменты генов S и N амплифицировали в образцах BCoV-положительных проб. Для амплификации фрагмента гипервариабельного участка гена S размером 622 пары нуклеотидов (п.н.) использовали прай-меры S1 (CTTATAAGTGCCCCCAAACTAAAT) и S2 (CCTACTGTGAGATCACATGTTTG) [27]. Для амплификации фрагмента гена N размером 454 п.н. использовали праймеры BCoV1 (CGATGAGGCTATTC-CGAC и BCoV2 (TGTGGGTGCGAGTTCTGC) [29]. ПЦР проводили по программе для выявления BCoV. Продукты амплификации разделяли в агарозном ге-
ле и очищали с помощью набора Omega Biotek Gel Extraction Kit (Omega Bio-tek, Inc., США) в соответствии с инструкцией производителя.
Полученные нуклеотидные последовательности анализировали при помощи пакетов программ Lasergene 11.1.0 (DNASTAR, США). Выравнивание последовательностей проводили с использованием метода MUSCLE. Филогенетическая дендрограмма была построена с использованием метода максимального правдоподобия в программе MEGA 7.0. Топологию ветвей дендрограммы подтверждали методом бутстрэп-анали-за (1000 шагов репликации) [30]. Для построения деревьев использовали модель General Time Reversible (GTR), гамма-распределение вариации частот между сайтами (G + I).
Результаты
Всего за 5-летний период обследовали 69 молочных хозяйств из пяти областей и двух краёв Западной и Восточной Сибири. По результатам ОТ-ПЦР геном вируса был обнаружен в 246 (16,3%) пробах биоматериала от телят с диареями и в 149 (9,9%) пробах с респираторным синдромом, из которых первичные нуклеотидные последовательности удалось определить для 18. Данные суммированы в таблице.
Для 12 исследуемых изолятов были получены последовательности нуклеотидов участков генов S и N, ещё для 6 изолятов - только последовательности участка гена S. Нуклеотидная идентичность полученных последовательностей составила 96,1-100% по гену N и 91,9100% по гену S. Секвенированные последовательности были депонированы в базу данных GenBank под номерами OP651999-OP652028.
В результате анализа полученных последовательностей с использованием метода максимального правдоподобия (модель GTR) были построены филогенетические дендрограммы с низкой статистической поддержкой клад.
На основе филогенетического анализа участка последовательности гена гликопротеина S исследуемые изоляты и референтные штаммы разделились на две клады с двумя подкладами в каждой. В первую подкладу (1.1) первой клады входили 11 исследуемых изолятов (S16, S22, S24, S25, S26, S27, S29, S34, S35, S36 и S49), а также референтные штаммы из Европы и Израиля (европейская линия). Во вторую подкладу (1.2) входили классические штаммы вируса Квебек и Мёбус, а также штаммы из Европы, США и Южной Кореи. Исследованные изоляты к ней не относились. В первой подкладе второй клады (2.1) оказались 6 исследуемых изолятов (S3, S5, S7, S8, S13 и S20), а также штаммы из США, Китая и Южной Кореи (американо-азиатская линия). Ко второй подкладе (2.2) отнесли один исследуемый изолят (S46) и штаммы из Южной Кореи, Европы, США (смешанная линия). Данные представлены на рис. 1.
На основе филогенетического анализа участка последовательности гена нуклеокапсида N исследуемые изоляты и референтные штаммы разделились на две клады, одна из них включала две подклады. В первую
Таблица. Результаты выявления коронавируса методом ПЦР в режиме реального времени в пробах биоматериала от телят в регионе Сибири и секвенирования
Table. The results of detection of coronavirus by real-time PCR in samples from calves in the Siberian region and sequencing
Регион Region Исследовано проб/хозяйств, n Researched samples/farms, n Количество положительных проб, % Number of positive samples, % Номера секвенированных последовательностей в GenBank Numbers of obtained sequences deposited in GenBank
диарейный синдром diarrheal syndrome респираторный синдром respiratory syndrome ген S gene S ген N gene N
Тюменская область Tumen 280/12 2,8 1,9 OP652009, OP652020, 0P652022 0P652010, OP652021
Омская область Omsk 196/6 2,1 1,2 0P652007, OP652017 OP652008
Томская область Tomsk 97/6 1,1 1,4 OP652027 OP652028
Новосибирская область Novosibirsk 250/12 3,2 1,6 OP652004, 0P652023 OP652024
Алтайский край Altay 470/23 4,1 2,5 OP651999, OP652001, OP652003, OP652005, OP652006, OP652013, OP652015, 0P652018 OP652000, OP652002, OP652014 OP652016, OP652019
Красноярский край Krasnoyarsk Иркутская область Irkutsk 125/6 90/4 1,8 1,2 0,7 0,6 OP652025 OP652011 OP652026 OP652012
Всего Total 1508/69 16,3 9,9 18 12
подкладу (1.1) входили 3 исследуемых штамма (N3, N5 и N20), а также штаммы из Китая, Южной Кореи, Таиланда, США и Бразилии (американо-азиатская линия). Во вторую подкладу (1.2) входил один исследуемый изолят (N34), классические штаммы Квебек и Мёбус, а также штаммы из Германии, Южной Кореи, Китая и Индии (смешанная линия). Во второй кладе (2) оказались 8 исследуемых штаммов (N22, N 24, N25, N26, N29, N36, N46 и N49), а также штаммы из Китая, Европы, Ирана и Индии (смешанная линия). Данные представлены на рис. 2.
Различий в географическом распространении изо-лятов вируса не обнаружили. Изоляты, относящиеся к одной кладе, были распространены в различных регионах, не связанных между собой.
Обсуждение
Для определения и сравнения биологических, антигенных и генетических характеристик штаммов ВСо^ выделенных от крупного рогатого скота с респираторными и кишечными инфекциями, были проведены многочисленные исследования [31-38]. Филогенетические деревья, построенные на основе частичных последовательностей участков генов 5" и N показали, что происхождение образцов из дыхательной или пищеварительной систем не оказало существенного влияния на размещение в них.
Нами исследованы образцы из семи регионов Сибири, взятые у животных из хозяйств с интенсивным типом ведения животноводства. В часть из них осу-
ществлялся завоз высокопродуктивных животных из стран Европы и Северной Америки, но большая часть проб была получена от аборигенного скота. Различий между кишечными и респираторными изолята-ми, полученными из хозяйств с разным типом ведения скотоводства, а также зависимости от географического местоположения региона и страны происхождения животных также не установлено.
Результаты показали неодинаковое распределение нескольких изолятов вируса по кладам и подкладам. Так, изоляты S3, S5, S20 по гену 5 относились к подкладе 2.1, а по гену N - к подкладе 1.1. Изоляты S22, S24, S25, S26, S27, S29, S36 и S49 по гену 5 классифицировались как 1.1, а по гену N отнеслись к кладе 2. Изолят S34 по гену 5 относился к подкладе 1.1, а по гену N - к подкладе 1.2. Большая часть из них была выделена от аборигенного скота, а меньшая -от импортированного. Так, изолят S22, отнесённый нами к подкладе 1.1 по гену 5 и кладе 2 по гену N (европейские штаммы), был выделен от животных, завезённых из Германии и Канады и смешанных в одном хозяйстве. Изоляты S46 и S49, принадлежащие к подкладе 2.2 по гену 5 (европейские штаммы) и кладе 2 по гену N (смешанные штаммы), выделены от телят, завезённых из стран Европы.
Таким образом, исследованная популяция сибирских изолятов BCoV носит неоднородный характер, так как одни и те же изоляты были отнесены к различным кладам и подкладам. По гену 5 большая часть изолятов была отнесена к европейской линии, а меньшая - к аме-
ORIGINAL RESEARCH
EU814647.1_Bovine_coronavirus_strain_438/06-TN
• BCov_S_49
KF169938.1_Bovine_coronavirus_isolate_SWE/M/10-2
KM677165.1_Bovine_coronavirus_isolate_B32/11
KM677168.1_Bovine_coronavirus_isolate_B37/11
KM677174.1_Bovine_coronavirus_isolate_D71-73F
KM677175.1_Bovine_coronavirus_isolate_K12/10
KT318120.1_Bovine_coronavirus_isolate_BCoV/FRA/EPI/Caen/2013/10
-KY612617.1_Bovine_coronavirus_isolate_AT13
• BCov_S_16
KY612618.1_Bovine_coronavirus_isolate_AT15
KY612619.1_Bovine_coronavirus_isolate_SK21735
KY612620.1_Bovine_coronavirus_isolate_SKcrevo
MK989622.1_Bovine_coronavirus_clone_U1
MW771520.1_Bovine_coronavirus_isolate_2703
OL477639.1_Bovine_coronavirus_strain_PL/2014/Op1/I/BCoV
OL477643.1_Bovine_coronavirus_strain_PL/2014/Pod1/I/BCoV
OL477650.1_Bovine_coronavirus_strain_PL/2014/Wlkp2/I/BCoV
441—OL477652.1_Bovine_coronavirus_strain_PL/2014/Wlkp4/I/BCoV '-MK989624.1 Bovine coronavirus clone S8
• BCov
• BCov
• BCov
• BCov
• BCov
MK989623.1_Bovine_coronavirus_clone_T5
-MG757144.1 Bovine coronavirus isolate strain ICSA17-LBA
S_24 S_22 S_25 S_26 S_27
— OL477651.1_Bovine_coronavirus_strain_PL/2014/Wlkp3/I/BCoV MW771521.1_Bovine_coronavirus_isolate_1262 MG757143.1_Bovine_coronavirus_isolate_strain_ICSA4-EN
• BCov_S_36
• BCov_S_35
• BCov_S_34
• BCov_S_29
lU00735.2:23641-27732_Bovine_coronavirus_strain_Mebus
-OL477647.1_Bovine_coronavirus_strain_PL/2014/Wlkp1/II/BCoV
-AF181469.1 Bovine coronavirus
JQ741969.1_Bovine_coronavirus_isolate_Nebraska_(NVSL) EU401989.1_Bovine_coronavirus_strain_BC94 EU401988.1_Bovine_coronavirus_isolate_SUN5 EU401987.1_Bovine_coronavirus_isolate_A3 EF193075.1_Bovine_coronavirus_strain_V270 I AF220295.1:23655-27746_Bovine_coronavirus_strain_Quebec JQ741952.1_Bovine_coronavirus_isolate_OSU-665NS-09 • BCov_S_8
MK046009.1_Bovine_coronavirus_isolate_HT315 MK903506.1_Bovine_coronavirus_isolate_BCoV/CH/HB-BD/2019 MN982175.1_Bovine_coronavims_isolate_BC0V-China/SWUN/B2/2018 MW521176.1_Bovine_coronavirus_strain_HLJ/QQHR-2/2020 MW521183.1_Bovine_coronavirus_strain_HLJ/DQ-9/2020 MW711294.1_Bovine_coronavirus_strain_SWUN/XC-7/2020 MZ603735.1_Bovine_coronavirus isolate_BCoV-S/CN/HB-SJZ/2021
_7Я • BCov_S_5
_2d I • BCov_S_3
1 • BCov_S_13
-JQ741965.1_Bovine_coronavirus_isolate_OSU-554BAL-09
JX536392.1_Bovine_coronavirus_isolate_OSU-3166NS-09 JQ741957.1_Bovine_coronavirus_isolate_OSU-787NS-09 JQ741950.1_Bovine_coronavirus_isolate_OSU-43NS-08
• BCov_S_7
• BCov_S_20
-MK318151.1_Bovine_coronavirus_isolate_3897
OM632715.1_Bovine_coronavirus_strain_BRA/PR-323-425/2019
OM632714.1_Bovine_coronavirus_strain_BRA/PR-227-840/2018
■ NC_003045.1:23641-27732_Bovine_coronavirus_isolate_BCoV-ENT
MK318161.1_Bovine_coronavirus_isolate_2344
MK046010.1_Bovine_coronavirus_isolate_HT316
KP059127.1_Bovine_coronavirus_strain_Arg95TC
KP059126.1_Bovine_coronavirus_strain_B5324
KM98563L1_Bovine_coronavirus_strain_HLJ-14/CHN
KF272919.1_Bovine_coronavirus_isolate_RVLC7
KF169927.1_Bovine_coronavirusJsolate_SWE/I/07-3
KF169918.1_Bovine_coronavirusJsolate_DEN/05-3
KF169913.1_Bovine_coronavirus_isolate_DEN/03-1
JQ741967.1_Bovine_coronavirus_isolate_0SU-542BAL-09
JQ741949.1_Bovine_coronavirus_isolate_0SU-AN5-00
HE616740.1_Bovine_coronavirus_isolate_VB_24/11/CIEG0_DE_AVILA/2011
HE616739.1_Bovine_coronavirus_VB_16/10/CIENFUEG0S/2010
EU686689.1_Bovine_coronavirus_isolate_0501
EU401986.1_Bovine_coronavirus_isolate_0502
• BCov_S_46
AY935645.1_Bovine_coronavirus_isolate_KWD9 AY935637.1 Bovine coronavirus isolate KWD1
Рис. 1. Филогенетическая дендрограмма, построенная на основе участка последовательности гена гликопротеина S коронавируса крупного рогатого скота. Бутстрэп-поддержка указана около каждого узла дендрограммы. Штаммы, полученные в данной работе, отмечены чёрным кругом (•). Референтные штаммы отмечены чёрным квадратом (■). Штаммы из базы данных GenBank, присутствующие на рис. 1 и 2, отмечены белым треугольником (А). Для штаммов из базы данных GenBank указаны название и идентификационный номер. Номер клады указан справа от квадратной скобки.
Fig. 1. Phylogenetic dendrogram based on the bovine coronavirus glycoprotein S gene sequence region. Bootstrap support is indicated near each node of the dendrogram. The strains obtained in this work are marked with a black circle (•). Reference strains are marked with a black square (■). Strains from the GenBank database present in fig. 1 and 2 are marked with a white triangle (А). For strains from the GenBank database, the name and identification number are indicated. The clade numbers are indicated to the right of the square brackets.
44
65
2.1
50
2.2
MK757494.1 Bovine coronavirus strain BCoV-GX-NN190220 MN894884.1 Bovine coronavirus strain BCoV/CH/GS-1/2019 MK757493.1 Bovine coronavirus strain BCoV-GX-HC181120 MK757492.1 Bovine coronavirus strain BCoV-GX-NN190313 MK688458.1 Bovine coronavirus isolate QHHZ1 MK095172.1 Bovine coronavirus strain BC0V-China/SWUN/HN2/2018 MK095169.1 Bovine coronavirus strain BCOV-China/SWUN/LN4/2018 MK095166.1 Bovine coronavirus strain BCOV-China/SWUN/LN1/2018 MK095164.1 Bovine coronavirus strain BCOV-China/SWUN/ SX1/2018 MK095162.1 Bovine coronavirus strain BCOV-China/SWUN/SC2/2017 MH475915.1 Bovine coronavirus isolate QHGC1 EU401982.1 Bovine coronavirus isolate 0512 EU401980.1 Bovine coronavirus isolate 0501 ■ NC 003045.1:29393-30739 Bovine coronavirus isolate BCoV-ENT
_I-OM632709.1 Bovine coronavirus strain BRA/PR-227-840/2018
-A OM632711.1 Bovine coronavirus strain BRA/PR-323-425/2019
-• BCov N 20
_I • BCov N 3
^ • BCov N 5
-MK903505.1 Bovine coronavirus isolate BCoV/CH/HB-BD/2019
i-A KM985634.1 Bovine coronavirus strain HLJ-14/CHN
^ MF737175.1 Bovine coronavirus strain TWD4 -• BCov N 34
■ AF220295.1:29409-30755 Bovine coronavirus strain Quebec EF193073.1 Bovine coronavirus strain L9 A EF193074.1 Bovine coronavirus strain V270 EU401983.1 Bovine coronavirus isolate A3 EU401984.1 Bovine coronavirus isolate SUN5 EU401985.1 Bovine coronavirus strain BC94 -FJ556872.1 Bovine coronavirus strain YC
■ U00735.2:29397-30743 Bovine coronavirus strain Mebus OL960026.1 Bovine coronavirus isolate BNS55 OL990397.1 Bovine coronavirus isolate BFS-93 -• BCov N 46
MW074864.1 Bovine coronavirus isolate bcovizsm
KX266233.1 Bovine coronavirus strain BCoV-WT-2 KX266234.1 Bovine coronavirus strain BCoV-WT-3 KX073971.1 Bovine coronavirus strain BCoV-WT-1 KT247647.1 Bovine coronavirus isolate BCV-Aks-1 -KX073970.1 Bovine coronavirus strain BCoV-XN-1
-V BCov N 49
-KT318084.1 Bovine coronavirus isolate BCoV/FRA/EPI/Caen/2005/01
-KT318085.1 Bovine coronavirus isolate BCoV/FRA/EPI/Caen/2007/03
-MZ540976.1 Bovine coronavirus isolate Babol-Az2021
-® BCov N 36
• BCov N 22
• BCov N 24
• BCov N 25
• BCov N 26
• BCov N 29
A KF272911.1 Bovine coronavirus isolate RVLC7 KF272913.1 Bovine coronavirus isolate RVLC9 KF272915.1 Bovine coronavirus isolate RVLC10 KT318086.1 Bovine coronavirus isolate BCoV/FRA/EPI/Caen/2008/04 KT318087.1 Bovine coronavirus isolate BCoV/FRA/EPI/Caen/2003/05 KT318088.1 Bovine coronavirus isolate BCoV/FRA/EPI/Caen/2010/06 KT318089.1 Bovine coronavirus isolate BCoV/FRA/EPI/Caen/2012/07 KT318090.1 Bovine coronavirus isolate BCoV/FRA/EPI/Caen/2013/08 KT318095.1 Bovine coronavirus isolate BCoV/FRA/EPI/Caen/2014/13 KT318096.1 Bovine coronavirus isolate BCoV/FRA/EPI/Caen/2004/14 MK932861.1 Bovine coronavirus isolate Ranjbar-Alborz MZ857230.1 Bovine coronavirus isolate Vikas Jaiswal A KT318092.1 Bovine coronavirus isolate BCoV/FRA/EPI/Caen/2013/10
26
23
69
64
Рис. 2. Филогенетическая дендрограмма, построенная на основе участка последовательности гена нуклеокапсида N коронавируса крупного рогатого скота. Бутстрэп-поддержка указана около каждого узла дендрограммы. Штаммы, полученные в данной работе, отмечены чёрным кругом (•). Референтные штаммы отмечены чёрным квадратом (■). Штаммы из базы данных GenBank, присутствующие на рис. 1 и 2, отмечены, белым треугольником (А). Для штаммов из базы данных GenBank указаны название и идентификационный номер. Номер клады указан справа от квадратной скобки. Fig. 2. Phylogenetic dendrogram based on the bovine coronavirus nucleocapsid N gene sequence region. Bootstrap support is indicated near each node of the dendrogram. The strains obtained in this work are marked with a black circle (•). Reference strains are marked with a black square (■). Strains from the GenBank database present in fig. 1 and 2 are marked with a white triangle (А). For strains from the GenBank database, the name and identification number are indicated. The clade numbers are indicated to the right of the square brackets.
рикано-азиатской. Один изолят ^46) был отнесён нами к смешанному кластеру. По гену N практически все изо-ляты показали смешанный генетический профиль.
Наши данные в общем виде согласуются с результатами иранских исследователей, которые показали, что филогенетический анализ одних и тех же штаммов вирусов по разным генам 5" и N даёт разные формы деревьев. Анализ по гену 5 даёт 4 кластера, в которых просматривается географическая связь между изоля-тами в кластере. Анализ тех же штаммов по гену N не даёт соответствующей картины [31].
Кроме того, используемые в нашей работе референтные штаммы вирусов, присутствующие на обоих рисунках (отмечены белым треугольником А), также относятся к разным кластерам на разных деревьях. Так, штамм RVLC7 из Ирландии и штамм BRA/PR-323-425 из Бразилии относятся к одному подкластеру (2.2) по гену 5, а по гену N - к кластеру 2 и подкластеру 1.1 соответственно. Возможно, это может объясняться как разной скоростью накопления мутаций в разных генах бетакоронавирусов, так и потенциальным влиянием рекомбинационных событий между штаммами, следы которых находят в геномах BCoV [15, 16, 38]. Показано, например, что ген 5 SARS-Со^2 мутирует в 5 раз быстрее других кодирующих областей генома, находясь под давлением иммунной системы хозяина, тогда как ген N более стабилен [32].
Филогеографический анализ изолятов BCoV из разных стран мира показывает следующее. На территории Южной Кореи, Америки и Аргентины циркулируют изоляты, близкие к американской и европейской ветвям [35]. Бразильские изоляты вируса, циркулирующие среди мясных телят в пяти штатах, на основе анализа гена, кодирующего белок К, разделились на два отдельных кластера и были тесно связаны с азиатскими штаммами [37]. Уругвайские штаммы сгруппированы в две разные линии: одна с аргентинскими штаммами, а другая - с бразильскими. Предполагается, что обе линии BCoV проникли в Уругвай в 2013 г.: одна из них - из Бразилии (интервал максимальной плотности вероятности (HPD) 95%: 2011-2014 гг.), а другая - из Аргентины (интервал HPD 95%: 20102014 гг.). Линии отличались по четырём аминокислотным заменам, и обе - от эталонного штамма Мёбус.
Ирландские штаммы на основе данных секвениро-вания по гену 5 относятся к европейской группе вирусов [34].
Иранские изоляты и штаммы полностью находились в независимых кластерах и не принадлежали ни к одному из кластеров со штаммами, выделенными в других странах. При этом они сильно отличались от штаммов из других частей мира, но с точки зрения родства эти вирусы показали некоторое сходство с европейскими штаммами, например, обнаруженными во Франции, Хорватии, Дании и Швеции [31].
Турецкие штаммы вируса, выделенные от животных из нескольких отдалённых друг от друга ферм, были близки другим штаммам из Европы [36].
Анализ японских изолятов BCoV по последовательности участка гена 5 также показал наличие четырёх
генетических кластеров. Как и исследованные нами изоляты, полевые японские изоляты относились к трём генетическим кластерам; в кластере, включающем классические штаммы Мёбус и Квебек, полевых изолятов из России и Японии не было [33]. Часть изолятов также относилась к американским штаммам. Интересно, что вирусы из Японии также кластеризовались по годам выделения и хозяйствам, где они были выделены, но независимо от клинического проявления болезни.
В Китае характер проявления инфекции был связан с типом ведения животноводства, возрастом животных и плотностью размещения скота. Из 203 ВСо^ положительных образцов от больных телят 20 изоля-тов успешно секвенировали по гену 5. Все они имели гомологию нуклеотидов на уровне 97,7-100,0%, а их К-концевой домен субъединицы S1 генетически отличался от эталонных штаммов из Южной Кореи и Европы. Все штаммы отнесли к группе «Азия - Северная Америка». На основе китайских штаммов авторы сформировали три клады в филогенетическом дереве. Один штамм был отнесён к европейской группе. В то же время была зафиксирована рекомбинация между двумя разными штаммами, что привело к образованию реком-бинантного штамма ВСУ-А0-01. По мнению авторов, полученные данные обеспечивают лучшее понимание эпидемиологии и эволюции BCoV в Китае [38].
Практически все авторы отмечали наличие корреляции выделения вирусов с географической локацией, но не с формой болезни. Мы не выявили различий в географическом распределении изолятов. Изоляты, относящиеся к одной кладе, были распространены в различных областях и краях Сибири, не связанных между собой. Респираторные изоляты чаще выявляли на крупных молочных комплексах по производству молока как с наличием, так и отсутствием завезённых животных, а кишечные - в мелких и средних хозяйствах с наличием аборигенных животных.
В нашем исследовании происхождение изолятов установить было невозможно, однако два из них - S22 (подклада 1.1) и S46 (подклада 2.2) - имели явное европейское происхождение и были связаны с завозом животных из нескольких стран Европы (Германия, Словения), которые не имели контакта с местным скотом. Интерес представляет изолят S46, который вызвал тяжёлую вспышку респираторной болезни у телят 2-5-месячного возраста на молочном комплексе в сочетании с вирусной диареей (Pestivirus А) (данные не представлены). Наши результаты показывают, что сибирские изоляты ближе к иранским и китайским вариантам. Эпизоотическая ситуация наиболее близка к наблюдаемой в Китае.
Заключение
Результаты исследований показали широкое распространение и молекулярно-генетическое разнообразие коронавируса крупного рогатого скота на молочных комплексах Сибири. Популяция сибирских изолятов вируса неоднородна, носит смешанный характер и представлена двумя кладами с двумя подкладами в каждой по гену 5" и двумя кладами по гену N.
Подтверждена идентичность изолятов вируса, вызывающих кишечную и респираторную форму инфекции в регионе. Полученные данные показывают, что сравнительный анализ нуклеотидной последовательности является полезным инструментом для изучения молекулярной эпизоотологии инфекций, вызванных коронавирусом крупного рогатого скота (BCoV). Исследования по молекулярной эпизоотологии BCoV в конкретном регионе можно использовать с целью оптимизации и выбора стратегии контрольных мероприятий на региональном уровне и решения вопроса о применении вакцин. Это особенно важно при реализации программ вакцинации животных, когда генетические типы вакцинных штаммов не совпадают с типами, циркулирующими среди животных на конкретной территории. Полученная в ходе таких исследований информация может быть полезной при изучении молекулярной эпизоотологии вирусов, разработке более точных диагностических тестов, эффективных вакцин и программ контроля инфекции.
ЛИТЕРАТУРА
1. International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV). New MSL including all taxonomy; updates since the 2018b release. Berlin; 2019. Available at: https://ictv.global
2. Suzuki T., Otake Y., Uchimoto S., Hasebe A., Goto Y. Genomic characterization and phylogenetic classification of bovine coronaviruses through whole genome sequence analysis. Viruses. 2020; 12(2): 183. https://doi.org/10.3390/v12020183
3. Masters P.S. The molecular biology of coronaviruses. Adv. Virus Res. 2006; 66: 193-292. https://doi.org/10.1016/S0065-3527(06)66005-3
4. Saif L.J. Bovine respiratory coronavirus. Vet. Clin. North Am. Food Anim. Pract. 2010; 26(2): 349-64. https://doi.org/10.1016/j.cv-fa.2010.04.005
5. Vlasova A.N., Saif L.J. Bovine coronavirus and the associated diseases. Front. Vet. Sci. 2021; 8: 643220. https://doi.org/10.3389/ fvets.2021.643220
6. Liu L., Hagglund S., Hakhverdyan M., Alenius S., Larsen L.F., Belak S. Molecular epidemiology of bovine coronavirus on the basis of comparative analyses of the S gene. J. Clin. Microbiol. 2006; 44(3): 957-60. https://doi.org/10.1128/JCM.443.957-960.2006
7. Zhu Q., Li B., Sun D. Advances in bovine coronavirus epidemiology. Viruses. 2022; 14(5): 1109. https://doi.org/10.3390/v14051109
8. Мищенко В.А., Думова В.В., Черных О.Ю., Киселев М.Ю., Мищенко А.В., Бакунов И.Н. и др. Распространение коронавируса крупного рогатого скота у жвачных животных. Ветеринария. 2010; (9): 18-21.
9. Алипер Т.И. Актуальные инфекционные болезни крупного рогатого скота: Руководство. М.; 2021. https://doi.org/10.31016/ viev-2021-6
10. Орлянкин Б.Г., Власова А.Н., Мухин А.Н., Алипер Т.И. Коро-навирусные инфекции животных: эпизоотология и патогенез. Ветеринария. 2022; (3): 3-13. https://doi.org/10.30896/0042-4846.2022.25.3.03-13
11. Saif L.J. Bovine respiratory coronavirus. Vet. Clin. North Am. Food Anim. Pract. 2010; 26(2): 349-64. https://doi.org/10.1016/j.cv-fa.2010.04.005
12. Беспалова Т.Ю., Блохин А.А. Коронавирусы животных (обзор). Ветеринария. 2020; (9): 3-10. https://doi.org/10.30896/0042-4846.2020.23.9.03-10
13. Глотов А.Г., Глотова Т.И. Коронавирусы жвачных животных. Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. 2020; (3): 49-61. https://doi.org/10.26898/0370-8799-2020-3-5
14. Liu X., Wu Q., Zhang Z. Global diversification and distribution of coronaviruses with furin cleavage sites. Front. Microbiol. 2021; 12: 649314. https://doi.org/10.3389/fmicb.2021.649314
15. Islam A., Ferdous J., Islam S., Sayeed M.A., Dutta Choudhury S., Saha O., et al. Evolutionary dynamics and epidemiology of endemic and emerging coronaviruses in humans, domestic animals, and wildlife. Viruses. 2021; 13(10): 1908. https://doi.org/10.3390/v13101908
16. Franzo G., Drigo M., Legnardi M., Grassi L., Pasotto D., Menan-dro M.L., et al. Bovine coronavirus: variability, evolution, and dispersal patterns of a no longer neglected betacoronavirus. Viruses. 2020; 12(11): 1285. https://doi.org/10.3390/v12111285
17. Burimuah V., Sylverken A., Owusu M., El-Duah P., Yeboah R., Lamptey J., et al. Molecular-based cross-species evaluation of bovine coronavirus infection in cattle, sheep and goats in Ghana. BMC Vet. Res. 2020; 16(1): 405. https://doi.org/10.1186/s12917-020-02606-x
18. Salem E., Dhanasekaran V., Cassard H., Hause B., Maman S., Meyer G., et al. Global transmission, spatial segregation, and recombination determine the long-term evolution and epidemiology of bovine coronaviruses. Viruses. 2020; 12(5): 534. https://doi.org/10.3390/ v12050534
19. Нефедченко А.В., Котенева С.В., Глотова Т.И., Глотов А.Г. Роль коронавируса в этиологии желудочно-кишечной и респираторной патологии телят на молочных комплексах. Ветеринария. 2022; (1): 18-23. https://doi.org/10.30896/0042-4846.2022.25.L18-23
20. Dall Agnol A.M., Lorenzetti E., Leme R.A., Ladeia W.A., Mainar-di R.M., Bernardi A., et al. Severe outbreak of bovine neonatal diarrhea in a dairy calf rearing unit with multifactorial etiology. Braz. J. Microbiol. 2021; 52(4): 2547-53. https://doi.org/10.1007/s42770-021-00565-5
21. Rahe M.C., Magstadt D.R., Groeltz-Thrush J., Gauger P.C., Zhang J., Schwartz K.J., et al. Bovine coronavirus in the lower respiratory tract of cattle with respiratory disease. J. Vet. Diagn. Invest. 2022; 34(3): 482-8. https://doi.org/ 10.1177/10406387221078583
22. Soules K.R., Rahe M.C., Purtle L., Moeckly C., Stark P., Samson C., et al. Bovine coronavirus infects the respiratory tract of cattle challenged intranasally. Front. Vet. Sci. 2022; (9): 878240. https://doi. org/10.3389/fvets.2022.878240
23. Blakebrough-Hall C., Hick P., Mahony T.J., González L.A. Factors associated with bovine respiratory disease case fatality in feedlot cattle. J. Anim. Sci. 2022; 100(1): skab361. https://doi.org/10.1093/jas/ skab361
24. Deepak Aly S.S., Love W.J., Blanchard P.C., Crossley B., Van Eenen-naam A.L., Lehenbauer T.W. Etiology and risk factors for bovine respiratory disease in pre-weaned calves on California dairies and calf ranches. Prev. Vet. Med. 2021; 197: 105506. https://doi.org/10.1016/). prevetmed.2021.105506
25. Львов Д.К., Альховский С.В., Колобухина Л.В., Бурцева Е.И. Этиология эпидемической вспышки COVID-19 в г. Ухань (провинция Хубэй, Китайская Народная Республика), ассоциированной с вирусом 2019-nCoV (Nidovirales, Coronaviridae, Corona-virinae, Betacoronavirus, подрод Sarbecovirus): уроки эпидемии SARS-CoV. Вопросы вирусологии. 2020; 65(1): 6-15. https://doi. org/10.36233/0507-4088-2020-65-1-6-15
26. Коромыслов Г.Ф., Авилов В.С., Гоголев М.М. Ротавирусная и коронавирусная инфекция телят. Вестник сельскохозяйственной науки. 1984; (7): 129-36.
27. Decaro N., Elia G., Campolo M., Desario С., Mari V., Radogna A., et al. Detection of bovine coronavirus using a TaqMan-based real-time RT-PCR assay. J. Virol. Methods. 2008; 151(2): 167-71. https://doi. org/10.1016/j.jviromet.2008.05.01
28. Zhao H., Liu J., Li Y., Yang C., Zhao S., Liu J., et al. Validation of reference genes for quantitative real-time PCR in Bovine PBMCs transformed and non-transformed by Theileria annulata. Korean J. Parasi-tol. 2016; 54(1): 39-46. https://doi.org/10.3347/kjp.2016.54.1.39
29. Takiuchi E., Stipp D.T., Alfieri A.F., Alfieri A.A. Improved detection of bovine coronavirus N gene in faeces of calves infected naturally by a semi-nested PCR assay and an internal control. J. Virol. Methods. 2006; 131(2): 148-54. https://doi.org/10.1016/jjviromet.2005.08.005
30. Kumar S., Stecher G., Tamura K. MEGA7: Molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets. Mol. Biol. Evol. 2016; 7(33): 1870-74. https://doi.org/10.1093/molbev/msw0544
31. Lotfollahzadeh S., Madadgar O., Reza Mohebbi M., Reza Mokh-ber Dezfouli M., George W.D. Bovine coronavirus in neonatal calf diarrhoea in Iran. Vet. Med. Sci. 2020; 6(4): 686-94. https://doi. org/10.1002/vms3.277
32. Kanno T., Hatama S., Ishihara R., Uchida I. Molecular analysis of the S glycoprotein gene of bovine coronaviruses isolated in Japan from 1999 to 2006. J. Gen. Virol. 2007; 88(Pt. 4): 1218-24. https://doi. org/10.1099/vir.0.82635-0
33. Amicone M., Borges V., Alves M.J., Isidro J., Zé-Zé L., Duarte S., et al. Mutation rate of SARS-CoV-2 and emergence of mutators during experimental evolution. Evol. Med. Public Health. 2022; 10(1): 14255. https://doi.org/10.1093/emph/eoac010
34. Gunn L., Collins P.J. O'Connell M.J., O'Shea H. Phylogenetic investigation of enteric bovine coronavirus in Ireland reveals partitioning between European and global strains. Irish Vet. J. 2015; 68: 31. https:// doi.org/10.1186/s13620-015-0060-33
35. Bok M., Miño S., Rodriguez D., Badaracco A., Nuñes I., Souza S.P., et al. Molecular and antigenic characterization of bovine Coronavirus circulating in Argentinean cattle during 1994-2010. Vet. Microbiol. 2015; 181(3-4): 221-9._https://doi.org/10.1016/j.vetmic.2015.10.017
36. De Mira Fernandes A., Brandäo P.E., Dos Santos Lima M., de Souza Nunes Martins M., da Silva T.G., da Silva Cardoso Pinto V., et al. Ge-
ORIGINAL RESEARCH
netic diversity of BCoV in Brazilian cattle herds. Vet. Med. Sci. 2018; 4(3): 183-9. https://doi.org/10.1002/vms3.102
37. Zhu Q., Su M., Li Z., Wang X., Qi S., Zhao F., et al. Epidemiological survey and genetic diversity of bovine coronavirus in Northeast China. Virus Res. 2022; 308: 198632. https://doi.org/10.1016/j.virus-res.2021.198632
38. Castells M., Giannitti F., Caffarena R.D., Casaux M.L., Schild C., Castells D., et al. Bovine coronavirus in Uruguay: genetic diversity, risk factors and transboundary introductions from neighboring countries. Arch. Virol. 2019; 164(11): 2715-24. https://doi.org/10.1007/s00705-019-04384-w
REFERENCES
1. International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV). New MSL including all taxonomy; updates since the 2018b release. Berlin; 2019. Available at: https://ictv.global
2. Suzuki T., Otake Y., Uchimoto S., Hasebe A., Goto Y. Genomic characterization and phylogenetic classification of bovine coronaviruses through whole genome sequence analysis. Viruses. 2020; 12(2): 183. https://doi.org/10.3390/v12020183
3. Masters P.S. The molecular biology of coronaviruses. Adv. Virus Res. 2006; 66: 193-292. https://doi.org/10.1016/S0065-3527(06)66005-3
4. Saif L.J. Bovine respiratory coronavirus. Vet. Clin. North Am. Food Anim. Pract. 2010; 26(2): 349-64. https://doi.org/10.1016/j.cv-fa.2010.04.005
5. Vlasova A.N., Saif L.J. Bovine coronavirus and the associated diseases. Front. Vet. Sci. 2021; 8: 643220. https://doi.org/10.3389/ fvets.2021.643220
6. Liu L., Hagglund S., Hakhverdyan M., Alenius S., Larsen L.F., Be-lak S. Molecular epidemiology of bovine coronavirus on the basis of comparative analyses of the S gene. J. Clin. Microbiol. 2006; 44(3): 957-60. https://doi.org/10.1128/JCM.443.957-960.2006
7. Zhu Q., Li B., Sun D. Advances in bovine coronavirus epidemiology. Viruses. 2022; 14(5): 1109. https://doi.org/10.3390/v14051109
8. Mishchenko V.A., Dumova V.V., Chernykh O.Yu., Kiselev M.Yu., Mishchenko A.V., Bakunov I.N., et al. Bovine coronavirus distribution in ruminants. Veterinariya. 2010; (9): 18-21. (in Russian)
9. Aliper T.I. Actual Infectious Diseases of Cattle: Guideline [Aktual'nye infektsionnye bolezni krupnogo rogatogo skota: Rukovodstvo]. Moscow; 2021. https://doi.org/10.31016/viev-2021-6 (in Russian)
10. Orlyankin B.G., Vlasova A.N., Mukhin A.N., Aliper T.I. Coronavirus infections in animals: epizootology and pathogenesis. Veterinariya. 2022; (3): 3-13. https://doi.org/10.30896/0042-4846.2022.253.03-13 (in Russian)
11. Faustino R., Faria M., Teixeira M., Palavra F., Sargento P., do Ceu Costa M. Systematic review and meta-analysis of the prevalence of coronavirus: One health approach for a global strategy. One Health. 2022; 14: 100383. https://doi.org/ 10.1016/j.onehlt.2022.100383
12. Bespalova T.Yu., Blokhin A.A. Coronaviruses of animals (review). Veterinariya. 2020; (9): 3-10. https://doi.org/10.30896/0042-4846.2020.23.9.03-10 (in Russian)
13. Glotov A.G., Glotova T.I. Coronaviruses in ruminants. Sibirskiy vestnik sel'skokhozyaystvennoy nauki. 2020; (3): 49-61. https://doi. org/10.26898/0370-8799-2020-3-5 (in Russian)
14. Liu X., Wu Q., Zhang Z. Global diversification and distribution of coronaviruses with furin cleavage sites. Front. Microbiol. 2021; 12: 649314. https://doi.org/10.3389/fmicb.2021.649314
15. Islam A., Ferdous J., Islam S., Sayeed M.A., Dutta Choudhury S., Sa-ha O., et al. Evolutionary dynamics and epidemiology of endemic and emerging coronaviruses in humans, domestic animals, and wildlife. Viruses. 2021; 13(10): 1908. https://doi.org/10.3390/v13101908
16. Franzo G., Drigo M., Legnardi M., Grassi L., Pasotto D., Menan-dro M.L., et al. Bovine coronavirus: variability, evolution, and dispersal patterns of a no longer neglected betacoronavirus. Viruses. 2020; 12(11): 1285. https://doi.org/10.3390/v12111285
17. Burimuah V., Sylverken A., Owusu M., El-Duah P., Yeboah R., Lamptey J., et al. Molecular-based cross-species evaluation of bovine coronavirus infection in cattle, sheep and goats in Ghana. BMC Vet. Res. 2020; 16(1): 405. https://doi.org/10.1186/s12917-020-02606-x
18. Salem E., Dhanasekaran V., Cassard H., Hause B., Maman S., Meyer G., et al. Global transmission, spatial segregation, and recombination determine the long-term evolution and epidemiology of bovine coronaviruses. Viruses. 2020; 12(5): 534. https://doi.org/10.3390/ v12050534
19. Nefedchenko A.V., Koteneva S.V., Glotova T.I., Glotov A.G. The role of bovine coronavirus in the etiology of gastrointestinal and respiratory diseases of calves in big dairy farms. Veterinariya. 2022; (1): 18-23. https:// doi.org/10.30896/0042-4846.2022.25.1.18-23 (in Russian)
20. Dall Agnol A.M., Lorenzetti E., Leme R.A., Ladeia W.A., Mainardi R.M., Bernardi A., et al. Severe outbreak of bovine neonatal diarrhea in a dairy calf rearing unit with multifactorial etiology. Braz. J. Microbiol. 2021; 52(4): 2547-53. https://doi.org/10.1007/s42770-021-00565-5
21. Rahe M.C., Magstadt D.R., Groeltz-Thrush J., Gauger P.C., Zhang J., Schwartz K.J., et al. Bovine coronavirus in the lower respiratory tract of cattle with respiratory disease. J. Vet. Diagn. Invest. 2022; 34(3): 482-8. https://doi.org/ 10.1177/10406387221078583
22. Soules K.R., Rahe M.C., Purtle L., Moeckly C., Stark P., Samson C., et al. Bovine coronavirus infects the respiratory tract of cattle challenged intranasally. Front. Vet. Sci. 2022; (9): 878240. https://doi. org/10.3389/fvets.2022.878240
23. Blakebrough-Hall C., Hick P., Mahony T.J., González L.A. Factors associated with bovine respiratory disease case fatality in feedlot cattle. J. Anim. Sci. 2022; 100(1): skab361. https://doi.org/10.1093/jas/ skab361
24. Deepak Aly S.S., Love W.J., Blanchard P.C., Crossley B., Van Eenen-naam A.L., Lehenbauer T.W. Etiology and risk factors for bovine respiratory disease in pre-weaned calves on California dairies and calf ranches. Prev. Vet. Med. 2021; 197: 105506. https://doi.org/10.1016/). prevetmed.2021.105506
25. L'vov D.K., Al'khovskiy S.V., Kolobukhina L.V., Burtseva E.I. Etiology of epidemic outbreaks covid-19 in Wuhan, Hubei province, Chinese people republic associated with 2019-nCoV (Nidovirales, Coronaviri-dae, Coronavirinae, Betacoronavirus, subgenus Sarbecovirus): lessons of SARS-COV outbreak. Voprosy virusologii. 2020; 65(1): 6-15. https://doi. org/10.36233/0507-4088-2020-65-1-6-15 (in Russian)
26. Koromyslov G.F., Avilov VS., Gogolev M.M. Rotavirus and coronavirus infection of calves. Vestnik sel'skokhozyaystvennoy nauki. 1984; (7): 129-36. (in Russian)
27. Decaro N., Elia G., Campolo M., Desario С., Mari V., Radogna A., et al. Detection of bovine coronavirus using a TaqMan-based real-time RT-PCR assay. J. Virol. Methods. 2008; 151(2): 167-71. https://doi. org/10.1016/j.jviromet.2008.05.01
28. Zhao H., Liu J., Li Y., Yang C., Zhao S., Liu J., et al. Validation of reference genes for quantitative real-time PCR in Bovine PBMCs transformed and non-transformed by Theileria annulata. Korean J. Parasi-tol. 2016; 54(1): 39-46. https://doi.org/10.3347/kjp.2016.54.139
29. Takiuchi E., Stipp D.T., Alfieri A.F., Alfieri A.A. Improved detection of bovine coronavirus N gene in faeces of calves infected naturally by a semi-nested PCR assay and an internal control. J. Virol. Methods. 2006; 131(2): 148-54. https://doi.org/10.1016/jjviromet.2005.08.005
30. Kumar S., Stecher G., Tamura K. MEGA7: Molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets. Mol. Biol. Evol. 2016; 7(33): 1870-74. https://doi.org/10.1093/molbev/msw0544
31. Lotfollahzadeh S., Madadgar O., Reza Mohebbi M., Reza Mokh-ber Dezfouli M., George W.D. Bovine coronavirus in neonatal calf diarrhoea in Iran. Vet. Med. Sci. 2020; 6(4): 686-94. https://doi. org/10.1002/vms3.277
32. Kanno T., Hatama S., Ishihara R., Uchida I. Molecular analysis of the S glycoprotein gene of bovine coronaviruses isolated in Japan from 1999 to 2006. J. Gen. Virol. 2007; 88(Pt. 4): 1218-24. https://doi. org/10.1099/vir.0.82635-0
33. Amicone M., Borges V., Alves M.J., Isidro J., Zé-Zé L., Duarte S., et al. Mutation rate of SARS-CoV-2 and emergence of mutators during experimental evolution. Evol. Med. Public Health. 2022; 10(1): 14255. https://doi.org/10.1093/emph/eoac010
34. Gunn L., Collins P.J. O'Connell M.J., O'Shea H. Phylogenetic investigation of enteric bovine coronavirus in Ireland reveals partitioning between European and global strains. Irish Vet. J. 2015; 68: 31. https:// doi.org/10.1186/s13620-015-0060-33
35. Bok M., Miño S., Rodriguez D., Badaracco A., Nuñes I., Souza S.P., et al. Molecular and antigenic characterization of bovine Coronavirus circulating in Argentinean cattle during 1994-2010. Vet. Microbiol. 2015; 181(3-4): 221-9. https://doi.org/10.1016/j.vetmic.2015.10.017
36. De Mira Fernandes A., Brandäo P.E., Dos Santos Lima M., de Souza Nunes Martins M., da Silva T.G., da Silva Cardoso Pinto V., et al. Genetic diversity of BCoV in Brazilian cattle herds. Vet. Med. Sci. 2018; 4(3): 183-9. https://doi.org/10.1002/vms3.102
37. Zhu Q., Su M., Li Z., Wang X., Qi S., Zhao F., et al. Epidemiolog-ical survey and genetic diversity of bovine coronavirus in Northeast China. Virus Res. 2022; 308: 198632. https://doi.org/10.1016/j.virus-res.2021.198632
38. Castells M., Giannitti F., Caffarena R.D., Casaux M.L., Schild C., Castells D., et al. Bovine coronavirus in Uruguay: genetic diversity, risk factors and transboundary introductions from neighboring countries. Arch. Virol. 2019; 164(11): 2715-24. https://doi.org/10.1007/ s00705-019-04384-w
