CC BY
36
УДК 577.112.083/122.2
Юкало В.Г., д.б.н., професор ([email protected]) © Сторож Л.А., ст. викладач Тернотлъсъкий нацюнальний техтчнийутеерситет ¡мет 1еана Пулюя
ГЕЛЬ-Ф1ЛЬТРАЦ1Я КАЗЕ1НОВИХ ФОСФОПЕПТИД1В
Бглки казетового комплексу, як природт харчовг бглки, в першу чергу в1дпов1дають класичним вимогам до харчових быюв (збалансований амтокислотний склад, доступтстъ до дИ протеаз шлунково-кишкового тракту). Кргм цъого встановлено, що казегни е попередниками низки бюлог1чно активних пептид1в. Щ пептиди можутъ проникатиукров'янерусло / впливати на нервову систему (аготсти та антагошсти отогдних рецептор1в), травну систему (казофосфопептиди, глшомакропептид к-казету), гмунну систему (¡муномодуляторт та антимшробш пептиди), серцево-судинну систему (антитромботичт та антиг1пертензивш пептиди). Казетовг фосфопептиди е одними з наиважлив1ших бюлог1чно активних пептид1в. Вони позитивно впливаютъ на засвоення гонге калъщю, залгза, цинку, магшю в оргашзм1 / е перспективними /нгред1ентами для функцюналъних продукт1в харчування.
В дангй роботг нами було проведено пор1внялът дослгдженнярозподшу за молекулярними масами казетових фосфопептид1в методами гелъ-фмътрацИ Фосфопептиди отримували протеол1зом загалъного казету ензимними препаратами тваринного, рослинного / м1кробюлог1чного походження. Показат суттев1 вгдмгнностг у складг фосфопептид1в, отриманих за диргзних ензимних препарат1в.
Ключов1 слова: фосфопептиди, казет, протеол1з, гелъ-фыътрац1я.
УДК 577.112.083/122.2
Юкало В.Г., Сторож Л.А.
Тернопольский национальный техническийуниверситет имени Ивана Пулюя
ГЕЛЬ-ФИЛЬТРАЦИЯ КАЗЕИНОВЫХ ФОСФОПЕПТИДОВ
Белки казеинового комплекса, как природные пищевые белки, в первую очередь отвечают классическим требованиям к пищевым белкам (сбалансированный аминокислотный состав, доступность к действию протеаз желудочно-кишечного тракта). Кроме этого установлено, что казеины являются предшественниками ряда биологически активных пептидов. Эти пептиды могут проникать в кровяное русло и влиять на нервную систему (агонисты и антагонисты опиоидных рецепторов), пищеварительную систему (казофосфопептиды, гликомакропептид к-казеина), иммунную систему (иммуномодулирующие и антимикробные пептиды), сердечно-сосудистую систему (антитромботические и антигипертензивные пептиды). Казеиновые фосфопептиды являются одними из важнейших биологически активных пептидов. Они положительно влияют на усвоение ионов кальция, железа, цинка, магния в организме и являются перспективными ингредиентами для функциональных продуктов питания.
В данной работе нами были проведены сравнительные исследования распределения по молекулярным массами казеиновых фосфопептидов
© Юкало В.Г., Сторож Л.А., 2014
225
методами гель-фильтрации. Фосфопептиды получали протеолизом общего казеина энзимными препаратами животного, растительного и микробиологического происхождения. Показаны существенные различия в составе фосфопептидов, полученных при действии различных энзимных препаратов.
Ключевые слова: фосфопептиды, казеин, протеолиз, гель-фильтрация. UDC 577.112.083/122.2
V.G. Yukalo, L.A. Storozh
Ternopil Ivan Pul'uj national technical university
GEL-FILTRATION OF CASEIN PHOSPHOPEPTIDES
Caseins as the natural food proteins have balanced their amino acid composition and are accessible to digestive enzymes in gastrointestinal tract. Although caseins meet classical requirements to food proteins they are also known as precursors of multiple bioactive peptides. These peptides cross into the bloodstream and affect the nervous system (agonists and antagonists of opiate receptors), digestive system (casophosphopeptides, glycomacropeptide from к-casein), immune system (immunomodulatory and antimicrobial peptides) and cardiovascular system (antithrombotic and antihypertensive peptides). Casophosphopeptides are very important bioactive peptides. They have a positive influence on the absorption of calcium, iron, zinc and magnesium ions in organism and are the perspective ingredients for the functional food.
In current study the distribution of casein phosphopeptides molecular mass by gel-filtration methods has been comparative investigated. Phosphopeptides were obtaining by proteolysis of total casein, using enzyme preparations of animal, plant and microbiological origins. It has been detected that there is an important difference between phosphopeptides compositions according to the using one of various enzyme preparations.
Key words: phosphopeptides, casein, proteolysis, gel-filtration.
Вступ. Бшьшу частину серед проте!шв молока становлять фосфопротеши (близько 70 %). До них належать фракци aS1-CN, a S2-CN, P-CN i к-CN. Фосфосеринов1 залишки беруть участь у формуванш пористо! мщелярно! структури цих проте!шв, а також ввдграють важливу роль у зв'язуванш ними ioHiB кальцш [1]. В останш роки було показано, що в результат! розщеплення у шлунково-кишковому тракт1 ссавщв з фосфопроте!шв молока утворюються бюлопчно активш фосфопептиди, як1 здатш доставляти ¿они кальцш та шших метал1в у розчиненому вигляд1 до активних i пасивних транспортних систем у кишечнику [2]. У зв'язку з цим фосфопептиди казешового походження е перспективними шгред1ентами для створення функцюнальних продукт1в. У наш час активно проводяться дослщження метод1в одержання фосфопептцщв i вивчення !х властивостей. При цьому використовують pi3Hi протеол1тичн1 препарата тваринного, м1кроб1олог1чного i рослинного походження. Основним критер1ем ефективност1 методу видшення е вих1д фосфопептид1в по вщношенню до к1лькост1 фосфопроте!н1в, взятих для протеол1зу [3].
В залежност1 вщ специф1чност1 ензим1в протеол1тичних препарат1в можливе утворення фосфопептид1в з р1зними молекулярними масами i, в1дпов1дно, в1дм1нностями у первиннш структур!. Це може вщобразитися на
226
ефективносп i'x бюлопчно! дп у пор1внянш з природними фосфопептидами, яю утворюються у шлунково-кишковому тракт!. Для перев1рки цього припущення i виявлення можливих вщмшностей нами було проведено гель-фшьтрацш казешових фосфопептид1в, отриманих у результат! протеол1зу загального казешу панкреатином, трипсином, х1мотрипсином, папа!ном i нейтральною протеазою.
Мета. Пор1вняти хроматограф1чш профЫ казешових фосфопептид1в, отриманих за дп протеол1тичних препаратсв тваринного, рослинного i мжробюлопчного походження.
Матер1али i методи. Загальний казе!н видшяли i3 св1жого знежиреного молока подвшним переосадженням в ¿зоелектричнш точцг Шсля другого переосадження здшснювали шактивацш природних протеаз молока в оцтовш кислой (pH 4,0) протягом 5 годин [4].
Протеол1з загального казе!ну проводили з використанням препарата трипсину i х1мотрипсину ф1рми «Biozym» (Шмеччина), панкреатину виробництва ПрАТ «Технолог» (Украша), нейтрально! протеази i папашу ф1рми «Barrett industrial limited» (Великобриташя). Протеол1тичну актившсть ферментних препарата визначали на розчинах казешату натрш, як було описано рашше [5].
Концентрацш протемв у препаратах субстрату i г1дрол1затах визначали методом Лоур1 або спектрофотометрично за поглинанням при довжиш хвил1 280 нм на спектрофотометр! СФ-46. При цьому використовували загальноприйнятий коефщент поглинання (Д\°%м) для загального казешу - 8,2.
Склад загального казешу на р1зних стад1ях видшення дослщжували електрофорезом на вертикальних пластинках пол1акриламщного гелю (ПААГ) в anapaTi типу Стад1ера. При цьому застосовували лужну систему (pH 7,9), що мктила 25 мМ Tpic, 27 мМ д1етилбарб1турат, 3 мМ ЕДТА i 4,5 М сечовину [6]. Електрофореграми фжсували i проявляли загальноприйнятими методами. Електрофоретичш буфери i гел1 готували, використовуючи реактиви ф1рми «Reanal» (Угорщина). Для щентифкаци каземв на електрофореграмах застосовували гомогенш фракци asi- i Р-казе!шв, видшеш у нашш лаборатори
[4].
Гель-фшьтрацш продукта протеол1зу загального казешу проводили на хроматограф1чнш колонщ ф1рми «Reanal» (Угорщина), яку заповнювали сефадексом G-25 (fine) ф1рми «Pharmacia» (Швещя). Концентрацш фосфопептид1в у Bcix фракщях визначали спектрофотометрично.
Результати дослщжень. Видшений i3 знежиреного молока препарат загального казешу за результатами електрофоретичного дослщження мктить Bei фракцп фосфопроте!шв молока (рис. 1) у вщповщноси до сучасно! класифкаци [7].
Для проведения протеол1зу нами були вибраш ензимш препарати, яю часто використовують для розщеплення молочних бшюв у харчових цшях. Перед протеол1зом ми визначали загальну протеол1тичну актившсть Bcix препарата для розрахунку i'x кшькоси у реакцшному cepeдoвищi. Враховуючи даш попередшх пyблiкaцiй [8], а також наших дocлiджeнь, розщеплення субстрату проводили при TeMnepaTypi 370С i значенш pH 7,9 протягом трьох годин. В отриманих гiдpoлiзaтax oцiнювaли спектрофотометрично концентрацш низькомолекулярних продукта пpoтeoлiзy теля осадження протемв i пoлiпeптидiв трихлороцтовою кислотою (ТХО). У Bcix випадках
227
оптична густина (Е280) розведено! в десять раз1в надосадово! рщини теля додавання ТХО мала значения в межах 0,440-0,470. Лише у випадку панкреатину - Е280=0,544.
y-CN
к-CN-iP
P-CN-5P —
as2-CN-10P— as2-CN-11P— as2-CN-12P— as2-CN-13P— aS1-CN-8P — aS1-CN-9P —
Рис. 1. Електрофореграма загального казеТну, який використовували для протеол1зу i видшення фосфопептид1в
Другу частнну гщрол1залв використовували для видшення фосфопептид1в. За основу нами було вибрано методику, описану у публжаци [9], яка передбачае осадження фосфопептид1в етанолом у присутносп ioHiB кальщю.
Для гель-фшьтрацп у Bcix вииадках вщбирали зразки фосфопептид1в, отриманих з 9 мл гщрол1зату. Така кшькють дозволяе анал1зувати хроматограф1чш фракцп шсля гель-фшьтрацп в умовах найвищо! точносл УФ-спектрофотометри без додаткового розведення. Тобто, илоща отриманих хроматограм вщображае кшькюш сшввщношення зразюв фосфопептид1в, отриманих з р1зних ензимних препаралв, а також сшввщношення фосфопептид1в pi3Hoi молекулярно! маси.
Результати гель-фшьтрацп препаралв фосфопептид1в на колоищ з сефадексом G-25 (fine) показан! на рис. 2-5. Для визначення вшьиого об'ему колонки на рис. 2(1) показано хроматограф1чний профшь високомолекулярних фосфопроте'1шв субстрату. Враховуючи це, а також об'ем елюцп з колонки фосфопептид1в, можна вщзиачити, що у Bcix випадках молекулярна маса основно! частини фосфопептид1в знаходиться у д1апазош вщ 1000 до 10000 Да. Лише у випадку панкреатинових фосфопептид1в - значна i'x частина (близько 30%) мае молекулярну масу до 1000 Да. В цшому профш хроматограм панкреатинового i в меишш Mipi папашового гщрол1залв змщеш в сторону низькомолекулярних пептид1в. Оскшьки хроматограми трипсинов их i х1мотрипсинових фосфопептид1в виявилися дуже под1бними, ми у даиш po6ori наводимо лише результати, отримаш з трипсином (рис. 3).
228
(5 мл)
Рис. 2. Хроматограма фосфопроте'шового субстрату (1) 1 фосфопептнд1в, отриманих за дй' панкреатину (2)
Рис. 3. Хроматограма фосфопептнд1в, отриманих за д!1 трипсину
229
(5 мл)
Рис. 4. Хроматограма фосфопептид1в, отриманих за дй нейтрально*! протеази
(5 мл)
Рис. 5. Хроматограма фосфопептид1в, отриманих за дй'
папа'шу
Очевидно, що фосфопептиди, отримаш за ди р1зних протеол1тичних препарата, мають р1зну молекулярну масу \ первинну структуру. Це можна було очкувати, враховуючи специф1чшсть ензим1в, яю входять до складу препарата. Проте знайдеш нами суттев1 вщмшност1 у молекулярно-масовому розподш фосфопептид1в можуть позначитися на !хнш бюлопчнш дп. Вщомо,
230
що первинна структура бюактивних пептид1в вадграе важливу роль у забезпеченш ix бюлопчно! функцп [10]. У всякому pa3i бшьшою е ймов1ршсть утворення бюлопчно активних пептид1в у випадку вщтворення природних умов протеол1зу. У нашому випадку такими можна вважати фосфопептиди, отримаш з використанням панкреатину.
Висновок. Показано, що казе!нов1 фосфопептиди, отримаш в результат! використання протеол1тичних препарат1в тваринного, рослинного i мжробюлопчного походження, суттево вщр1зняються за молекулярно-масовим розподшом, що може мати значения для проявления ними бюлопчно! активности Пропонуеться для отримання фосфопептид1в, як функцюнальних ¿нгред1ент1в, використовувати протеол1з, який максимально вщображае природш процеси розщеплення фосфопроте!шв у шлунково-кишковому трактг
Л1тература
1. Park Y.W. Bioactive components in milk and dairy products. - USA: Wiley
- Black Well, 2009. - 426 p.
2. Bouhallab S., Bougle D. Bioactive of milk: caseinophosphopeptides and mineral bioavailability // Reprod. Nutr. Dev. - 2004. - V.44. - P. 493-498.
3. Юкало A.B., Сторож Л.А., Юкало В.Г. Протеши казешового комплексу молока кор!в (Bos taurus) як попередники бюлопчно активних пептид1в // Бютехнолопя. - 2012. - Т. 5, № 4. - С. 21-33.
4. Yukalo V.G. Obtaining of casein protein complex fractions from cow milk // Nutracos. - 2005. - №5. - P. 17-19.
5. Полыгалина Г.В., Чередниченко B.C., Римарева Л.В. Определение активности ферментов. Справочник. - М.: Де Ли принт, 2003. - 375 с.
6. Юкало В.Г. Електрофоретичний анал1з бшюв казе!нового комплексу // Науков1 пращ НУХТ. - 2008. - №24. - С. 65-67.
7. Farrell H.M., Jimenez-Flores R., Bleck G.T. Nomenclature of the proteins of cows' milk - sixth revision // J. Dairy Sci. - 2004. - Vol. 87, № 6. - P. 1641-1674.
8. Декуша Г.В. Розробка технологи сухих сумшей з гщрол1зованим бшком для дитячого харчування : дис. канд. техн. наук : 05.18.16 : захищ. 10.06.09 / Г.В. Декуша. - Одеса, 2009. - 157 с.
9. Adamson N.J, Reynolds E.C. Characterization of multiply phosphorylated peptides selectively precipitated from a pancreatic casein digest // J Dairy Sci. - 1995.
- Vol. 78, № 12. - P. 2653-2659.
10. Fitz Gerald R.J. Potential uses of caseinophosphopeptides // Int. Dairy J. -1998. - Vol. 8. - P. 451-457.
Рецензент - д.т.н., професор Бшонога Ю.Л.
231
