CC BY
22
DOI 10.31588/2413 -4201 -1883-248-4-42-47
УДК 619:616.9:616.24
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ИЗОЛЯТОВ ВИРУСА
ПАРАГРИППА-3
Галиуллин А.К.1 - д.вет.н., профессор, Гериш Ашуак1 - аспирант, Гумеров В.Г.2 - д.вет.н., вед. научный сотрудник, Шаева А.Ю1 - к.б.н., ст. преподаватель,
Магдеева Э.А.1 - к.вет.н., ассистент
1ФГБОУ ВО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины
имени Н.Э. Баумана» 2ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности - ФЦТРБ-ВНИВИ), г. Казань, Научный городок-2
Ключевые слова: парагрипп-3, вирус парагриппа-3, крупный рогатый скот, генотип, филогенетический анализ
Keywords: parainfluenza-3, bovine parainfluenza virus type 3 (BPIV-3), cattle, genotype, phylogenetic analysis
Респираторные заболевания
являются важной проблемой в молочном скотоводстве, которая в основном затрагивает молодое поголовье. Болезни органов дыхания крупного рогатого скота носят многофакторный и
многоэтиологический характер, в котором, наряду с вирусами и бактериями, задействованы факторы риска, связанные с окружающей средой.
Вирус парагриппа-3 крупного рогатого скота является одним из основных возбудителей респираторных болезней, особенно у молодняка [1, 3, 9]. Это РНК-содержащий вирус, относящийся к роду Paramyxoviridae и поражающий центральную нервную и дыхательную системы, способствующий повреждению тканей у телят [2, 6]. Течение парагриппа-3 также может осложняться вторичной бактериальной инфекцией и приводить к тяжелой бронхопневмонии.
На основе филогенетического и генетического анализа зарубежными исследователями было выявлено три генотипа вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота: А (ВРГУ3а), В (ВРГУ3Ь) и С (BPIV3c) [12]. Генотип А был впервые был выделен в США, а также был обнаружен в Японии, Китае, Аргентине и Египте [5, 10]. До 2012 года генотип В, был зарегистрирован только в Австралии, согласно Maidana и др., в 2012 году генотип
В был также выделен в Аргентине [7]. Генотип С был обнаружен в Южной Корее, Китае, Японии, Турции и Аргентине [4, 8, 10, 11]. Несмотря на то, что вирус был выделен в России еще в 1968 году, информация о генотипическом
разнообразии этого инфекционного агента, циркулирующего на территории РФ, в частности, в Республике Татарстан отсутствует.
Целью данного исследования было выявление и молекулярная характеристика штамма парагриппа крупного рогатого скота типа 3 (ВРГУ-З), полученного из образцов легких и мазков из носа крупного рогатого скота в Лаишевском районе Республики Татарстан, а также вакцинного штамма ПТК 45/86.
Материал и методы исследований. В работе использовали следующие штаммы: 1. SF-4 - референтный штамм вируса ПГ-3, инфекционная активность на перевиваемой линии культуры клеток легкого эмбриона коровы (ЛЭК) - 7,25 ^ ТЦД 50/мл, гемагглютинирующий титр 1:32 в РГА с 1 % эритроцитами морской свинки. Этот штамм был использован для контроля; 2. ПТК-45/86 - вакцинный штамм вируса ПГ-3, инфекционная активность на перевиваемой линии культуры клеток ЛЭК - 6,75 ^ ТЦД 50/мл, гемагглютинирующий титр 1:16 в РГА с 1 % эритроцитами морской свинки (ЭМС).
Данный штамм был использован в исследовании в качестве контроля и для сравнения с референтным штаммом; 3. ЛД-9 - вирусный изолят, выделен из патологического материала от больного респираторным заболеванием теленка из Лаишевского района РТ (на основании изучения физико-химических и
биологических свойств идентифицирован как вирус ПГ-3), инфекционная активность на перевиваемой линии культуры клеток ЛЭК - 6,25 1§ ТЦД 50/мл.
Выделение нуклеиновой кислоты (РНК) вируса проводили из образцов тканей (носовая слизь, легочная ткань и лимфатические узлы) с использованием коммерческого набора РИБО-преп (Атрием, Россия), согласно инструкции
производителя. Все выделенные пробы перед тестированием хранили при температуре минус 20 ° С.
Вирусная РНК подвергалась обратной транскрипции с помощью комплекта КЕ'УЕЯТА-Ь (АшрНБепв, Россия) в соответствии с инструкцией изготовителя. Образцы ДНК изолята ЛД-9, вакцинного штамма ПТК-45/86 и референтного штамма 8Б-4 были исследованы методом ПЦР со специфическими праймерами,
кодирующими фрагмент матричного гена (М гена) вируса. В таблице 1 указаны область и размеры ампликона. Амплификацию проводили в
твердотельном амплификаторе фирмы «Терцик» ДНК-технология (Россия).
Таблица 1 - Область и разме
ры ампликона
Вирус Ген Праймер Нуклеотидные последовательности праймеров Размер продукта
ВПГ-3 М-ген Mi AGTGATCTAGATGATGATCCA 328 п.н.
M2 GTTATTGATCCAATTGCTGT
Таблица 2 - Нуклеотидные последовательности штаммов вируса ПГ-3 крупного рогатого скота из ОепБаик, использованные для филогенетического анализа_
Вирус Номер в GenBank Страна Генотип Длина генома
SF-4 AF178655 USA a 15456
NM09 JQ063064 China a 15456
JCU EF108221 Australia a 697
BN-1 AB770484 Japan a 15480
ISU EU439428 USA a 15480
Texas EU439429 USA a 15456
910N D84095 JAPAN a 15480
Kansas AF178654 USA a 15454
LE017 MG976794 Uruguay a 274
BP4158 EF108222 Australia b 697
TVMDL15 KJ647284 USA b 15474
SD0835 HQ530153 China c 15498
NX49 KT071671 China c 15474
TVMDL20 KJ647287 USA c 15474
HS9 LD000638 Japan c 15474
12Q061 JX969001 Korea c 15474
GP AB012132 Japan / 15462
По 10 мкл полученных продуктов ПЦР были внесены в лунки 1,5 % агарозного геля, электрофорез проходил при 200 В в течение 40 мин. Детекцию
результатов проводили на
трансиллюминаторе с длиной волны 312 нм.
Продукты амплификации
подвергались секвенированию.
Секвенирование проводили в
Междисциплинарном центре протеомных исследований Казанского федерального университета (КФУ) методом Сэнгера на секвенаторе NextSeq 500 (Illumina) с использованием тех же самых праймеров ПЦР и режима амплификации.
Результаты секвенирования были проанализированы с помощью программ UGENE и MegAlign Pro. Частичные геномные последовательности полевого изолята ЛД-9, вакцинного штамма ПТК-45/86 и референтного штамма SF-4 были выравнены с последовательностями штаммов вируса парагриппа-3,
полученными из базы данных GenBank с использованием программы ClustalW системы MegAlign Pro (DNASTAR) (Таблица 2). Построение
филогенетического древа также осуществлялось с применением системы MegAlign Pro.
Результат исследований. В результате полимеразной цепной реакции из всех трех образцов были получены специфичные продукты амплификации размером 328 п.н.
Специфический фрагмент
матричного гена (М-гена) был визуализирован с помощью электрофореза в 1,5 % агарозном геле (Рисунок 1).
Рисунок 1 - Электрофорез продуктов амплификации: М - маркер молекулярных масс; 1, 2, 3 - положительные результаты амплификации фрагмента М гена штаммов SF-4, ПТК-45/86 и ЛД-9 вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота
В результате множественного выравнивания 17 нуклеотидных последовательностей, депонированных в GenBank, с последовательностями, полученными нами, российский изолят ЛД-9 показал 98,3 % идентичность с референтным штаммом SF-4, относящимся к генотипу А, тогда как российский вакцинный штамм ПТК 45/86 был на 100 % идентичен референтному штамму SF-4 (Таблица 3). Нуклеотидная
последовательность фрагмента М-гена изолята ЛД-9 вируса ПГ-3 была размещена в базе данных GenBank под регистрационным номером MW524841.
Результаты филогенетического анализа показали, что российский изолят ЛД-9 (MW52481) и вакцинный штамм ПТК45/86 относятся к генотипу А вируса парагриппа-3, как и референтный штамм SF-4 (Рисунок 2).
Таблица 3 - Сравнительный анализ идентичности в нуклеотидных последовательностях области М гена (328 п.н.) изолята ЛД-9, вакцинного штамма ПТК45/86 и 17 штаммов вируса ПГ-3 крупного рогатого скота_
Штаммы Идентичность, %
SF-4 ПТК45/86 ЛД-9
ПТК45/86 100 / 98,25
ЛД-9 98,3 98,25 /
SF-4 / 100 98,3
NM09 94,3 94,3 92,98
JCU 92,5 92,5 90,8
BN-1 93,42 93,42 91,67
ISU* 91,67 91,67 89,91
910N 93,42 93,42 91,67
^nsas* 99,12 99,12 97,35
BP4158 87,28 87,28 85,53
Texas 100 100 98,25
TVMDL15 86,84 86,84 85,09
SD0835 87,72 87,72 86,4
NX49 87,72 87,72 84,4
TVMDL20 87,28 87,28 85,96
HS9 88,16 88,16 86,84
12Q061 87,28 87,28 85,96
LE017 99,12 99,12 97,37
GP** 81,58 81,58 81,4
Примечание: *swine parainfluenza virus type 3 (SPIV-3), **Human parainfluenza type 3 (HPIV-3)
Рисунок 2 - Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей изолятов вируса ПГ-3 на основе фрагмента М гена
Заключение. Матричный белок сборке вирионов, установлении
вируса парагриппа-3 играет важную роль в персистирующей инфекции и патогенезе
45
вируса. Ген (М-ген), кодирующий этот белок, является подходящей мишенью для создания информативной
филогенетической реконструкции вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота.
Филогенетический анализ
нуклеотидной последовательности
фрагмента М-гена представителей BPIV-3 показал, что российский изолят ЛД-9 и вакцинный штамм ПТК-45/86 относятся к генотипу А. Вакцинный штамм ПТК-45/86, в свою очередь, присутствует в живой вакцине «Тривак», применяемой для профилактики инфекционного
ринотрахеита, парагриппа-3, вирусной диареи крупного рогатого скота. Выделенный изолят ЛД-9 генотипически близок к американским и уругвайским штаммам.
Вакцины, используемые в России против вируса парагриппа крупного рогатого скота-3, были разработаны на основе референтного штамма,
принадлежащего генотипу А. Перекрестная защита таких вакцин от парагриппа-3, вызванного генотипами В и С, остается неясной, поэтому следует оценить необходимость разработки альтернативных диагностических тестов и вакцин для профилактики. Генетическая
характеристика циркулирующих штаммов возбудителя может способствовать разработке более эффективных методов диагностики и профилактики данной инфекции.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Гумеров, В.Г. Эпизоотологический и серологический мониторинг смешанных респираторно-кишечных инфекций крупного рогатого скота / В.Г. Гумеров, В.В. Евстифеев, Х.Н. Макаев [и др.] // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. - 2019. - № 237 (1). - С. 56-60.
2. Тяпша, Ю.И. Полимеразная цепная реакция для детекции вируса парагриппа-3 / Ю.И. Тяпша, О.В. Дубаневич // Актуальные проблемы биотехнологии в аграрно-промышленном комплексе. - 2015. - С. 205-208.
3. Adams, M.J. Ratification vote on
taxonomic proposals to the international committee on taxonomy of viruses / M.J. Adams, E.J. Lefkowitz, A.M.Q. King [et al.] // Arch Virol. - 2016. - V. 160(7). - P. 2921-2949.
4. Albayrak, H. Characterisation of the first bovine parainfluenza virus 3 isolate detected in cattle in Turkey / Z. Yazici, E. Ozan [et al.] / Vet. Sci. - 2019. - V. 6. -doi:10.3390/vetsci6020056
5. Konishi, M. Complete genome sequence of the first isolate of genotype C bovine parainfluenza type 3 in Japan. / M. Konishi, T. Ohkura, M. Shimizu, et al. -Genome Announcements. - 2014. - V. 2(6). -doi: 10.1128/genomeA.01215-14.
6. Lamoril, J.A. Les techniques de séquencage de l'ADN: une révolution en marche. Première partie DNA sequencing technologies: A revolution in motion. Part one / J.A. Lamoril., B.P. Ameziane, M. Bouizegarènea // Immuno-analyse et biologie spécialisée. - 2008. - № 23. - P. 260-279.
7. Maidana, S. Isolation and characterization of bovine parainfluenza virus type 3 from water buffaloes (Bubalus bubalis) in Argentina / S. Maidana, P. Lomonaco, G. Combessies [et al.] // BMC Veterinary Research. - 2012. - 8:83. - P. 1-9.
8. Oem, J.K. Molecular characterization of a Korean bovine parainfluenza virus type 3 isolate / J.K. Oem, E.Y. Lee, K.K. Lee [et al.] // Veterinary Microbiology. - 2013. - V. 162. - P. 224-227.
9. Ohkura, T. Complete genome sequences of bovine parainfluenza virus type 3 strain BN-1 and vaccine strain BN-CE / T. Ohkura, M. Konishi T. Kokuho [et al.] // Genome Announcements. - 2013. - V. 1(1). -DOI:10.1128/genomeA.00247-12
10. Sobhy, N.M. Surveillance, isolation and complete genome sequence of bovine parainfluenza virus type 3 in Egyptian cattle / N.M. Sobhy, S.K Mor, M B. Iman [et al.] // International Journal of Veterinary Science and Medicine. - 2017. - V. 5 (1). - P. 8-13.
11. Wen, X. Identification and genetic ch aracterization of bovine parainfluenza virus type 3 genotype C strain isolated from cattle in Western China / X. Wen, Sun J., Zhang Y. [et al.] // Turkish Journal Of Veterinary And Animal Sciences. - 2017. - V. 41(2). - P. 180-
12. Zhu, Y.M. Isolation and genetic characterization of bovine parainfluenza virus type 3 from cattle in China / Y.M. Zhu,
H.F. Shi, Y.R. Gao [et al.] // Veterinary Microbiology. - 2011. - V. 149(3-4). - P. 446451.
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ИЗОЛЯТОВ ВИРУСА
ПРАГРИППА-3
Галиуллин А.К., Гериш А., Гумеров В.Г., Шаева А.Ю., Магдеева Э.А.
Резюме
В данном исследовании сообщается о молекулярно-генетической характеристике полевого штамма вируса ПГ-3 крупного рогатого скота, выделенного в Республике Татарстан. Фрагменты М-гена российского изолята ЛД-9 и вакцинного штамма ПТК-45/86 были секвенированы и выравнены с соответствующими последовательностями штаммов вируса, представленными в GenBank. Результаты филогенетического анализа показали, что российский изолят ЛД-9 (MW52481) и вакцинный штамм ПТК45/86 относятся к генотипу А вируса парагриппа-3, как и референтный штамм SF-4. Российский изолят ЛД-9 показал 98,3 % сходство с референтным штаммом SF-4, а российский вакцинный штамм ПТК-45/86 был идентичен референтному штамму на 100 %.
MOLECULAR-GENETIC CHARACTERIZATION OF PARAINFLUENZA-3 VIRUS
ISOLATES
Galiullin A.K., Gueriche A., Gumerov V.G., Shaeva A.Y., Magdeeva E.A.
Summaty
This study reports on the molecular-genetic characterization of a field strain of BPIV-3 isolated in the Republic of Tatarstan. M gene fragments of the Russian isolate LD-9 and the vaccine strain PTK/86 were sequenced and aligned with the corresponding sequences of the virus strains presented in GenBank. The results of the phylogenetic analysis showed that the Russian isolate LD-9 (MW52481) and the vaccine strain PTK45/86 belong to the genotype A of the parainfluenza virus-3, as well as the reference strain SF-4. The Russian isolate LD-9 showed 98.3 % similarity with the reference strain SF-4, and the Russian vaccine strain PTK-45/86 was 100 % identical to the reference strain.
