CC BY
68
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ ПЕРИТОНЕАЛЬНЫХ МАКРОФАГОВ ПРИ РАЗВИТИИ КАРЦИНОМЫ ЛЕГКИХ ЛЬЮИС НА ФОНЕ ПРИМЕНЕНИЯ ЭКСТРАКТА ШЛЕМНИКА БАЙКАЛЬСКОГО И ЦИКЛОФОСФАНА
,Ю. Шерстобоев, О.А. Капля, Е.П. Зуева, Т.Г. Разина
НИИ фармакологии Томского научного центра СО РАМН
Изучали влияние циклофосфана, экстракта шлемника байкальского (ЭШБ) и их совместного применения на функциональную; активность перитонеальных макрофагов мышей линии ЕлСБЛхС8УБ1/е) на фоне развития карциномы легких Лыоис. Было показано, что при изучаемой экспериментальной модели злокачественного роста применение ЭШБ, а также его комбинации с циклофосфаном усиливало как цитотоксическую активность перитонеальиых макрофагов, так и продукцию ими ИЛ-1р и ФНО-(Х лишь в терминальную стадию опухолевого процесса.
FUNCTIONAL ACTIVITY OF PERITONEAL MACROPH AGES UNDER DEVELOPMENT LUNG CARCINOMA LEWIS IN THE CONDITION OF SCUTELLARIA BAICALENSIS EXTRACT AND CYCLOPHOSPHAMIDE OF THE
APPLICATION
E.Yu. Sherstoboev, O.A. Kaplya, E.P. Zueva, T.G. Razina Pharmacology Research Institute, Siberian Branch of the Russian Academy of Medical Sciences, Tomsk
It has been studied the influence of cyclophosphamide, scutellaria baicalensis extract and its combined using on functional activity of peritoneal macrophages under development lung carcinoma Lewis in mice of the line F,(CBAxC57Bl/6). It has been shown, that the application of scutellaria baicalensis extract and also its combination with cyclophosphamide under studied experimental model of the malignant growth was increased both the cytotoxic activity of peritoneal macrophages and production them of intcrleukin-lP (IL-1 (3) and tumor necrosis factor-a (TNF-a) only in terminal stage of tumor process.
Изучению изменений функциональной активности макрофагов при опухолевом росте посвящено большое количество исследований [2, 10,12-15]. Одним из современных подходов к повышению эффективности лечения злокачественных новообразований является комбинированное использование классических методов лечения с препаратами растительного происхождения, обладающими способностью не только усиливать эффективность цитостатичес-кой терапии, но и существенно снижать токсич-
ность последней [1, 3]. Особенно важное свойство фитопрепаратов — это их способность влиять как на цитотоксическую, так и на секреторную функцию клеток, в частности на продукцию фактора некроза опухоли (ФНО) и интерлейкина 1 (ИЛ-1) [5]. К таким-препаратам относится жидкий экстракт шлемника байкальского (ЭШБ) [1, 5].
Однако механизмы влияния ЭШБ на функциональную активность клеток-эффекторов системы естественной резистентности при раз-
ЕЮ. ШЕРСТОБОЕВ, О.А. КАПЛЯ, Е.П. ЗУЕВА, Т.Г. РАЗИНА
38
витии в организме неопластического процесса практически не исследованы. В связи с этим целью работы явилось изучение влияния жидкого экстракта шлемника байкальского и его комбинации с циклофосфаном на функциональную активность перитонеальных макрофагов мышей при развитии карциномы легких Льюис.
Методика исследования
Исследования были проведены на 146 мы-шах-самцах линии Рі(СВАхС57В1/6) в возрасте 2-2,5 мес, массой 18-20 г, полученных из лаборатории экспериментального биомоделирования НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН (сертификат имеется). В качестве экспериментальной модели злокачественного роста была использована карцинома легких Льюис (ЬЬС), которую перевивали в мышцу задней лапы взвесью клеток в количестве (5—6)х106 на мышь. Первую экспериментальную группу составили животные (п=35), получавшие цитостатик. Цик-лофосфан (производство Саранского комбината "Биохимик") вводили мышам однократно внут-рибрюшинно в дозе 125 мг/кг на 12-е сут после трансплантации опухоли. Корректором изменений со стороны иммунной системы служил жидкий экстракт шлемника байкальского ("ГНЦЛС", Харьков). Препарат вводили животным через зонд в желудок курсом, начиная с 6-х сут после трансплантации опухоли и далее в течение 12 дней, в дозе 1 мл/кг в объеме 0,2 мл дистиллированной воды. Также исследовали группу мышей (пАЗБ) с курсовым введением ЭШБ на фоне однократного применения цик-лофосфана. Контрольную группу составляли животные (п=35) с перевитой опухолью, получавшие дистиллированную воду в той же дозе в том же и режиме. В качестве фона использовали интактных мышей (п=6) соответствующего пола и возраста. Цитотоксическую активность перитонеальных макрофагов определяли по методу В.И. Селедцова и соавт. [11].
Проводилось изучение уровней цитокинов ФНО-ос, ИЛ-ір в супернатантах перитонеальных макрофагов экспериментальных животных.
Клетки перитонеального экссудата мышей выделяли путем промывания брюшной полости мышей 5 мл среды 199 ('ТНЦ ВБ Вектор", Новосибирск), содержащей 10 Ед гепарина, 40 мкг/мл гентамицина и 5% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) ("BioClot", Германия) [4]. Затем отмытые и осажденные центрифугированием клетки ресуспендировали в полной культуральной среде с 5% ЭТС и вносили их в количестве 1х107 в пластиковые 90-миллиметровые чашки Петри. После инкубации в течение 1 ч при 37 °С и 5% СО, среду с неприлипшими клетками удаляли из чашек, а прилипшие клетки соскабливали с поверхности чашек Петри силиконовым скребком. Количество жизнеспособных макрофагов опытных и контрольной групп доводили до концентрации 2х106 клеток/мл и инкубировали в полной культуральной среде следующего состава: 90% среды RPMI-1640 ('ТНЦ ВБ Вектор", Новосибирск), 10% ЭТС, предварительно инактивированной теплом (56 °С, 30 мин), 2 мМ L-глютамина ("Sigma", США), 10 мМ HEPES ("Flow", Великобритания), 40 мг/л гентамицина ("Serva", ФРГ), 25 мкМ 2-меркаптоэ-танола ("Sigma", США) в течение суток при 37 °С, 5% СО2 и 100% влажности воздуха при добавлении липополисахарида (ЛПС) Escherichia coli Serotype 055:B5 ("Sigma", США) 10 мкг/мл. По окончании инкубации собирали кондиционные среды и хранили не более месяца при —50 °С. Уровни цитокинов ФНО-а, ИЛ-ip тестировали на 13,15,17,19 и 22-е сут после трансплантации опухоли иммуноферментным методом с использованием наборов фирмы "Amersham Pharmacia Biotech" (Великобритания) согласно методическим указаниям, прилагаемым к наборам, и анализатора иммуноферментных реакций "Униплан" АИФР-01 (ЗАО "Пикон", Москва). В эти же сроки исследовали цитотоксическую активность перитонеальных макрофагов. Статистическая обработка результатов осуществлялась с применением пакета статистических программ Statistica for Windows (версия 5.0). Значимость различий была определена с использованием непараметрического критерия Вил-коксона—Манна—Уитни.
Результаты и обсуждение
Мононуклеарные фагоциты играют важную роль в противоопухолевой защите организма. Моноциты и макрофаги непосредственно участвуют в качестве эффекторов в реакциях системы естественной цитотоксичности. При этом медиаторами макрофагов могут выступать активные формы кислорода, такие как перекись водорода, гидроксильный радикал, синглетный кислород и др., окись азота, протеолитические энзимы, а также широкий спектр цитокинов, основными из которых являются ИЛ-1Р и ФНО-а [12, 15].
При исследовании динамики цитотоксичес-кой активности перитонеальных макрофагов у мышей с карциномой легких Льюис на фоне однократного применения циклофосфана было установлено, что введение цитостатика оказывало стимулирующее влияние на цитотоксичность макрофагов (соотношение эффекторов и мишеней 10:1) на 13-е, 19-е и особенно на 22-е сут после трансплантации опухоли (рис. 1, а). На 15-е и 17-е сут эксперимента применение цитостатика не приводило к достоверным изменениям ци-тотоксической активности перитонеальных макрофагов по сравнению с контрольной группой.
При изучении влияния ЭШБ на цитотокси-ческую активность перитонеальных макрофагов мышей с опухолью было установлено, что введение исследуемого препарата вызывало снижение индекса цитотоксичности (ИЦ) макрофагов по сравнению со значениями у контрольных животных на 13-е сут (соотношение эффектор/ мишень —10:1) и 17-е сут (соотношение эффектор/мишень — 5:1), при этом на 19-е сут опыта (соотношение эффектор/мишень — 5:1) препарат оказывал стимулирующее воздействие на клетки-эффекторы системы естественной цитотоксичности. Сочетанное применение циклофосфана и экстракта шлемника байкальского приводило к достоверному повышению ИЦ макрофагов по сравнению со значениями у нелеченых животных на 17-е сут после трансплантации опухоли при соотношении эффектор/ мишень 10:1 и 5:1, на 19-е сут — при соотноше-
нии эффектор/мишень 5:1 и на 22-е сут, как при соотношении эффектор/мишень 10:1, так и 5:1 (рис. 1, а, б).
Наряду с прямым цитотоксическим действием в отношении злокачественно трансформированных клеток макрофаги осуществляют и опосредованное, через секрецию широкого спектра цитокинов, важнейшими из которых являются ФНО-а, ИЛ-ір [6, 9]. При этом данные факторы, помимо киллинга опухолевых клеток, осуществляют иммунорегуляторное влияние на систему противоопухолевой защиты организма. Так, рядом авторов показана способность ФНО и ИЛ-1 стимулировать активность клеток-эффекторов системы естественной цитотоксичности: моноцитов/макрофагов, естественных киллеров, Т-лимфоцитов [7, 8]. Кроме того, ИЛ-1 является амплификатором про-%
Срои! исследования, сутки
Рис. 1. Динамика цитотоксической активности перитонеальных макрофагов у мышей с карциномой легких Льюис (1) на фоне введения циклофосфана (2), экстракта шлемника байкальского (5) и их сочетанного применения (4) при соотношении эффектор/мишень 10:1 (а) и 5:1 (б). Заштрихованным символом обозначены достоверные различил по сравнению с контролем
дукции цитокинов, обладающих противоопухолевой активностью [9].
Динамика продукции ИЛ-ір перитонеальными макрофагами мышей с карциномой легких Льюис при введении циклофосфана носила волнообразный характер: на 13, 15 и 19-е сут эксперимента наблюдалось достоверное снижение (относительно контроля), а на 17-е и 22-е сут опыта отмечалось статистически значимое увеличение продукции цитокина макрофагами (рис. 2, а). При курсовом введении ЭШБ мышам наблюдались подобные изменения: достоверное снижение уровня продукции ИЛ-10 макрофагами по сравнению с контрольной группой на 15-е сут и повышение на 17-е и 22-е сут опухолевого процесса. Сочетанное применение циклофосфана и ЭШБ оказывало неоднозначное влияние на выработку ИЛ-1(3 макрофагами. Так, снижение исследуемого показателя по сравнению с контролем наблюдалось на 13-е и 15-е сут опыта, вместе с тем в более поздние сро-
ки развития неопластического процесса (с 17-х по 22-е сут) было выявлено стимулирующее влияние комбинации двух препаратов на выработку ИЛ-ір перитонеальными макрофагами как по сравнению с контролем, так и группой животных с изолированным введением циклофосфана (рис. 2, а). Исследование динамики продукции ФНО-а перитонеальными макрофагами позволило установить, что цитостатическое воздействие приводило к уменьшению продукции ФНО-а перитонеальными макрофагами на 13-е и 17-е сут эксперимента, однако при этом на 19-е и 22-е сут наблюдения было отмечено увеличение данного показателя относительно контроля. Уровень выработки ФНО-а перитонеальными макрофагами в группе мышей с опухолью при курсовом введении ЭШБ достоверно превышал значения в контроле на 19-е сут опыта, при этом в остальные сроки исследования статистически значимых различий между контрольной и данной экспериментальной группами выявлено не было. Комбинированное введение растительного препарата с цитостатиком вызывало значительное возрастание количества ФНО-а в супернатантах перитонеальных макрофагов животных с опухолью на 15-е и особенно на 22-е сут наблюдения и снижение на 17-е сут эксперимента как по сравнению с контролем, так и группой с изолированным введением циклофосфана (рис. 2, б).
Таким образом, на основании проведенных исследований было установлено, что курсовое введение мышам с карциномой легких Льюис ЭШБ вызывало повышение цитотоксической активности перитонеальных макрофагов лишь в терминальную стадию опухолевого процесса. Сочетанное применение ЭШБ и циклофосфана приводило к более выраженному усилению цитотоксичности макрофагов по сравнению с изолированным введением растительного препарата, но также лишь в поздние сроки злокачественного роста. Вероятно, одним из механизмов усиления цитотоксической активности перитонеальных макрофагов при развитии неопластического процесса под влиянием жидкого экстракта шлемника байкальского является повышение выработки ИЛ-1 и ФНО. Это предположение под-
тверждается данными, полученными при тестировании содержания изучаемых цитокинов в культуральных супернатантах макрофагов.
Литература
Х.Амосова Е.Н., Зуева Е.П., Разина ТТ., Крылова СТ. Лекарственные растения как средства дополнительной терапии для лечения опухолей // Бюл. экспер. биол. 2003. Прил. 2. С. 24-35.
2.БилынскийБ.Т., ВолодькоН.А., ШпарыкЯ.В. Иммунологические механизмы естественной резистентное™. Киев: Наук, думка, 1991. 248 с.
3. Вершинина С. Ф., Потявина Е.В. Применение при родных биорегуляторов в онкологии // Вопр. онкол. 2003. Т. 49, №2, С. 145-151.
4. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. Томск: Изд-во Том. ун-та, 1992."272 с.
5. Гольдберг Е.Д., Зуева Е.П. Препараты из растений в комплексной терапии злокачественных новообразований. Томск: Изд-во Том. ун-та, 2000. 128 с.
6. Зубова СТ., Окулов В.Б. Молекулярные механизмы действия фактора некроза опухолей ос и трансформирую щего фактора роста р в процессе ответа макрофага на ак тивацию//Иммунология. 2001. № 5. С. 18-22.
Т.КовальчукЛ.В., ГанковскаяЛ.В., СоколоваЕ.В., Ти-товец Р.Е. Цитокины в регуляции противоопухолевой ак-
тивности макрофагов; экспериментальное обсоснование адаптивной макрофаготерапйи при злокачественном росте // Иммунология. 1995. № 3. С. 52-54.
8. Лыков А.П., Козлов В.А. Натуральные киллеры и гемопоэз//Иммунология. 2001. № 1.С. 10-14.
9. Навашин СМ., Вядро ММ. Цитокины-интерлейкин-1, фактор некроза опухолей а и фактор некроза опухолей р (лимфотоксин) // Итоги науки и техники. Сер. Онкология, М., 1989. Т. 21. С. 14-58.
10. ОкуловВ.Б., Войтенко Б.О. Роль макрофагов в опухолевом росте // Вопр. онкол. 1990. Т. 36, № 10.
С .1172-1177.
11. Селедцов В.И., Суслов А.П., Брондз В.Д. Ранние антигензависимые реакции Т-лимфоцитов // Биол. мембра ны. 1987. № 12. С. 1313-1318.
12. ЧердынцеваН.В.,КлишоЕ.В., КондаковаИ.В. Срав нительная оценка способности опухольассоциируемых и перитонеальных макрофагов продуцировать активные формы кислорода // Иммунология. 1998. № 2. С. 39-42.
13. AudranR., DazordL., Toujas L. Interaction between human macrophages and Uimor cells in three-dimensional cultures//Cancer Immunology Immunotherapy. 1994. Vol. 39, №5. P. 299-304.
14. MaekawaH., IwabuchiK., Nagaokal. etal. Activated peritoneal macrophages inhibit the proliferation of rat ascites hepatomaAH-130 cells via the production of tumor necrosis factor-alpha and nitric oxide // Inflamm. Res. 2000. Vol. 49, №10. P. 541-547.
15. Martin J.H., Edwards S. W. Changes in mechanisms of monocyte/macrophage-mediated cytotoxicity during culture // J. Immunol. 1993/Vol. 105. P. 3478-3486.
Поступила 29.04.04
