CC BY
5
МИКРОБИОЛОГИЯ И ВИРУСОЛОГИЯ MICROBIOLOGY AND VIROLOGY
ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ГЕТЕРОГЕННОСТЬ ПОПУЛЯЦИИ RICKETTSIA HELVETICA
РЕЗЮМЕ
Рар В.А. 1, Иголкина Я.П. 1, Якименко В.В. 2, Тикунов А.Ю. 1, Никитин А.Я. 3, Епихина Т.И. 1, Тикунова Н.В. 1
1 ФГБУН Институт химической биологии и фундаментальной медицины
СО РАН (630090, г. Новосибирск, просп. Лаврентьева, 8, Россия)
2 ФБУН «Омский
научно-исследовательский институт природно-очаговых инфекций» (644080, г. Омск, просп. Мира, 7, Россия)
3 ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (664047, г. Иркутск, ул. Трилиссера, 78, Россия)
Автор, ответственный за переписку: Рар Вера Александровна,
e-mail: rarv@niboch.nsc.ru
Обоснование. Генетическая вариабельность Rickettsia helvetica недостаточно изучена.
Цель исследования. Изучить встречаемость и генетическую вариабельность R. helvetica в Ixodes spp., собранных в Сибири и на Дальнем Востоке. Методы. На наличиериккетсий проанализированы клещи, снятые с грызунов в Омской области (n = 280) и собранные на флаг на островах Путятина и Русский в Приморском крае (n = 482). Для всех образцов риккетсий секвени-рованы фрагмента гена gltA, а для ряда образцов R. helvetica дополнительно секвенированы фрагменты 16S rRNA, ompA, ompB, sca4, htrA и groEL генов и 23S-5S межгенного спейсера.
Результаты. Всего было выявлено четыре вида риккетсий. Из них R. helvetica обнаружена в 72,2 % Ixodes apronophorus и 18,8 % Ixodes trianguliceps из Омской области и в единичных Ixodes persulcatus из Омской области и с острова Путятина. Это первое выявление риккетсий в I. apronophorus. На основании проведённого филогенетического анализа последовательности R. helvetica из данной работы и из базы данных GenBank отнесены к четырём генетическим линиям. Линия I включает европейские изоляты из Ixodes ricinus, изоляты из I. persulcatus из Западной Сибири и некоторые последовательности из I. apronophorus. Все последовательности R. helvetica из I. trianguliceps из Омской области и из I. persulcatus из Республики Коми, а также последовательность из I. apronophorus отнесены к линии II. Большинство последовательностей из I. apronophorus образуют линию III, а все последовательности R. helvetica из I. persulcatus с Дальнего Востока - линию IV. Заключение. Впервые показана генетическая гетерогенность популяции R. helvetica. Известные изоляты R. helvetica надёжно отнесены к четырём генетическим линиям, однако ассоциация различных линий с определённым видом клеща или с определённой территорией наблюдается не во всех случаях.
Ключевые слова: Ixodes apronophorus, Ixodes persulcatus, Ixodes trianguliceps, Rickettsia helvetica, область симпатрии, генетические линии, филогенетический анализ
Статья поступила: 31.08.2023 Статья принята: 24.11.2023 Статья опубликована: 29.12.2023
Для цитирования: Рар В.А., Иголкина Я.П., Якименко В.В., Тикунов А.Ю., Никитин А.Я., Епихина Т.И., Тикунова Н.В. Генетическая гетерогенность популяции Rickettsia helvetica. Acta biomedica scientifica. 2023; 8(6): 91-104. doi: 10.29413/ABS.2023-8.6.8
GENETIC HETEROGENEITY OF RICKETTSIA HELVETICA POPULATION
ABSTRACT
Rar V.A. 1, Igolkina Ya.P. 1, Yakimenko V.V. Tikunov A.Yu. 1, Nikitin A.Ya. 3, Epikhina T.I. 1, Tikunova N.V. 1
1 Institute of Chemical Biology
and Fundamental Medicine, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences (Lavrentyeva Ave. 8, Novosibirsk 630090, Russian Federation)
2 Omsk Research Institute of Natural Focal Infections (Mira Ave. 7, Omsk 644080, Russian Federation)
3 Irkutsk Antiplague Research Institute
of Siberia and Far East of Rospotrebnadzor (Trilissera str. 78, Irkutsk 664047, Russian Federation)
Corresponding author: Vera A. Rar,
e-mail: rarv@niboch.nsc.ru
Background. To date, the genetic variability of Rickettsia helvetica has not been sufficiently studied.
The aim. To study the prevalence and genetic variability of R. helvetica in Ixodes spp. collected in Western Siberia and the Russian Far East.
Materials and methods. Ixodes spp. collected from rodents in the Omsk province, Western Siberia (n = 280) and collected by flagging on Putyatin and Russky Islands in Primorsky Krai, Russian Far East (n = 482) were analyzed for the presence of Rickettsia spp. All positive samples were genotyped for the gltA gene fragment. For a number of R. helvetica samples, fragments of the 16S rRNA, ompA, ompB, sca4, htrA, and groEL genes and 23S-5S intergenic spacer were additionally sequenced. Results. Four Rickettsia species (R. helvetica, "Candidatus Rickettsia tarasevichiae", "Candidatus Rickettsia uralica", and "Candidatus Rickettsia mendelii") were found. Of them, R. helvetica was identified in 72.2 % of Ixodes apronophorus and 18.8 % of Ixodes trianguliceps from the Omsk province and in single Ixodes persulcatus from the Omsk province and Putyatin Island. This is the first finding ofRickettsia spp. in I. apronophorus. All known R. helvetica sequences from this study and the GenBank database belonged to four well supported monopheletic groups forming genetic lineages I-IV. Lineage I included European isolates from Ixodes ricinus, Western Siberian isolates from I. persulcatus, and some sequences from I. apronophorus. All R. helvetica sequences from I. trianguliceps from the Omsk province and I. persulcatus from the Komi Republic and one sequence from I. apronophorus were assigned to lineage II. Most sequences from I. apronophorus formed lineage III; all known R. helvetica sequences from I. persulcatus from the Far East formed genetic lineage IV. Conclusion. The genetic heterogeneity of R. helvetica population was first demonstrated. Known isolates of R. helvetica are reliably assigned to four genetic lineages, but not in all cases the association of different lineages with a specific tick species or specific territory was observed.
Key words: Ixodes apronophorus, Ixodes persulcatus, Ixodes trianguliceps, Rickettsia helvetica, sympatric areas, genetic lineages, phylogenetic analysis
2
Received: 31.08.2023 Accepted: 24.11.2023 Published: 29.12.2023
For citation: Rar V.A., Igolkina Ya.P., Yakimenko V.V., Tikunov A.Yu., Nikitin A.Ya., Epikhina T.I., Tikunova N.V. Genetic heterogeneity of Rickettsia helvetica population. Acta bio-medica scientifica. 2023; 8(6): 91-104. doi: 10.29413/ABS.2023-8.6.8
ВВЕДЕНИЕ
Rickettsia helvetica Beati et al. 1993 [Rickettsiaceae; Rickettsiales], принадлежащая к группе клещевой пятнистой лихорадки (КПЛ), является одним из возбудителей риккетсиозов на территории Евразии. Для риккетсио-за, вызванного R. helvetica, характерен широкий спектр клинических проявлений: лихорадка чаще протекает без сыпи, описаны случаи перимиокардита, менингита и саркоидоза [1-5]. Эту инфекцию выявляют в основном в европейских странах. На территории России описан лишь один случай риккетсиоза, вызванного R. helvetica, у пациента с признаками острого лихорадочного заболевания из Пермского края [6].
Специфичными переносчиками R. helvetica являются клещи рода Ixodes. Rickettsia helvetica широко распространена в клещах Ixodes ricinus (Linnaeus, 1758) в различных странах Европы [7, 8]. В России R. helvetica выявляется на территории разных регионов; при этом в большинстве областей встречаемость этого вида была достаточно низкой и не превышала 5-8 %. Так, R. helvetica была обнаружена в 4,6 % таёжного клеща (Ixodes persulcatus (Schulze, 1930)) в Республике Коми [9], 1,9 % I. persulcatus в Омской области [10], 5,1 % Ixodes spp. в Алтайском крае [11], а также в 8,1 % Ixodes pavlovskyi (Pomerantzev, 1946) и в 6,9 % межвидовых гибридов I. persulcatus/I. pavlovskyi в Республике Алтай [12]. На материковой части Дальнего Востока встречаемость R. helvetica в таёжном клеще также была невысока и в отдельных районах Хабаровского края составляла 3,8-4,3 %, а на юге полуострова Камчатки - 2,4 % [13, 14]. Исключение составляет остров Сахалин, на котором встречаемость R. helvetica в I. persulcatus превышала 60 % [14].
Помимо атакующих людей I.persulcatus и I.pavlovskyi, в различных районах Западной Сибири обитают норные клещи Ixodes trianguliceps (Birula, 1895) и Ixodes apronophorus (Schulze, 1924), все стадии развития которых прокармливаются на мелких млекопитающих. Оба вида имеют обширный, но мозаичный ареал. Клещ I. apronophorus является влаголюбивым видом, обитающим на заболоченных территориях; одним из его основных хозяев является европейская водяная полёвка (Arvicola amphibius (Linnaeus, 1758)) [15-18].
Исследованию I.persulcatus на наличие различных видов риккетсий посвящено много работ; наиболее часто в клещах I. persulcatus выявляется «Candidatus Rickettsia tarasevichiae» Shpynov et al. 2003 (до 90 % заражённых клещей), и в редких случаях - R. helvetica, Rickettsia heilongjiangensis Fournier et al. 2006, Rickettsia raoultii Mediannikov et al. 2008 и Rickettsia sibirica Zdrodovskii 1948 [10, 12, 14, 19]. Клещ I. trianguliceps изучен существенно меньше; в наших предыдущих исследованиях в клещах I. trianguliceps был обнаружен новый кандидатный вид «Candidatus Rickettsia uralica» Igolkina et al. 2015, а также R. helvetica и «Candidatus R. tarasevichiae» [19]. Данные об инфицированности клещей I. apronophorus риккетси-ями к началу данной работы отсутствовали.
В южной тайге и подтайге Западной Сибири встречаются области симпатрии трёх видов клещей рода Ixodes:
I. persulcatus, I. trianguliceps и I. apronophorus. В этих областях симпатрии преимагинальные стадии I. persulcatus и все стадии развития I. trianguliceps и I. apronophorus могут прокармливаться на одних и тех же мелких млекопитающих, что может приводить к передаче каких-либо видов/геновариантов риккетсий от одного вида клеща к другому. В предварительных исследованиях нами были обнаружены участки в областях симпатрии I. apro-nophorus/I. persulcatus/I. trianguliceps на территории Омской области с высокой численностью всех трёх видов клещей [20]. Также большой интерес для изучения представляют острова на Дальнем Востоке, поскольку на одном из этих островов (о. Сахалин) наблюдался неожиданно высокий уровень инфицированности таёжного клеща R. helvetica [14].
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ
Изучить встречаемость и генетическую вариабельность R. helvetica в различных видах клещей рода Ixodes на удалённых друг от друга участках Омской области и Дальнего Востока.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Сбор клещей
Сбор материала проводился на территории Боль-шеуковского района (участок Om-Bo, 56° 46' с. ш., 72° 03' в. д.) и Знаменского района (участок Om-Zn, 57° 23' с. ш., 73° 40' в. д.) Омской области, а та кже на острове Путятина (участок Put 42° 50' с. ш., 132° 25' в. д.) и острове Русский (участок Rus 43° 00' с. ш., 131° 50' в. д.), находящихся в заливе Петра Великого Японского моря на территории Приморского края (рис. 1). В исследование были включены клещи Ixodes spp., снятые с грызунов в Омской области, и клещи, собранные на флаг в Приморском крае.
Грызуны были отловлены в Омской области на участке Om-Bo в июне 2016 г. и на участке Om-Zn с июня по сентябрь 2014-2015 гг. Животные были исследованы на наличие присосавшихся клещей (личинок, нимф и взрослых особей), которых удаляли пинцетом. Вид и стадию развития клещей предварительно определяли с помощью стереомикроскопа MC-800 (Micros, Австрия), согласно морфологическим ключам [21]. Часть напитавшихся и почти напитавшихся личинок и нимф хранились при температуре 10-15 °С в течение 1-2 недель, а затем транспортировались в лабораторию для проведения метаморфоза. Остальные клещи были помещены в герметичные пластиковые пробирки, которые до выделения ДНК хранились в жидком азоте.
Голодные клещи были собраны с растительности на флаг на острове Путятина в 2021 г. и на о. Русский в 2019 и 2021 гг. Вид и стадию развития клещей предварительно определяли на основании морфологических критериев; в дальнейшую работу были включены только клещи рода Ixodes.
РИС. 1.
Места сбора клещей
Владивосток
мг
с us
FIG. 1.
Sites of tick collection
Проведение метаморфоза клещей в лабораторных условиях
Для успешного прохождения метаморфоза частично напитавшиеся личинки и нимфы были докормлены на белых лабораторных мышах. Каждый напитавшийся клещ был помещён в индивидуальную стеклянную пробирку и содержался в темноте при 100%-й относительной влажности при температуре 24-26 °С до завершения линьки. Прошедшие метаморфоз клещи через 4 недели индивидуально замораживались и до выделения из них ДНК хранились при температуре -70 °С.
Выделение ДНК
Замороженных клещей гомогенизировали с помощью прибора MagNA Lyser Instrument с использованием MagNa Lyser Green Beads (Roche Diagnostics, Basel, Switzerland). Суммарная ДНК была выделена с помощью набора «Проба НК» (ДНК-Технология, Москва, Россия), согласно протоколу производителя.
Определение вида клещей молекулярно-генетическими методами
Установление видовой принадлежности клещей I. persulcatus, I. trianguliceps, I. apronophorus проводили с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием видоспеци-фичных праймеров по фрагменту межгенного спей-сера ITS2, как описано ранее [20]. Дифференциацию I. persulcatus, I. pavlovskyi и межвидовых гибридов проводили на основании определения митохондри-ального (coxl) и ядерного (ITS2) локусов, как описано ранее [12].
Выявление и генотипирование Rickettsia helvetica
ДНК риккетсий выявляли с использованием двух-раундовой ПЦР в присутствии родоспецифичных праймеров из области гена gltA при проведении первого раунда и праймеров, специфичных для «Candidatus R. tarasevichiae» и для риккетсий группы КПЛ при проведении второго раунда, как описано ранее [14]. Полученные фрагменты гена gltA были секвенированы для всех положительных образцов риккетсий из группы КПЛ. Для ряда положительных образцов, содержащих ДНК R. helvetica, с целью последующего секвениро-вания были дополнительно наработаны фрагменты генов 16S rRNA, ompA, ompB, sca4, and htrA, а также фрагмент groESL оперона и межгенный спейсер 23S-5S rRNA (23S-5S IGS) в присутствии праймеров, указанных в таблице 1. Дополнительно эти же фрагменты семи генетических локусов были амплифицированы для образцов R. helvetica, выявленных ранее на острове Сахалин (участок Skh) и в Хабаровском крае (участок Khab) [14]. Определённые нуклеотидные последовательности были депонированы в базу данных GenBank под номерами доступа 0Q092468-0Q092487, 0Q102487-0Q102493, 0Q271213-0Q271221, 0Q275007-0Q275011, 0Q675828-0Q675832, 0Q861252, 0Q866612-0Q866624.
Секвенирование и филогенетический анализ
Продукты ПЦР очищали с использованием колонок GFX (Amersham Biosciences, США). Реакцию секвениро-вания методом Сенгера выполняли с использованием BigDye Terminator v. 3.1 Cycling Sequencing Kit (Applied Biosystems, США) в соответствии с инструкцией производителя. Продукты секвенирования очищали с исполь-
ТАБЛИЦА 1 TABLE 1
ПРАЙМЕРЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ДЛЯ АМПЛИФИКАЦИИ PRIMERS USED FOR R. HELVETICA AMPLIFICATION
R. HELVETICA
Локус Организм Раунд Праймер Последовательность 5'-3' T (°С) Ссылка
16S1 I gacgggtgagtaacacgtggg 56 60
Ген 16S rRNA Rickettsia spp. 1652 1653 II 1654 gtcttttagggatttgctccac gatggatgagcccgcgtcag gcatctctgcgatccgcgac [14]
Ген ompA Фрагмент I Rickettsia spp. Rr190.70p 190-701 atggcgaatatttctccaaaa gttccgttaatggcagcatct 55 [22]
Afnw 1 I ggcacaaatactttaacattacc 52 53 #
Rickettsia spp. 190-6808 Afnw 3 II Afnw_4 cacgaactttcacactacc aagcctactcctaaagagaatg cgacagtctctagtgccg [22] #
A1 I taacattacaagctggaggaagcc 58 56
Ген ompA Rickettsia spp. A2 A5 II A6 ttcagagcctgaccaccgg caagtgctggtgatgttacta tagttacatttcctgcacctac #
Afn1 helv I gtaatactagcatcaccgaaatcc 55 54 #
R. helvetica 190-6808 190-5125 II Afnw_4 cacgaactttcacactacc gcggttactttagccaaagg cgacagtctctagtgccg [22] #
M59 F I ccgcagggttggtaactgc 55 53 [23]
Rickettsia spp. 120-1497m* BR1 II BR2 cctatatcgccggtaattgtagc gttactaatggatttattcaagt gcataaacttgtccagcgat #
B2f_5 I taaacttgctgacggtacag 56 52
Rickettsia spp. B2f_2 B2f_3 II 120-2399 cgattatgccgttatcgcttccaag gtagcctaacaaatgctcaaac cttgtttgtttaatgttacggt #
B2f_3 I gtagcctaacaaatgctcaaac 52 55 [23]
Ген ompB R. helvetica B2f_2 B2f 1helv II 120-2399 cgattatgccgttatcgcttccaag cagtacaattcgctcacaacac cttgtttgtttaatgttacggt #
B1 I atatgcaggtatcggtact 56 56
Rickettsia spp. B2 B3 II B4 ccatataccgtaagctacat gcaggtatcggtactataaac aatttacgaaacgattacttccgg #
Rickettsia spp. 120-3462 I 120-4879m* B3f_3f II 120-4879m* ccacaggaactacaaccatt tagaagtttacacggacttttagag gctggacctgaagctggagc tagaagtttacacggacttttagag 52 55 [23] # [23]
ТАБЛИЦА 1 (продолжение) TABLE 1 (continued)
D1f I D1876rm* atgagtaaagacggtaacct tagtttgttccgccgtaatc 52 [24]
sc1f 3 II D1390r gatgtaggtgatgaactctg cttgcttttcagcaatatcac 52 # [24]
sc4-1 I atgtctctgaattaagcaatgc 52 50 #
Ген sca4 Rickettsia spp. Rj2837r sc4-5 II sc4-6 cctgatactacccttacatc ccggcacaacaacaattgatg cctttaccagctcatctactt [25] #
sc4-3 I aattattaggctctgtattaaaga 52 #
D3069r tcagcgttgtggaggggaag [24]
sc4-5 II sc4-7 ccggcacaacaacaattgatg ctctcttttaataggtgttgatt 52 # #
Ген htrA Rickettsia spp. 17k-5 17k-3 gctttacaaaattctaaaaaccatata tgtctatcaattcacaacttgcc 55 [26]
23S-5S IGS Rickettsia spp. RCK/23-5-F RCK/23-5-R gataggtcrgrtgtggaagca tcgggaygggatcgtgtgtttc 55 [27]
Ric-ESL-F1 I ggtaaatgggcaggyaccgaa 60 58
groESL Оперон Rickettsia spp. Ric-ESL-R1 Ric-ESL-F2 II Ric-ESL-R2 gaagcaacrgaagcagcatctt atcgttatgaaagaaagcgayg agwgcagtacgcactactttagc [28]
Примечание. T (°С) - температура отжига; m* - модифицированный праймер; # - данная работа.
зованием колонок CentriSep (Princeton Separations, США) и анализировали с помощью ABI 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США). Анализ последовательности проводили с помощью BlastN [29]. Филогенетический анализ проводили с помощью пакета филогенетических программ MEGA 7.0 [30] с использованием метода максимального правдоподобия (ML, maximum likelihood) [31].
РЕЗУЛЬТАТЫ
Установление видовой принадлежности собранных клещей
Видовая принадлежность всех собранных в Омской области и в Приморском крае иксодовых клещей была установлена с использованием молекулярно-ге-нетических методов. Клещи трёх видов (I. apronophorus, I. persulcatus и I. trianguliceps) были обнаружены на двух участках Омской области, однако доля клещей разных видов на этих участках существенно различалась. На участке Om-Bo среди 145 клещей, снятых с 29 грызунов, и 20 клещей, снятых с грызунов и прошедших метаморфоз в лабораторных условиях, было выявлено 67 (40,6 %) I. apronophorus, 73 (44,2 %) I. persulcatus и 25 (15,1 %) I. trianguliceps, а на участке Om-Zn среди 115 клещей, снятых с грызунов и прошедших метамор-
фоз в лабораторных условиях, было обнаружено 5 (4,4 %) I. apronophorus, 87 (75,6 %) I. persulcatus и 23 (20,0 %) I. trianguliceps (табл. 2).
На Дальнем Востоке на острове Путятина среди снятых с растительности на флаг голодных имаго были идентифицированы 56 I. persulcatus, 4 I. pavlovskyi и один межвидовой гибрид I. persulcatus/I. pavlovskyi, а на острове Русский - 190 I. persulcatus, 199 I. pavlovskyi и 32 межвидовых гибрида (табл. 2).
Выявление Rickettsia spp. в клещах Ixodes spp. в Омской области
Среди клещей с участка Om-Bo, снятых с грызунов, но не прошедших метаморфоз, ДНК R. helvetica была обнаружена в 45 (72,5 %) I. apronophorus всех стадий развития (включая 1 случай микст-инфекции R. helvetica и «Candidatus R. tarasevichiae») и в 9 (37,5 %) I. trianguliceps, но не была выявлена в I. persulcatus. При этом все инфицированные I. trianguliceps были личинками (табл. 2). Кроме того, в 48 (81,4 %) I. persulcatus и 1 (1,6 %) личинке I. apronophorus была обнаружена ДНК «Candidatus R. tarasevichiae», а в 7 (29,2 %) I. trianguliceps - ДНК «Candidatus R. uralica». В одной личинке (1,6 %) I. persulcatus была выявлена микст-инфекция «Candidatus R. tarasevichiae» с Rickettsia raoultii.
ТАБЛИЦА 2 TABLE 2
ВЫЯВЛЕНИЕ R. HELVETICA В КЛЕЩАХ IXODES SPP. DETECTION OF R. HELVETICA IN IXODES SPP. TICKS
Участки/ анализируемые клещи Вид клеща Стадия Число клещей Клещи, содержащие ДНК R. helvetica, абс. (%)
Личинки 47 33
I. apronophorus Нимфы Имаго 5 10 4 8
Все стадии 62 45 (72,5)
Личинки 55 0
Om-Bo/ снятые с грызунов I. persulcatus Нимфы 4 0
Все стадии 59 0
Личинки 17 9
I. trianguliceps Нимфы Имаго 4 3 0 0
Все стадии 24 9 (37,5)
Нимфы 2 1
I. apronophorus Имаго 3 2
Все стадии 5 3 (60)
Om-Bo/ Нимфы 3 0
перелинявшие I. persulcatus Имаго 11 0
Все стадии 14 0
I. trianguliceps Нимфы Все стадии 1 1 0 0
Нимфы 4 3
I. apronophorus Имаго 1 1
Все стадии 5 4 (80)
Нимфы 23 0
Om-Zn/ перелинявшие I. persulcatus Имаго 64 1
Все стадии 87 1 (1,1)
Нимфы 10 0
I. trianguliceps Имаго 13 0
Все стадии 23 0
I. persulcatus Имаго 56 1 (1,8)
Put/ собранные на флаг I. pavlovskyi Имаго 4 0
гибриды Имаго 1 0
I. persulcatus Имаго 190 0
Rus/ собранные на флаг I. pavlovskyi Имаго 199 0
гибриды Имаго 32 0
Примечание. Полужирным выделены объединенные данные по всем исследованным стадиям для каждого вида клеща.
Среди перелинявших клещей 3 из 5 I. apronophorus с участка Om-Bo и 4 из 5 I. apronophorus с участка Om-Zn содержали ДНК R. helvetica. Кроме того, R. helvetica была обнаружена в одном перелинявшем I.persulcatus в виде микст-инфекции R. helvetica и «Candidatus R. tarasevichiae» (табл. 2). ДНК «Candidatus R. tarasevichiae» была выявлена в 80 (79,2 %) I. persulcatus и 2 (8,3 %) I. trianguliceps а ДНК «Candidatus R. uralica» - в 3 (12,5 %) I. trianguliceps. В 1 (1 %) нимфе I. persulcatus была выявлена микст-инфекция «Candidatus R. tarasevichiae» с Rickettsia sp.
Объединяя данные по всем исследованным клещам из Омской области, R. helvetica была выявлена в 75,0 %
I. apronophorus, 18,8 % I. trianguliceps и 1,9 % I. persulcatus, что свидетельствует о тесной экологической связи между R. helvetica и I. apronophorus.
Выявление Rickettsia spp. в клещах Ixodes spp. в Приморском крае
ДНК R. helvetica была обнаружена лишь в 1 из 56 I. persulcatus с острова Путятина, но не была выявлена ни в других видах клещей с того же участка, ни в одном из 421 клеща рода Ixodes с острова Русский (табл. 2). ДНК «Candidatus R. tarasevichiae» была обнаружена в 42 (75,0 %) I. persulcatus, в 1 из 4 I. pavlovskyi и в един-
Изоляты Вид клеща Регион Линия gltA ompB sca4 16S
175525 175576 175847 176092 176156 381079 381549 381958 382176 382239 812583 812147 523727
C9P9 I. ricinus Европа l G C T C C G C G G G G C T
Om-74_Iapr_m I. apronophorus Сибирь l T
0m-20_lper_m I. persulcatus Сибирь l T nd nd nd nd nd nd
0m-75_ltr I. apronophorus Сибирь ll A T A A T
0m-145_lapr I. apronophorus Сибирь lll T T A T A T
0m-79_lapr I. apronophorus Сибирь lll T T A T A T G
0m-103_lapr I. apronophorus Сибирь lll T A nd nd T nd nd nd T nd
Skh-7_lper I. persulcatus Дальний Восток lV A T A
Put-117_lper I. persulcatus Дальний Восток lV A T A
а
Изоляты Линия gltA ompA ompB sca4 htrA 16S IGS
175525 175576 176156 209675 208648 208557 380060 380249 380592 380622 381079 381549 381958 382176 382239 382562 382824 382895 383024 813613 813472 813341 812583 812147 811867 195041 523727 523907 1187522 1187463
C9P9 l G C C C G T T A C T G C G G G G T C G A A C G C G T T A T G
Novosibirsk08-5 l nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd
Komi T nd nd nd G C A A T A nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd
0m-74_lapr_m l T
0m-75_ltr A T T G T C A A T A C G A C
0m-145_lapr lll T G C T A T A C T T G G
0m-79_lapr lll T G C T A T A C T T G G G
Skh-7_lper lV A C C A T C T A C A
Put-117_lper lV A C A T C A T A C A
РИС. 2.
а - конденсированное выравнивание на основании последовательностей генов gltA (840 п. н.), ompB (1255 п. н.), sca4 (783 п. н.) и 16S rRNA (684 п. н.) сиквенс-вариантов R. helvetica. б - конденсированное выравнивание на основании последовательностей генов gltA (1037 п. н.), ompA (1417 п. н.), ompB (3100 п. н.), sca4 (2398 п. н.), htrA (499 п. н.), 16S rRNA (1070 п. н.) генов и межгенного спейсера 23S-5S rRNA (23S-5SIGS) (489 п. н.) генетических линий R. helvetica. Полиморфные сайты приведены в соответствии с последовательностью R. helvetica, штамм C9P9 (AIC001000000). Несинонимичные замены отмечены зелёным цветом
FIG. 2.
а - condensed alignment of gltA (840 bps), ompB (1255 bps), sca4 (783 bps) gene sequences, and 16S rRNA (684 bps) sequence variants of R. Helvetica. 6 - condensed alignment of gltA (1037 bps), ompA (1417 bps), ompB (3100 bps), sca4 (2398 bps), htrA (499 bps), 16S rRNA (1070 bps) gene sequences and 23S-5S IGS region (489 bps) of R. helvetica genetic lineages. Variable nucleo-tide positions are given according to the sequence of R. helvetica, C9P9 (AIC001000000) strain. Non-synonymous polymorphic sites are highlighted in green
ственном межвидовом гибриде на острове Путятина и в 73,7 % I. persulcatus, 5,3 % I. pavlovskyi и 31,3 % межвидовых гибридов на острове Русский. В 2 I. pavlovskyi на острове Русский была выявлена ДНК «Candidatus Rickettsia mendelii" Hajduskova et al. 2016.
Генотипирование R. helvetica
Для всех изолятов R. helvetica были определены последовательности фрагмента гена gltA (840 пар нукле-отидов (п. н.)), и на основе анализа этих последовательностей было выявлено 6 вариантов последовательностей. Для ряда образцов с разными вариантами гена gltA были дополнительно отсеквенированы фрагменты генов ompB (1255 п. н.), sca4 (783 п. н.) и 16S rRNA (684 п. н.). Сравнительный анализ полученных последовательностей позволил выявить 7 сиквенс-вариантов R. helvetica, отличающихся между собой 2-8 нуклеотидными заменами; при этом все обнаруженные сиквенс-варианты отличались от последовательности прототипного штамма C9P9 (AICO01000001) (рис. 2а).
Филогенетический анализ, основанный на сравнении объединённых последовательностей gltA - ompB - sca4 общей длиной 2259 п. н., показал, что полученные последовательности относятся к четырём генетическим линиям (рис. 3). Образцы, относящиеся к линии I (европейская линия), образовывали общий кластер вместе с прототипным штаммом R. helvetica C9P9, изолированном из клеща I. ricinus из Швейцарии. Последовательности линии I были выявлены только на участке Om-Zn в трёх I. apronophorus и в одном I. persulcatus (табл. 3); эти последовательности отличались от последовательностей R. helvetica C9P9 единичными заменами по генам gltA или ompB (рис. 2а). Линия II (I. trianguliceps линия) включала все образцы R. helvetica из клещей I. trianguliceps и один образец из перелинявшего I. apronophorus с участка Om-Bo. Определённые в данной работе последовательности линии II были идентичны ранее секвенированным последовательностям
из двух нимф I. trianguliceps, снятых с грызунов из другого района Омской области. Линия III (I. apronophorus линия) была наиболее многочисленной и включала последовательности из 48 I. apronophorus, преимущественно с участка Om-Bo. Образцы из этой линии были генетически гетерогенны - один образец отличался единичной заменой по гену gltA от остальных; кроме того, 5 образцов из клещей, снятых с одного грызуна, имели одинаковую замену в гене 16S rRNA. Линия IV (дальневосточная линия) включала все определённые последовательности R. helvetica из I. persulcatus с Дальнего Востока: островов Путятина, Сахалин и Хабаровского края (табл. 3).
Поскольку большинство изолятов R. helvetica из базы данных GenBank были охарактеризованы только по гену ompB, мы использовали этот локус для сравнения полученных нами последовательностей R. helvetica с опубликованными ранее. Филогенетический анализ, основанный на сравнении последовательностей гена ompB длиной 2684 п. н., показал наличие всё тех же четырёх генетических линий. На основании проведённого анализа европейская линия (линия I) дополнительно содержала ряд образцов R. helvetica из I. ricinus из Германии и один образец из I. persulcatus из Новосибирской области, а I. trianguliceps линия (линия II) дополнительно включала 32 образца R. helvetica из I. persulcatus из Республики Коми (рис. 4). Анализ последовательностей гена sca4 показал, что дальневосточная линия также включает образцы R. helvetica из I. persulcatus из Японии [25].
Для более детального генотипирования последовательности генов 16S рРНК (1070 п. н.), gltA (1037 п. н.), ompA (1417 п. н.), ompB (3100 п. н.), sca4 (2398 п. н.), htrA (499 п. н.), groEL (1528 п. н.), а также 23S-5S IGS (489 п.н.) были определены для восьми образцов R. helvetica, принадлежащих к разным генетическим линиям. Все последовательности гена groEL были идентичны. Остальные генетические локусы имели полиморфные сайты;
95
R. helvetica isolate Om-98 lapr m II. apronophorus, Омск — R. helvetica isolate 0m-103 lapr II. apronophorus, Омск R. helvetica isolate Om-79 lapr II. apronophorus, Омск R. helvetica isolate Om-145 lapr II. apronophorus, Омск R. helvetica C9P9 II. ricinus, (AIC 001000001)
R. helvetica isolate Om-74 lapr_m II. apronophorus, Омск R. helvetica isolate Om-75 ltr II. trianguliceps, Омск R. helvetica isolate Om-84 ltr II. trianguliceps, Омск R. helvetica isolate Om-89 lapr_m II. apronophorus, Омск _ R. helvetica Skh-7 lper II. persulcatus, о. Сахалин R. helvetica Skh-4 lper II. persulcatus, о. Сахалин R. helvetica Put-117 lper II. persulcatus, о. Путятина
R. asiatica strain Maytaro 1284 (AP019563)
I. apronophorus линия
Европейская линия
86
I. apronophorus линия
Дальневосточная линия
0.001
РИС. 3.
Дендрограмма, построенная методом М1 на основе объединённых последовательностей фрагментов генов gltA - отрВ - $са4 (2259 п. н.). Жирным шрифтом выделены последовательности, полученные в данной работе
FIG. 3.
Phylogenetic tree constructed using the ML method based on concatenated sequences of three genes gltA - ompB - sca4 (2259 bps). The sequences of R. helvetica determined in this study are given in bold
ТАБЛИЦА 3
РАСПРОСТРАНЁННОСТЬ РАЗНЫХ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ЛИНИЙ R. HELVETICA В IXODES SPP.
TABLE 3
DISTRIBUTION OF DIFFERENT GENETIC LINEAGES OF R. HELVETICA IN IXODES SPP.
Участок Вид клеща Анализируемые клещи Число генотипированных образцов R. helvetica Число образцов R. helvetica, относящихся к линии
I II III IV
Om-Bo I. apronophorus Не перелинявшие Перелинявшие 45 3 0 0 0 1 45 0 2 0
Всего 48 0 1 47 0
I. trianguliceps Не перелинявшие 9 0 9 00
Om-Zn I. apronophorus Перелинявшие 4 3 0 10
I. persulcatus Перелинявшие 1 1 0 00
Put I. persulcatus Собранные на флаг 1 0 0 01
Khab I. persulcatus Собранные на флаг 1 0 0 01
Skh I. persulcatus Собранные на флаг 4 0 0 04
87
70
R. helvetica isolate B81 /1. ricinus, R. helvetica isolate M22 /1. ricinus, R. helvetica isolate M19 /1. ricinus, —|R. helvetica isolate W79 /1. ricinus,
R. helvetica Novosibirsk-08-5 /1. persulcatus, R. helvetica strain C9P9 /1. ricinus, R. helvetica strain AS819 /1. ricinus, R. helvetica isolate Om-74 lapr m /1. apronophorus, Омск (OQ866619) iR. helvetica isolate Komi /1. persulcatus, . (Kp866151) 85 IR. helvetica isolate Om-75 Itr /1. trianguliceps, Омск (OQ092470)
72R. helvetica isolate Om-94 Itr /1. trianguliceps, Омск (OQ092484) _ _\R. helvetica isolate Om-145 lapr /1. apronophorus, Омск (OQ092489)
(HQ232247) (HQ232245) (HQ232249) (HQ232250)
(KU310591) (AICO01000000) (MF163037)
Европейская линия (I)
95 r. helvetica isolate Om-79 laprr /1. apronophorus, Омск (OQ092477) R. helvetica Skh-4 Iper /1. persulcatus, о. Сахалин (OQ209945) R. helvetica Skh-7 Iper /1. persulcatus, о. Сахалин (OQ209952) —R. helvetica Put-117 Iper /1. persulcatus, о. Путятина (9OQ866620)
R. asiatica strain Maytaro 1284 (Ap019563)
I. trianguliceps линия (II)
I. apronophorus линия (III)
Дальневосточная линия (IV)
0.001
РИС. 4. Дендрограмма, построенная методом ML на основе последовательностей фрагмента гена ompB (2684 п. н.) R. helvetica. Последовательности R. asiatica были использованы как аутгруппа. Жирным шрифтом выделены последовательности, полученные в данной работе.
FIG. 4. Phylogenetic tree constructed using the ML method based on sequences of the ompB gene fragment (2684 bps) of R. helvetica. The sequences of R. asiatica were used as outgroup. The sequences of R. helvetica determined in this study are given in bold
из них ген ompB был наиболее вариабельным. Среди кодирующих последовательностей нуклеотидные замены в 15 из 25 полиморфных сайтов были несинонимичными (рис. 2б). Филогенетический анализ, основанный на сравнении объединённых последовательностей 16S - gltA - ompA - ompB - sca4 - htrA - IGS (9840 п. н.), также показал с высоким уровнем поддержки наличие четырёх кластеров, которые соответствовали генетическим линиям, идентифицированным на основании анализа более коротких последовательностей (рис. 5). Следует отметить, что внутри каждой генетической линии образцы R. helvetica различались между собой 1-2 ну-
клеотидными заменами. При этом в случае генетических линий I и II образцы из Омской области отличались от образцов из других регионов, а в случае генетической линии IV образец с острова Путятина отличался двумя заменами от образцов с Сахалина.
ОБСУЖДЕНИЕ
Разные виды риккетсий, как правило, ассоциированы с определёнными видами клещей. Rickettsia helvetica тесно связана с клещами рода Ixodes и являет-
100
92r R. helvetica strain C9P9 /1, ricinus, (AICO01000000)
R. helvetica isolate Om-74 lapr m /1. apronophorus, Омск
,R. helvetica isolate Om-75 ltr /1. trianguliceps, Омск 100 R. helvetica isolate Om-94 ltr /1. trianguliceps, Омск r R. helvetica isolate Om-79 laprr /1. apronophorus, Омск
97
100 R95elvetica isolate Om-145 lapr /1. apronophorus, Омск R. helvetica Put-117 lper /1. persulcatus, о. Путятина ,R. helvetica Skh-4 lper /1. persulcatus, о. Сахалин ^R. helvetica Skh-7 lper /1. persulcatus, о. Сахалин
-R. asiatica strain Maytaro 1284 (Ap019563)
Европейская линия (I)
I. trianguliceps линия (II)
I. apronophorus линия (III)
Дальневосточная линия (IV)
0.001
РИС. 5.
Дендрограмма, построенная методом М1 на основе объединённых последовательностей фрагментов семи локусов (дПА - отрА - отрВ - эса4 - МгА - 16Б гЙЫА - !вБ) (9840 п. н.). Жирным шрифтом выделены последовательности, полученные в данной работе
FIG. 5.
Phylogenetic tree constructed using the ML method based on concatenated sequences of seven loci fragments (gltA - ompA - ompB - sca4 - htrA - 16S rRNA - IGS) (9840 bps). The sequences of R. helvetica determined in this study are given in bold
ся доминирующим видом риккетсий в I. ricinus в Европе и в I.persulcatus в некоторых областях России (остров Сахалин и Республика Коми) [7, 9, 14].
Изучение инфицированности клещей инфекционными агентами в областях симпатрии представляет особый интерес, поскольку позволяет сравнить ассоциацию патоген - клещ для разных видов клещей на одной территории. В данную работу были включены клещи, собранные на двух участках в областях симпатрии I. apronoph-orus/I. persulcatus/I. trianguliceps на территории Омской области; на участке Om-Bo численность всех трёх видов клещей была высокой, а на участке Om-Zn I. persulcatus доминировал, а численность I. apronophorus была низкой. В данной работе впервые риккетсии были выявлены в I. apronophorus. Rickettsia helvetica были обнаружены в 60-80 % клещей различных стадий развития с обоих участков, что свидетельствует о тесной ассоциации R. helvetica с I. apronophorus (табл. 2).
На территории Омской области R. helvetica была также обнаружена в единичных I.persulcatus и в38 % снятых с грызунов I. trianguliceps с участка Om-Bo. Следует отметить, что R. helvetica была обнаружена только в личинках I. trianguliceps, но не в нимфах и имаго (табл. 2). Поскольку все личинки, инфицированные R. helvetica, были сняты только с двух полёвок, наблюдаемое несоответствие можно объяснить недостаточным количеством исследуемых I. trianguliceps и неравномерным распределением инфицированных и неинфицированных личинок, являющихся потомством от разных самок. Таким неравномерным распределением личинок можно объяснить и тот факт, что все образцы R. helvetica с уникальной заменой в гене 16S rRNA были идентифицированы только в личинках (но не во взрослых особях) I. apronophorus, собранных с одной и той же полёвки.
Помимо областей симпатрии в Омской области, в исследование были включены клещи, собранные на двух островах в Приморском крае. Поскольку ранее на острове Сахалин был отмечен неожиданно высокий уровень
инфицирования таёжного клеща R. helvetica, можно было ожидать, что на других островах также будет наблюдаться нетипичное распределение Rickettsia spp. в разных видах клещей. Тем не менее, на исследуемых островах Путятина и Русский, как и на материковой части Дальнего Востока и в Западной Сибири [10, 12-14, 19], в клещах I. persulcatus существенно доминировал «Candidatus R. tarasevichiae», а R. helvetica была выявлена лишь в одном I. persulcatus на острове Путятина (табл. 2).
Rickettsia helvetica является высоко вариабельным видом. Анализ секвенированных в данной работе и доступных в базе данных GenBank последовательностей данного вида позволил отнести изоляты R. helvetica к четырём генетическим линиям, однако ассоциация различных линий с определённым видом клеща или с определённой территорией наблюдалась не во всех случаях. Так, генетическая линия I объединяла все генотипи-рованные образцы от I. ricinus из Европы, ряд образцов от I. apronophorus из Омской области и образцы от I. persulcatus из Омской и Новосибирской областей. Генетическая линия I. trianguliceps (линия II) была обнаружена в двух разных видах Ixodes spp. в удалённых друг от друга регионах: в I. trianguliceps в Омской области и I. persulcatus в Республике Коми. В то же время генетическая линия I. apronophorus (линия III) выявлена только в I. apronophorus в Омской области; а дальневосточная генетическая линия (линия IV) обнаружена только в I. persulcatus на Дальнем Востоке. Таким образом, в образцах из Омской области было идентифицировано три генетических линии R. helvetica, а в образцах с Дальнего Востока - только одна линия.
Наблюдаемая высокая генетическая гетерогенность популяции R. helvetica может быть связана с широким кругом их переносчиков: I. ricinus, I. pavlovskyi, I. persulcatus, I. apronophorus, I. trianguliceps, Ixodes hexagonus (Leach 1815), Ixodes arboricola (Schulze & Schlottke, 1929), Ixodes ovatus (Neumann, 1899) и Ixodes monospinosus (Saito, 1968) [7, 9, 12, 14, 32]. Следует от-
метить, что в I. trianguliceps был обнаружен только один вариант последовательности, относящийся к генетической линии II, тогда как в I. apronophorus были идентифицированы пять вариантов последовательностей, относящиеся к трём генетическим линиям (табл. 3). В клещах I. persulcatus также были секвенированы последовательности, относящиеся к трём линиям: к линии I -в клещах из Западной Сибири, к линии II - в клещах из Республики Коми ; к линии IV - в клещах из Дальнего Востока. Такое несоответствие может быть связано со значительно более высокой генетической вариабельностью клещей I. apronophorus и I. persulcatus по сравнению с I. trianguliceps [20].
В настоящее время нет достоверных данных, подтверждающих наличие трансптиальной передачи рик-кетсий при совместном кормлении клещей. Хотя такая передача может происходить в искусственных условиях (в случае Rickettsia rickettsia (Wolbach 1919) Brumpt 1922)), её влияние на передачу возбудителя в природе представляется незначительным [33]. Наше исследование снятых с грызунов личинок показало отсутствие эффективной трансптиальной передачи R. helvetica между разными видами Ixodes spp. в процессе одновременного питания на мелких млекопитающих. Действительно, все снятые с грызунов личинки I.persulcatus не были инфицированы R. helvetica, личинки I. apronophorus содержали ДНК R. helvetica только из линии III, а личинки I. trianguliceps - только из линии II (табл. 2, 3). Примечательно, что ассоциация между видами клещей и вариантами R. helvetica сохранялась, даже когда личинки разных видов прокармливались на одном и том же грызуне.
Следует отметить, что данные по генетической вариабельности R. helvetica ограничены небольшим количеством исследованных регионов и включают преимущественно образцы из Германии, Республики Коми, Омской и Новосибирской областей и Дальнего Востока. Необходимо дальнейшее генотипирование образцов R. helvetica из других регионов и разных видов клещей для оценки распространённости различных генетических линий этого вида. Не исключено, что разные генетические линии R. helvetica могут различаться по своим патогенным свойствам.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, впервые показан высокий уровень инфицированности клещей I. apronophorus патогенным для людей видом R. helvetica. Для образцов R. helvetica из Омской области была отмечена высокая генетическая вариабельность. Впервые показано, что изоляты R. helvetica можно надёжно отнести к четырём генетическим линиям, однако строгой ассоциации различных линий R. helvetica с определённым видом клеща или с определённой территорией не наблюдалось.
Конфликт интересов
Авторы данной статьи заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Финансирование
Работа выполнена при финансовой поддержке проекта Государственного задания ФГБУН Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (№ 121031300043-8).
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
1. Fournier PE, Grunnenberger F, Jaulhac B, Gastinger G, Raoult D. Evidence of Rickettsia helvetica infection in humans, eastern France. Emerg InfectDis. 2000; 6(4): 389-392. doi: 10.3201/ eid0604.000412
2. Fournier PE, Allombert C, Supputamongkol Y, Caruso G, Brouqui P, Raoult D. Aneruptive fever associated with antibodies to Rickettsia helvetica in Europe and Thailand. J Clin Microbiol. 2004; 42(2): 816-818. doi: 10.1128/JCM.42.2.816-818.2004
3. Nilsson K, Lindquist O, Pählson C. Association of Rickettsia helvetica with chronic perimyocarditis in sudden cardiac death. Lancet. 1999; 354(9185): 1169-1173. doi: 10.1016/S0140-6736(99)04093-3
4. Nilsson K, Pählson C, Lukinius A, Eriksson L, Nilsson L, Lindquist O. Presence of Rickettsia helvetica in granulomatous tissue from patients with sarcoidosis. J Infect Dis. 2002; 185(8): 1128-1138. doi: 10.1086/339962
5. Nilsson K, Elfving K, Pahlson C. Rickettsia helvetica in patient with meningitis, Sweden, 2006. Emerg Infect Dis. 2010; 16(3): 490492. doi: 10.3201/eid1603.090184
6. Нефедова В.В., Коренберг Э.И., Ковалевский Ю.В., Горелова Н.Б., Воробьева Н.Н. Микроорганизмы порядка Rickettsiales у таежного клеща (Ixodes persulcatus Sch.) в Преду-ралье. Вестник РАМН. 2008; 7: 47-50. [Nefedova VV, Korenberg EI, Kovalevskii YV, Vorobyeva NN. Microorganisms of the order Rickettsiales in taiga tick (Ixodes persulcatus Sch.) from the Pre-Ural region. Annals of the Russian Academy of Medical Sciences. 2008; 7: 47-50. (In Russ.)].
7. Silaghi C, Gilles J, Höhle M, Pradel I, Just FT, Fingerle V, et al. Prevalence of spotted fever group rickettsiae in Ixodes ricinus (Acari: Ixodidae) in southern Germany. J. Med. Entomol. 2008; 45: 948-955. doi: 10.1603/0022-2585(2008)45[948:posfgr]2.0.co;2
8. Stanko M, Derdakova M, Spitalska E, Kazimfrova M. Ticks and their epidemiological role in Slovakia: From the past till present. Biologia (Bratisl). 2022; 77(6): 1575-1610. doi: 10.1007/ s11756-021-00845-3
9. Kartashov MY, Glushkova LI, Mikryukova TP, Korabelnik-ov IV, Egorova YI, Tupota NL, et al. Detection of Rickettsia helvetica and Candidatus R. tarasevichiae DNA in Ixodes persulcatus ticks collected in Northeastern European Russia (Komi Republic). Ticks Tick Borne Dis. 2017; 8: 588-592. doi: 10.1016/j.ttbdis.2017.04.001
10. Shpynov SN, Fournier PE, Rudakov NV, Samoilenko IE, Reshetnikova TA, Yastrebov VK, et al. Molecular identification of a collection of spotted Fever group rickettsiae obtained from patients and ticks from Russia. Am J Trop Med Hyg. 2006; 74(3): 440-443.
11. Rakov AV, Chekanova TA, Petremgvdlishvili K, Timonin AV, Valdokhina AV, Shirokostup SV, et al. High prevalence of Rickettsia raoultii found in Dermacentor ticks collected in Barnaul, Altai Krai, Western Siberia. Pathogens. 2023; 12(7): 914. doi: 10.3390/ pathogens12070914
12. Rar V, Livanova N, Sabitova Y, Igolkina Y, Tkachev S, Tikunov A, et al. Ixodes persulcatus/pavlovskyi natural hybrids in Siberia: Occurrence in sympatric areas and infection by a wide range of tick-transmitted agents. Ticks Tick Borne Dis. 2019; 10(6): 101254. doi: 10.1016/j.ttbdis.2019.05.020
13. Пуховская Н.М., Рар В.А., Иванов Л.И., Высочина П.Н., Иголкина Я.П., Фоменко Н.В., и др. Выявление методом ПЦР возбудителей природно-очаговых инфекций, переносимых клещами, на полуострове Камчатка. Медицинская паразитология и паразитарные болезни. 2010; 4: 36-39. [Pukhovskaia NM, Rar VA, Ivanov LI, Vysochina NP, Igolkina IaP, Fomenko NV, et al. PCR detection of the causative agents ofinfections transmitted by ticks on the Kamchatka Peninsula. Meditsinskaya parazitologiya iparazitarnye bolezni. 2010; 4: 36-39. (In Russ.)].
14. Igolkina Y, Bondarenko E, Rar V, Epikhina T, Vysochina N, Pukhovskaya N, et al. Genetic variability of Rickettsia spp. in Ixodes persulcatus ticks from continental and island areas of the Russian Far East. Ticks Tick Borne Dis. 2016; 7: 1284-1289. doi: 10.1016/ j.ttbdis.2016.06.005
15. Малькова М.Г., Богданов И.И. Паразитофауна водяной полевки (Arvicola terrestris) и ее гнезд на юге Западной Сибири. Паразитология. 2004; 38: 33-45. [Malkova MG, Bogdanov II Parasite fauna of the water vole Arvicola terrestris and its nests in south of Western Siberia. Parazitologiya. 2004; 38: 33-45. (In Russ.)].
16. Karimov AV, Korallo-Vinarskaya NP, Kuzmenko YF, Vinar-ski MV. Ixodes apronophorus Schulze (Acari: Ixodida: Ixodidae): Distribution, abundance, and diversity of its mammal hosts in West Siberia (Results of a 54-year long surveillance). Diversity. 2022; 14: 702. doi: 10.3390/d14090702
17. Якименко В.В., Малькова М.Г., Шпынов С.Н. Иксодовые клещи Западной Сибири: фауна, экология, основные методы исследования. Омск; 2013. [Yakimenko VV, Malkova MG, Shpynov SN. Ixodid ticks of the Western Siberia: Fauna, ecology, basic research methods. Omsk; 2013. (In Russ.)].
18. Nowak-Chmura M, Siuda K. Ticks of Poland. Review of contemporary issues and latest research. Ann Parasitol. 2012; 58(3): 125-55.
19. Igolkina YP, Rar VA, Yakimenko VV, Malkova MG, Tancev AK, Tikunov AY, et al. Genetic variability of Rickettsia spp. in Ixodesper-sulcatus/Ixodes trianguliceps sympatric areas from Western Siberia, Russia: Identification of a new Candidatus Rickettsia species. Infect GenetEvol. 2015; 34: 88-93. doi: 10.1016/j.meegid.2015.07.015
20. Rar V, Yakimenko V, Tikunov A, Vinarskaya N, Tancev A, Babkin I, et al. Genetic and morphological characterization of Ixodes apronophorus from Western Siberia, Russia. Ticks and Tick-Borne Diseases. 2020; 11(1): 101284. doi: 10.1016/j.ttbdis.2019.101284
21. Филиппова Н.А. Иксодовые клещи подсемейства Ixodi-nae. Ленинград: Наука; 1977. [Filippova NA. Ixodid ticks of the subfamily Ixodinae. Leningrad: Nauka; 1977. (In Russ.)].
22. Fournier PE, Roux V, Raoult D. Phylogenetic analysis of spotted fever group rickettsiae by study of the outer surface protein rOmpA. Int J Syst Bacteriol. 1998; 48 (3): 839-849. doi: 10.1099/00207713-48-3-839
23. Roux V, Raoult D. Phylogenetic analysis of members of the genus Rickettsia using the gene encoding the outer-membrane protein rOmpB (ompB). Int J Syst Evol Microbiol. 2000; 50: 1449-1455. doi: 10.1099/00207713-50-4-1449
24. Sekeyova Z, Roux V, Raoult D. Phylogeny of Rickettsia spp. inferred by comparing sequences of 'gene D', which encodes an intracytoplasmic protein. Int J Syst Evol Microbiol. 2001; 51(4): 1353-1360. doi: 10.1099/00207713-51-4-1353
25. Matsumoto K, Inokuma H. Identification of spotted fever group Rickettsia species by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism analysis of the sca4 gene. Vector Borne Zoonotic Dis. 2009; 9(6): 747-749. doi: 10.1089/vbz.2008.0098
26. Labruna MB, McBride JW, Bouyer DH, Camargo LM, Cama-rgo EP, Walker DH. Molecular evidence for a spotted fever group Rickettsia species in the tick Amblyomma longirostre in Brazil. J Med Entomol. 2004; 41(3): 533-537. doi: 10.1603/0022-2585-41.3.533
27. Jado I, Escudero R, Gil H, Jiménez-Alonso MI, Sousa R, García-Pérez AL, et al. Molecular method for identification of Rickettsia species in clinical and environmental samples. J Clin Microbiol. 2006; 44(12): 4572-4576. doi: 10.1128/JCM.01227-06
28. Shao JW, Zhang XL, Li WJ, Huang HL, Yan J. Distribution and molecular characterization of rickettsiae in ticks in Harbin area of Northeastern China. PLoS Negl Trop Dis. 2020; 14(6): e0008342. doi: 10.1371/journal.pntd.0008342
29. National Library of Medicine. Basic Local Alignment Search Tool. URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST [date of access: 05.09.2023].
30. Molecular Evolutionary Genetics Analysis. URL: http://www. megasoftware.net/manual.html [date of access: 05.09.2023].
31. Kumar Lab - Laboratory of Sudhir Kumar. URL: http:// www.kumarlab.net/publications [date of access: 05.09.2023].
32. Parola P, Paddock CD, Socolovschi C, Labruna MB, Medi-annikov O, Kernif T, et al. Update on tick-borne rickettsioses around the world: A geographic approach. Clin Microbiol Rev. 2013; 26(4): 657-702. doi: 10.1128/CMR.00032-13
33. Moraes-Filho J, Costa FB, Gerardi M, Soares HS, Labruna MB. Rickettsia rickettsii co-feeding transmission among Amblyomma aureolatum ticks. Emerg Infect Dis. 2018; 24(11): 2041-2048. doi: 10.3201/eid2411.180451
Сведения об авторах
Рар Вера Александровна - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории молекулярной микробиологии, ФГБУН Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, e-mail: rarv@niboch.nsc.ru, https://orcid.org/0000-0002-5930-5306
Иголкина Яна Петровна - кандидат биологических наук, младший научный сотрудник молекулярной микробиологии, ФГБУН Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, e-mail: igolkina@inbox.ru, https://orcid.org/0000-0001-5604-1846
Якименко Валерий Викторович - доктор биологических наук, главный научный сотрудник, заведующий лабораторией арбовирусных инфекций отдела природно-очаговых вирусных инфекций, ФБУН «Омский научно-исследовательский институт природно-очаговых инфекций», e-mail: yakimenko_vv@oniipi.org, https://orcid.org/0000-0001-9088-3668 Тикунов Артем Юрьевич - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, заведующий лабораторией противомикробных препаратов, ФГБУН Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, e-mail: arttik@ngs.ru, https://orcid.org/0000-0001-5613-5447;
Никитин Алексей Яковлевич - доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник зоолого-паразитологического отдела, ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, e-mail: nikitin_irk@mail.ru, https://orcid.org/0000-0002-3918-7832
Епихина Тамара Ивановна - ведущий инженер лаборатории молекулярной микробиологии, ФГБУН Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, e-mail: tiepikhina@gmail.com, https://orcid.org/0009-0005-7077-1809
Тикунова Нина Викторовна - доктор биологических наук, главный научный сотрудник, заведующий лабораторией молекулярной микробиологии, ФГБУН Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, e-mail: tikunova@niboch.nsc.ru, https://orcid.org/0000-0002-1687-8278
Information about the authors
Vera A. Rar - Cand. Sc. (Biol.), Senior Research Officer at the Laboratory of Molecular Microbiology, Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, e-mail: rarv@niboch.nsc.ru, https://orcid.org/0000-0002-5930-5306
Yana P. Igolkina - Cand. Sc. (Biol.), Junior Research Officer at the Laboratory of Molecular Microbiology, Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, e-mail: igolkina@inbox.ru, https://orcid.org/0000-0001-5604-1846
Valeriy V. Yakimenko - Dr. Sc. (Biol.), Chief Research Officer, Head of the Laboratory of Arbovirus Infections of the Department of Natural Focal Viral Infections, Omsk Research Institute of Natural Focal Infections, e-mail: yakimenko_vv@oniipi.org, https://orcid.org/0000-0001-9088-3668
Artem Yu. Tikunov - Cand. Sc. (Biol.), Senior Research Officer, Head of the Laboratory of Antimicrobials, Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, e-mail: arttik@ngs.ru, https://orcid.org/0000-0001-5613-5447
Aleksey Yu. Nikitin - Dr. Sc. (Biol.), Leading Research Officer at the Zoological and Parasitological Department, Irkutsk Antiplague Research Institute of Siberia and Far East of Rospotrebnadzor, e-mail: nikitin_irk@mail.ru, https://orcid.org/0000-0002-3918-7832
Tamara I. Epikhina - Lead Engineer at the Laboratory of Molecular Microbiology, Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, e-mail: tiepikhina@gmail.com, https://orcid.org/0009-0005-7077-1809
Nina V. Tikunova - Dr. Sc. (Biol.), Chief Research Officer, Head of the Laboratory of Molecular Microbiology, Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, e-mail: tikunova@niboch.nsc.ru, https://orcid.org/0000-0002-1687-8278
