CC BY
152
Химия растительного сырья. 2012. №4. С. 175-180.
УДК 615.071: 547.814.5:582.998.1
ФЛАВОНОИДЫ НАДЗЕМНОЙ ЧАСТИ ВАСИЛЬКА ШЕРОХОВАТОГО (CENTAUREA SCABIOSA L.)*
© М.С. Ларькина1, Т.В. Кадырова1, В.В. Коваль2’3, Е.В. Ермилова1, М.С. Юсубов1
1 Сибирский государственный медицинский университет, Московский тракт, 2, г. Томск, 634050 (Россия), e-mail: [email protected] 2Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, пр. Ак. Лаврентьева, 8, Новосибирск, 630090 (Россия)
3Новосибирский государственный университет, ул. Пирогова, 2,
Новосибирск, 630090 (Россия)
Впервые из надземной части василька шероховатого (Centaurea scabiosa L.) выделены и идентифицированы с использованием современных физико-химических методов (ВЭЖХ, УФ-, ПМР-спектроскопии и масс-спектрометрии) флавоноиды, относящиеся к группе флавонов: гиспидулин (5,7,4-тригидрокси-6-метоксифлавон), апигенин (5,7,4-тригидроксифлавон), хризоэриол (5,7,4-тригидрокси-3'-метоксифлавон) и лютеолин (5,7,3',4'-тетрагидроксифлавон), а также скутелляреин (5,6,7,4'-тетрагидроксифлавон), ранее описанный для данного вида.
Ключевые слова: флавоноиды, гиспидулин, апигенин, лютеолин, хризоериол, Centaurea scabiosa L.
Введение
Василёк шероховатый (СеМаигеа зсаЪюза Ь.) является представителем рода СеМаигеа сем. А^1егасеае, насчитывающего более 500 видов в мире. Это многолетнее травянистое растение широко распространено в европейской части России, на Кавказе, в Западном Казахстане, Западной и Восточной Сибири. В народной медицине василёк шероховатый применяется в качестве седативного, противовоспалительного, диуретического, вяжущего средств, рекомендуется при эпилепсии, гепатите, асците, аллергических дерматитах, сыпи, фурункулах. Фармакологическими исследованиями установлено противовоспалительное, противосудорожное и спазмолитическое действие василька шероховатого [1-3].
Согласно литературным данным [1-6] и собственным исследованиям [7-9] в растении содержатся фенольные соединения: фенолокислоты (кофейная, коричная, феруловая, и-кумаровая, хлорогеновая, галловая и салициловая кислоты), кумарины (скополе-
Ларькина Мария Сергеевна - старший преподаватель кафедры фармацевтической химии, кандидат фармацевтических наук, e-mail: [email protected] Кадырова Татьяна Владимировна - доцент кафедры фармацевтической химии, кандидат фармацевтических наук, e-mail: [email protected] Ермилова Елена Васильевна - заведующая кафедрой фармацевтической химии, профессор, доктор фармацевтических наук, e-mail: [email protected] Коваль Владимир Васильевич - доцент, кандидат химических наук
Юсубов Мехман Сулейманович - заведующий кафедрой химии, профессор, доктор химических наук, e-mail: [email protected]
тин и умбеллиферон), флавоноиды (скутелляреин, глюкуронид скутелляреина, апиин, байкалеин и хризин) и дубильные вещества, а также сесквитерпено-вые лактоны (гроссгемин, цинаропикрин) и сахара (в гидролизате фракций - глюкоза, арабиноза, рамноза, глюкуроновая и галактуроновая кислоты), отсутствуют иридоиды, экдистероиды и сердечные глико-зиды. Проведенный нами количественный анализ некоторых групп биологически активных веществ (БАВ) показал наличие в васильке шероховатом значительного количества водорастворимых полисаха-
* Данная статья имеет электронный дополнительный материал (приложение), который доступен читателям журнала по адресу: http://www.chem.asu.ru/chemwood/volume16/2012_04/1204-175app.pdf.
Автор, с которым следует вести переписку.
ридов (6,70±0,71%), флавоноидов (2,S5±0,19% в пересчете на рутин), гидроксикоричных кислот (1,6±0,3% в пересчете на кофейную кислоту).
Сведения о качественном составе флавоноидов данного растения неполные. Поэтому целью нашего исследования явилось выделение и установление строения флавоноидов из надземной части василька шероховатого.
Экспериментальная часть
Надземная часть василька шероховатого была собрана в 2006 г. в окрестностях д. Новобалохоновка Кемеровской области в фазе массового цветения. Для изучения состава флавоноидов был получен экстракт на 70% этаноле методом мацерации при нагревании. С этой целью навеску (1,6 кг) сырья заливали растворителем в соотношении 1 : 10 и нагревали на водяной бане с обратным холодильником при температуре кипения растворителя в течение одного часа. Экстракцию проводили еще дважды. Полученное извлечение отделяли от обработанного сырья процеживанием через несколько слоев марли, растворитель удаляли под вакуумом, остаток высушивали, высушенный экстракт измельчали, выход экстрактивных веществ составил 401,5 г (25,1%). Для разделения сложных смесей веществ полученного экстракта применяли методы избирательной экстракции, используя в качестве экстрагентов: хлороформ, этилацетат и н-бутанол. Экстракт на 70% этаноле и полученные из него фракции анализировали с применением методов одномерной и двумерной хроматографии на бумаге и в тонком слое сорбента (силикагель) параллельно со стандартными образцами веществ-свидетелей в различных системах растворителей (н-бутанол - уксусная кислота - вода 4 : 1 : 5, 15-60% уксусная кислота, хлороформ - этанол S : 2, 1 : 1). Обнаружение веществ проводили в фильтрованном УФ-свете при длине волны 254 нм до и после обработки хроматограмм 5% этанольным раствором гидроксида калия и 2% этанольным раствором хлорида алюминия.
Выделение индивидуальных соединений из этилацетатной фракции проводили методом адсорбционной колоночной хроматографии на силикагеле. Этилацетатную фракцию S,0 г помещали на колонку с силикагелем (L 40/100), соотношение сорбент-вещество 25 : 1, высота колонки - 95 см, диаметр - 3 см, высота слоя сорбента - 40 см, высота слоя сорбента с фракцией - 2 см. Элюирование проводили хлороформом, смесью хлороформ-этилацетат, постепенно повышая градиент последнего, затем этилацетатом, смесью этилацетат-этанол, этанолом.
Контроль за элюированием веществ осуществляли с помощью методов ТСХ («Сорбфил», элюенты: метанол - хлороформ (1 : 1, 1 : 4, 1 : 9)) и хроматографией на бумаге (БХ) (FN-4, элюенты: н-бутанол - уксусная кислота - вода (4 : 5 : 1, 6 : 4 : 3) и 1, 15, 30 и 60% растворы уксусной кислоты), просматривая хроматограммы в фильтрованном УФ-свете (254 нм) до и после обработки различными реактивами: пары аммиака, 5% этанольный раствор калия гидроксида, 2% этанольный раствор алюминия хлорида, раствор диа-зотированной сульфаниловой кислоты и 50% серную кислоту.
Для изучения компонентного состава и химического строения образцы веществ с колонки анализировали методом ВЭЖХ на жидкостном хроматографе с диодно-матричным УФ- и масс-селективным детекторами (Agilent Technologies 1200 (США). Диодно-матричный детектор позволил провести детектирование и запись спектров поглощения в УФ-диапазоне 200-400 нм. Разделение проводилось на колонке с обращенной фазой 4,6 х 150 мм (5 |am) Eclipse XDB C1S (Agilent Technologies, США) смесью элюентов: муравьиная кислота - метанол (91:9) с градиентом последнего, конечная система: муравьиная кислота -метанол (9 : 91) согласно работе [10]. Температура растворителей, образцов и колонки поддерживалась при 25 °С; образцы растворяли в метаноле и вводили в количестве 10-15 мкл.
Методом ESI-масс-спектрометрии (электроспрей) получали масс-спектры веществ, используя ионную ловушку MSD Trap XCT Ultra (Agilent Technologies, США). Регистрацию масс-спектров образцов проводили как с положительной, так и с отрицательной ионизацией. Параметры масс-спектрометра были выбраны следующие: диапазон сканирования 100-2200 m/z, расход газа-осушителя 4 л/мин, температура газа 300 °C, давление газа на игле-распылителе 10 psi, температура испарителя 250 °C, напряжение на капилляре 3500 В. Полученные спектры анализировались и обрабатывались в программном пакете flexAnalysis (Bruker Daltonics, Германия).
Спектры ПМР записаны на спектрометре Фурье AVANCE AV 300 фирмы Bruker (Германия), рабочая частота - 300 МГц, растворитель - диметилсульфоксид^6 (flMCO-d6). В качестве внутреннего стандарта использовали тетраметилсилан (ТМС). Все значения химических сдвигов выражены в м.д. (5-шкала) по отношению к ТМС.
Обсуждениерезулътатов
В полученном экстракте методом хроматографии на бумаге и в тонком слое сорбента было установлено наличие около 13 веществ флавоноидной природы, пять из которых были идентифицированы как апигенин, лютеолин, байкалеин, рутин и изокверцитрин. Хроматографическое изучение фракций в сравнении со стандарными образцами веществ-свидетелей показало присутствие в хлороформной фракции преимущественно фенолокислот (феруловой, кофейной, и-кумаровой и салициловой); в этилацетатной и бута-нольной фракциях - флавоноидов и фенолокислот (лютеолина, байкалеина, апигенина, рутина, изоквер-цитрина, феруловой, кофейной, и-кумаровой и салициловой кислот); в водной - следовые количества фенольных соединений. Кроме того, качественный анализ водной фракции показал преобладание в ней дубильных веществ, моносахаров, полисахаридов и аминокислот. Хроматографически установлено, что этил-ацетатная и бутанольная фракции имеют близкий состав фенольных соединений. Однако для дальнейшего изучения и индивидуального выделения веществ была выбрана этилацетатная фракция.
При концентрировании ряда подфракций, выделенных методом колоночной хроматографии (система хлороформ - этилацетат 7 : 3), были получены кристаллические осадки желто-зеленого (образец ВШ 1), светло-желтого (образец ВШ 2) и ярко-желтого (образец ВШ 3) цвета, которые не растворялись в этилаце-тате, хлороформе, эфире и гексане. Исследование методами ТСХ и БХ полученных образцов (ВШ 1, 2, 3) показало, что каждый представляет собой смесь двух веществ. Характерная флуоресценция пятен на хроматографической пластинке в УФ-свете при 254 нм и окраска в видимом свете до и после обработки парами аммиака и 2% раствором алюминия хлорида свидетельствуют о принадлежности данных веществ к классу флавоноидов.
Для детального изучения состава и химического строения образцы ВШ 1, 2 и 3 анализировали методом ВЭЖХ с УФ- и масс-детекторами и ПМР-спектроскопии.
По данным ВЭЖХ (см. электронное приложение), образцы ВШ 1 и ВШ 2 содержат по два вещества: флавоноид 1 (время удерживания - 39,908 мин и X max, нм: 268 и 336), присутствующий в обоих образцах, флавоноид 2 (40,362 мин и X max, нм: 212, 234, 272, 326) и флавоноид 3 (40,389 мин и X max, нм: 214, 270, 336) соответственно.
Масс-спектры флавоноида 1 характеризуются основными ионами типа [М+Н]+ с m/z 271 и [М-Н]-с m/z 269. Таким образом, молекулярная масса флавоноида 1 равна 270 а.е.м., что соответствует флаво-ноиду, содержащему три гидроксильные группы. Масс-спектры флавоноидов 2 и 3 имеют основные пики ионов типа [М+Н]+ с m/z 301 и [М-Н]- с m/z 299, следовательно, молекулярные массы флавоноидов 2 и 3 одинаковы и равны 300 а. е. м., что соответствует флавоноидам, содержащим три гидроксильные и одну метокси-группы.
В спектре ПМР для образца ВШ 1 наблюдались сигналы протонов с химическими сдвигами -6,60 м.д. (1Н, с, Н-8), 6,78 м.д. (1Н, с, Н-3), 6,92 м.д. (2Н, д, Н-3' и Н-5', ./=8,7 Гц) и 7,92 м.д. (2Н, д, Н-2' и Н-6', /=8,7 Гц). Кроме того, в спектре четко виден синглет с химическим сдвигом 3,74 м.д., который принадлежит протонам метокси-группы в положении 6 или 8 кольца А. Используя литературные данные о спектрах ПМР флавоноидов [10], мы предположили, что, вероятнее всего, метокси-группа находится в 6 положении. Таким образом, на основании данных ВЭЖХ, масс- и ПМР-спектров флавоноид 2 имеет структуру 5,7,4'-тригидрокси-6-метоксифлавона (гиспидулина) с m/z 300 (рис.).
Следует отметить, что в спектре ПМР образца ВШ 1 присутствуют сигналы протонов Н-3, Н-2', Н-6' и Н-3', Н-5' флавоноида 1, резонирующих в той же области, что и протоны флавоноида 2, усиливая интенсивность их химических сдвигов. Помимо данных сигналов, в спектре присутствуют два дублета (/=2,10 Гц) с величинами химических сдвигов 6,51 и 6,20 м.д., которые относятся к протонам Н-6 и Н-8 кольца А флавона соответственно. Следовательно, флавоноид 1 (рис.) является 5,7,4'-
тригидроксифлавоном (апигенин), содержание которого в смеси с флавоноидом 2 - гиспидулином, по данным ПМР, составляет около 30%.
В ПМР-спектре образца ВШ 2, помимо сигналов протонов флавоноида 1 (апигенин) (табл.), четко виден синглет с химическим сдвигом 3,85 м.д., который принадлежит протонам метокси-группы в положении 3' кольца В флавоноида 3. Следовательно, флавоноид 3, содержание которого в смеси с флавоноидом 1 образца ВШ 2 незначительно (около 7%), идентифицировано как 5,7,4'-тригидрокси-3'-метоксифлавона (хризоэриол) (рис.).
Я=Н, Я1=Н (флавоноид 1); Я=ОСН3, Я1=Н (флавоноид 2); Я= Н, Я1= ОСН3 (флавоноид 3); Я=ОН, Я1=Н (флавоноид 4); Я=Н, Я1=ОН (флавоноид 5)
Флавоноиды василька шероховатого
Физико-химические свойства выделенных из василька шероховатого флавоноидов
Шифр вещества / его название Общая формула Молекулярная масса, а.е.м. Время удерживания, мин X тах, нм (СН3ОН) Данные ПМР (300 МГц, ДМСО-а6, 5, м.д., ТМС)
Флавоноид 1 / 5,7,4 -тригидрокси-флавон (апигенин) С15Н10О5 270 39,908 268, 336 6,54 д (1 2,10 Гц, 1Н, Н-6), 6,25 д (1 2,10 Гц, 1Н, Н-8), 6,64 с (1Н, Н-3), 7,03 д (1 8,7 Гц, 2Н, Н-3' и Н-5'), 7,95 д (1 8,7 Гц, 2Н, Н-2' и Н-6')
Флавоноид 2 / 5,7,4 -тригидрокси-6- метоксифлавон (гиспидулин) С16Н1206 300 40,362 212, 234,272,326 6,60 с (1Н, Н-8), 6,78 с (1Н, Н-3), 6.92 д (1 8,7 Гц, 2Н, Н-3' и Н-5'), 7.92 д (1 8,7 Гц, 2Н, Н-2' и Н-6'), 3,34 с (3Н, С6 - ОСН3)
Флавоноид 3 / 5,7,4 -тригидрокси-3 '- метоксифлавон (хризоэриол) С16Н1206 300 40,389 214, 270, 336 6,54 д (1 2,10 Гц, 1Н, Н-6), 6,25 д (1 2,10 Гц, 1Н, Н-8), 6,64 с (1Н, Н-3), 7,03 с (1Н, Н-5'), 7,95 д (1Н, Н-6'), 7,85 с (1Н, Н-2'), 3,85 с (3Н, С3' -ОСН3)
Флавоноид 4 / 5,6,7,4'- тетрагидроксифлавон (скутелляреин) С15Ню06 286 31,628 213, 234, 280, 330 6,59 с (1Н, Н-8), 6,74 с (1Н, Н-3), 6,92 д (1 9,0 Гц, 2Н, Н-3' и Н-5'), 7,91 д (1 9,0 Гц, 2Н, Н-2' и Н-6')
Флавоноид 5 / 5,7,3',4 '-тетрагидрокси-флавон (лютеолин) С15Ню06 286 35,541 253, 266, 291, 347
По данным ВЭЖХ (см. электронное приложение) образец ВШ 3 также содержит два вещества -флавоноид 4 (31,628 мин и X тах, нм: 213, 234, 280, 330) и флавоноид 5 (35,541 мин и X тах, нм: 253, 266, 291, 347).
Масс-спектры флавоноидов 4 и 5 характеризуются основными ионами типа [М+Н]+ с т^ 287 и [М-Н]- с т/7 285. Таким образом, молекулярные массы флавоноидов 4 и 5 одинаковы и равны 286 а.е.м., что соответствует флавоноидам, содержащим четыре гидроксильные группы.
В спектре ПМР для образца ВШ 3 наблюдаются сигналы протонов с химическими сдвигами - 6,59 м.д. (1Н, с, Н-8), 6,74 м.д. (1Н, с, В-3), 6,92 м.д. (2Н, д, Н-3' и Н-5', ./=9,0 Гц) и 7,91 м.д. (2Н, д, Н-2' и Н-6', ./=9,0 Гц). Следовательно, флавоноид 4 имеет структуру 5,6,7,4'-тетрагидроксифлавона (скутелляреина) (рис.).
На основании спектральных характеристик и данных ВЭЖХ-анализа значения времени удерживания и УФ-спектр флавоноида 5 совпадают с аналогичными характеристиками лютеолина [10, 11]. Кроме того, хроматографическое изучение на бумаге и в тонком слое силикагеля в сравнении с СОВС лютеолина также подтверждает наличие лютеолина в образце ВШ 3. Таким образом, флавоноид 5 (см. электронное приложение) является 5,7,3',4'-тетрагидроксифлавоном (лютеолином).
Выводы
Таким образом, впервые из надземной части василька шероховатого выделены и идентифицированы с использованием современных физико-химических методов (ВЭЖХ, УФ-, ПМР-спектроскопии и масс-спектрометрии) флавоноиды, относящиеся к группе флавонов: гиспидулин (5,7,4'-тригидрокси-6-метоксифлавон), апигенин (5,7,4'-тригидроксифлавон), хризоэриол (5,7,4'-тригидрокси-3'-метоксифлавон) и лютеолин (5,7,3',4'-тетрагидроксифлавон), а также скутелляреин (5,6,7,4'-тетрагидроксифлавон), ранее описанный для данного вида.
Электронный дополнительный материал
В качестве приложения к статье в электронном дополнительном материале приведены ВЭЖ хроматограммы исследованных соединений, обсуждаемых в статье.
Список литературы
1. Федорова А.А. Растительные ресурсы СССР: цветковые растения, их химический состав, использование; семейства Asteraceae. Л., 1987. 326 с.
2. Немыкина Т.А., Нешта И.Д. Фитохимическое изучение васильков сибирского и шероховатого // Материалы 4 Всероссийского съезда фармацевтов. Воронеж, 1984. С. 446-447.
3. Кадырова Т.В., Краснов Е.А., Корнякова А.В. Противосудорожные свойства экстрактов из Centaurea scabiosa (Asteraceae) // Растительные ресурсы. 2006. №4. С. 70-75.
4. Бубенчикова В.Н. Антимикробная активность растений рода василёк // Фитонциды. Бактериальные болезни растений. Киев, 1990. Ч. 1. С. 27.
5. Бубенчикова В.Н. Фитохимическое исследование растений рода василек // Тезисы докладов 2-й республиканской конференции по медицинской ботанике. Киев, 1988. С. 205-206.
6. Vele T., Dejan D., Vlatka V. Constituents of the roots of plants species Centaurea scabiosa // J. Serb. Chem. Soc. 1994. V. 59, N12. Pp. 979-981.
7. Ларькина M.C., Кадырова Т.В., Ермилова Е.В. Изучение динамики накопления фенолкарбоновых кислот в надземной части василька шероховатого // Химия растительного сырья. 2008. №3. С. 71-74.
8. Ларькина М.С., Кадырова Т.В., Ермилова Е.В., Краснов Е.А. Количественное определение флавоноидов в надземной части василька шероховатого (Centaurea scabiosa L.) // Химико-фармацевтический журнал. 2009. №4. С. 14-17.
9. Кадырова Т.В., Ермилова Е.В., Краснов Е.А., Каминский И.П., Ларькина М.С., Дудко В.В. Химический состав перспективных растений, их антиоксидантная активность и фармакологическая активность // Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья : матер. докладов III всерос. науч. конф. Барнаул, 2007. С. 86.
10. Kaoa T.H., Huanga S.C., Inbaraja Stephen B., Chen B.H. Determination of flavonoids and saponins in Gynostemmapen-taphyllum (Thunb.) Makino by liquid chromatography-mass spectrometry // Analytica Chimica Acta. 2008. V. 626. Pp. 200-211.
11. Rijke E., Out P., Niessen Wilfried M.A. Analytical separation and detection methods for flavonoids // Journal of Chromatography A. 2006. N1112. Pp. 31-63.
Поступило в редакцию 11 октября 2011 г.
Larkina M.S.1*, Kadirova T.V.1, Koval V.V.2'3, Ermilova E.V.1, Usubov M.S.1 FLAVONOIDES OF CENTAUREA SCABIOSA AERIAL PART (CENTAUREA SCABIOSA L. )
1Siberian State Medical University, Moskovskii trakt, 2, Tomsk, 634050 (Russia), e-mail: [email protected]
2Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, pr. Ak.
Lavrent'eva, 8, Novosibirsk, 630090 (Russia)
3Novosibirsk State University, st. Pirogova 2, Novosibirsk 630090 (Russia)
From the aerial part of Centaurea scabiosa (Centaurea scabiosa L.) flavonoides of flavones group hyspidulin (5,7,4'-threehydroxy-6-methoxyflavone), apigenin (5,7,4'-threehydroxyflavone), chrisoaeriol (5,7,4'-threehydroxy-3'-methoxyflavone), luteolin (5,7,3',4'-tetrahydroxyflavone), skutellarein (5,6,7,4'-tetrahydroxyflavone) were isolated and identified by modern physic-chemical methods (HPLC, UV-, NMR-spectroscopy and mass-spectrometry). Skutellarein was described for this species earlier.
Keywords: flavonoids, hyspidulin, apigenin, chrisoaeriol, luteolin, Centaurea scabiosa L.
* Corresponding author.
References
1. Fedorova A.A. Rastitel'nye resursy SSSR: tsvetkovye rasteniia, ikh khimicheskii sostav, ispol'zovanie; semeistva Asteraceae. [Plant Resources of the USSR: flowering plants, their chemical composition, the use, of the family Asteraceae]. Leningrad, 19S7, З26 p. (in Russ.).
2. Nemykina T.A., Neshta I.D. Materialy 4 Vserossiiskogo s"ezda farmatsevtov. [Materials 4 All-Russian Congress of Phar-macists].Voronezh, 19S4, pp. 446-447 (in Russ.).
3. Kadyrova T.V., Krasnov E.A., Korniakova A.V. Rastitel'nye resursy, 2006, no. 4, pp. 70-75 (in Russ.).
4. Bubenchikova V.N. Fitontsidy. Bakterial'nye bolezni rastenii. [Volatile. Bacterial diseases of plants]. Kiev, 1990, Part 1, pp. 27 (in Russ.).
5. Bubenchikova V.N. Tezisy dokladov 2-oi respublikanskoi konferentsii po meditsinskoi botanike. [Abstracts of the 2nd National Conference on Medical Botany]. Kiev, 19SS, pp. 205-206 (in Russ.).
6. Vele T., Dejan D., Vlatka V. J. Serb. Chem. Soc.,1994, vol. 59, no. 12, pp. 979-9S1.
7. Lar'kina M.S., Kadyrova T.V., Ermilova E.V. Khimiia rastitel'nogo syr'ia, 200S, no. З, pp. 71-74 (in Russ.).
S. Lar'kina M.S., Kadyrova T.V., Ermilova E.V., Krasnov E.A. Khimiko-farmatsevticheskii zhurnal, 2009, no. 4, pp. 14-17.
(in Russ.)
9. Kadyrova T.V., Ermilova E.V., Krasnov E.A., Kaminskii I.P., Lar'kina M.S., Dudko V.V. Novye dostizheniia v khimii i
khimicheskoi tekhnologii rastitel'nogo syr'ia: mater. dokladov III vseross. nauch. konf [New advances in chemistry and
chemical engineering plant materials: Materials of the III All-Russian Scientific Conference]. Barnaul, 2007, p. S6.
(in Russ.)
10. Kaoa T.H., Huanga S.C., Inbaraja Stephen B., Chen B.H. Analytica Chimica Acta, 200S, vol. 626, pp. 200-211.
11. Rijke E., Out P., Niessen Wilfried M.A. Journal of Chromatography A, 2006, no. 1112, pp. З1-6З.
Received October 11, 2011
