CC BY
62
ORIGINAL ARTICLE
ВАКЦИНОЛОГИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2017 УДК 615.371.011.17.012.8
Козырь А.В.1, Лисицкая Л.А.1, Рябко А.К.1, Марьин М.А.1, Зенинская Н.А.1, Апарин П.Г.2, Шемякин И.Г.1, Колесников А.В.13
ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ МЕТОД СНИЖЕНИЯ РЕАКТОГЕННОСТИ ЛИПОПОЛИСАХАРИДНЫХ ПРИМЕСЕЙ В ПРЕПАРАТАХ ВАКЦИННЫХ БЕЛКОВ НА ПРИМЕРЕ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЛКА-АДЪЮВАНТА CRM197
1ФБУН «ГНЦ Прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора, 142279, пос. Оболенск, Московская обл., Россия;
2ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии ФМБА», 115478, Москва, Россия;
3ОАО «Институт инженерной иммунологии», 142380, пос. Любучаны, Московская обл., Россия
Одна из проблем очистки рекомбинантных белков, в частности компонентов вакцин, — удаление примесей эндотоксинов (пирогенного липополисахарида, ЛПС). В ряде случаев удаление прочно ассоциированного с белком эндотоксина представляет сложную задачу. Перспективным подходом к детоксификации таких белковых препаратов может стать ферментативная конверсия ЛПС в нетоксичный и обладающий адъювантными свойствами монофосфорил-липид А (МФЛА) под действием липид-A фосфатазы LpxE. Цель данной работы — исследовать возможность применения рекомбинантной липид-A фосфатазы LpxE Francisella tularensis для снижения реактоген-ности рекомбинантного CRM197, белкового носителя для синтеза конъюгированных вакцин.
Сконструирован штамм-продуцент белка CRM197 в Escherichia coli и разработана методика очистки белка CRM197 из телец включения, предусматривающая выделение белка на тандемной системе ионообменных колонок CM- и Q-Sepharose, рефолдинг и финальную доочистку на керамическом гидроксиапатите (ГАП). Полученный препарат рекомбинантного белка CRM197 обладал чистотой 98%, по данным электрофореза и денситометрии, и содержанием эндотоксина 500 ME/мг, по данным ЛАЛ-теста. С использованием кроличьего теста и методом ИФА на модели продукции провоспалительных цитокинов IL-1P, IL-6, IL-10 и TNFa дендритными клетками мыши под действием бактериального ЛПС показано, что обработка препарата белка CRM197 рекомбинантной липид-1а-фосфатазой LpxE F. tularensis нейтрализует пирогенность и реактогенность белкового препарата. Полученные данные позволяют рассматривать ферментативную обработку фосфатазой LpxE в качестве перспективной стратегии снижения реактоген-ности синтезированных в E. coli рекомбинантных белков, используемых для промышленного производства вакцин.
Ключевые слова: рекомбинантные белки; конъюгированные вакцины; эндотоксин e. coli; бактериальный ли-
пополисахарид; липид-1а-фосфатаза; LpxE; пирогенность; реактогенность. Для цитирования: Козырь А.В., Лисицкая Л.А., Рябко А.К., Марьин М.А., Зенинская Н.А., Апарин П.Г., Шемякин И.Г., Колесников А.В. Ферментативный метод снижения реактогенности липополисахаридных примесей в препаратах вакцинных белков на примере получения белка-адъюванта CRM197. Иммунология. 2017; 38(1): 19-26. DOI: 10.18821/0206-4952-2017-38-1-19-26
Kozyr A.v.1, Lisitskaya L.A.1, ryabko A.K.1, Marin M.A.1, Zeninskaya N.A.1, Aparin P.G.2, Shemyakin I.G.1, Kolesnikov A.Y.1-3 ENZYMATIC METHOD FOR THE REDUCTION OF REACTOGENICITY CONDITIONED BY LIPOPOLYSACCHARIDE CONTAMINANTS CO-PURIFIED WITH VACCINE PROTEINS ASSAYED FOR DETOXIFICATION OF ADJUVANT PROTEIN CRM197
'State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology, Federal Service for Protection of Consumer Rights and Human Well-Being, 142279, Obolensk, Moscow region, Russia;
2Institute of Immunology, Federal Medical and Biological Agency, 115478, Moscow, Russia; 'Institute of Immunological Engineering, 142380, Lyubuchany, Moscow region, Russia
Endotoxin (LPS) removal is one of important issues in purification of recombinant proteins, in particular, antigens and other vaccine components. In some cases, LPS forms tightly bound complexes with the target protein, introducing further complexity to the design of purification strategy. One approach to overcome this problem in respect of protein antigens is the conversion of residual LPS into non-toxic and immunogenic MPLA, by using lipid A 1-phosphatase LpxE. The aim of the present study was to investigate the utility of LpxE for decreasing reactogenicity of recombinant CRM197, known as versatile carrier for synthesis of conjugate vaccines.
The E. coli strain overexpressing CRM197 was constructed, and the procedure for CRM197 purification was developed employing isolation of inclusion bodies, purification of denatured protein using tandem ion exchange chromatography (CM- and Q-Sepharose, respectively), refolding of partially purified protein, and final purification step, using ceramic hydroxyapatite. Resulting CRM197 was 98% pure judging by SDS-PAGE and densitometry, and contained 500 ME/mg of endotoxin according to LAL assay. Subsequent treatment of purified CRM197 with lipid A 1-phosphatase, LpxE of F.
Для корреспонденции: Козырь Арина Владимировна, канд. биол. наук, вед. науч. сотр. лаборатории молекулярной биологии ФБУН «ГНЦ Прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора, E-mail: [email protected]
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
tularensis, resulted in neutralization of pyrogenicity and reactogenicity of recombinant protein judging by rabbit pyrogen test and ELISA-based detection of proinflammatory cytokines (IL-ip, IL-6, IL-10 and TNF-a) release by LPS-exposed mouse dendritic cells. The data obtained suggests LpxE treatment as the promising technology for endotoxin removal from E. coli-derived recombinant proteins used for various vaccine formulations.
Keywords: recombinant proteins; conjugate vaccines; E.coli endotoxin, bacterial lipopolysaccharide; lipid-1a-phos-phatase; LpxE; pyrogenicity; reactogenicity.
For citation: Kozyr A.V., Lisitskaya L.A., Ryabko A.K., Marin M.A., Zeninskaya N.A., Aparin P.G., Shemyakin I.G., Kole-snikov A. V. Enzymatic method for the reduction of reactogenicity conditioned by lipopolysaccharide contaminants co-purified with vaccine proteins assayed for detoxification of adjuvant protein CRM197. Immunologiya.2017; 38(1): 19-26. DOI: 10.18821/0206-4952-2017-38-1-19-26
For correspondence: Kozyr Arina Vladimirovna, PhD, Leading researcher of the laboratory of molecular biology, State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology, Rospotrebnadzor, E-mail: [email protected].
conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Acknowledgments. The work is executed at financial support of the Ministry of education and science in the framework of the Agreement on subsidies 27 June 2014 No. 14.604.21.0067 (unique identifier of the agreementRFMEFI60414X0067).
Received 22.10.16 Accepted 03.11.16
введение
Развитие рекомбинантных технологий привело к широкому использованию в биотехнологии и медицине гетерологич-ных белков, продуцируемых бактериями, в первую очередь Escherichia coli. Помимо преимуществ эти технологии несут в себе и проблемы, в частности необходимость очистки от эндотоксинов (пирогенов), которые у E. coli представляют собой компонент клеточной стенки — липополисахарид (ЛПС).
Ранее в разработке и производстве вакцин использовали частично очищенные комплексные антигены (например, дифтерийный и столбнячный токсоиды), а рекомбинантные белки не применяли. Расширение спектра вакцинных препаратов, появление противоопухолевых, конъюгированных и других вакцин нового поколения, а также молекулярных адъювантов повлекло за собой использование рекомбинантных технологий и возникновение проблемы эндотоксинов. Целый ряд антигенов, используемых для разработки вакцин нового поколения, обладает повышенным сродством к ЛПС [1—3], и удаление эндотоксина из препаратов таких белков оказывается сложной и дорогостоящей процедурой.
Роль реактогенности ЛПС в жизненном цикле патогена весьма важна: активация продукции цитокинов в процессе инфекции при взаимодействии ЛПС с иммунокомпетентными клетками приводит к перегрузке иммунной системы сигналами активации и снижению эффективности иммунного ответа. Реактогенность ЛПС — адаптивный признак патогена, эволюционировавший в процессе взаимодействия с хозяином [4].
Методов направленного снижения реактогенности живых микроорганизмов до недавнего времени не существовало, а технологии, использовавшиеся для убитых бактерий, базировались на частичном гидролизе ЛПС под действием экстремальных значений pH и приводили к деградации значительной части антигенного материала.
Одним из современных способов снижения реактогенно-сти цельноклеточных вакцинных препаратов на основе живых бактерий стала направленная модификация структуры ЛПС, которая приводит к аттенуации патогена при сохранении им-муногенности [5]. Модификацию ЛПС можно проводить и за счет ферментативной обработки. В частности, у Francisella tularensis для достижения максимальной реактогенности ЛПС необходимо его частичное дефосфорилирование, осуществляемое фосфатазами группы lpx [6]; действие этих ферментов на ЛПС других бактерий имеет, как правило, аттенуирующий эффект. В частности, в E. coli отщепление фосфатной группы в 1-м положении липида А рекомбинантной фосфатазой LpxE, продуцируемой бактерией, конвертирует пирогенный ЛПС в практически апирогенный, но иммуногенный монофосфорил липид А (МФЛА), способный снижать уровень ЛПС-зависимой
активации иммунокомпетентных клеток [7]. Описанный подход широко используют в последние годы для создания штаммов микроорганизмов с пониженной реактогенностью в интересах создания как живых, так и убитых вакцин [8].
В отличие от стратегий снижения реактогенности цель-ноклеточных вакцин подходы к снижению реактогенности белковых препаратов (ионообменная хроматография и экстракция детергентами) [9, 10] остаются неизменными на протяжении многих лет. В большинстве случаев эти технологии оказываются достаточно эффективными, однако использование высокоразрешающих обращенно-фазовых, анионообмен-ных сорбентов либо аффинных сорбентов, нагруженных по-лимиксином В [11], исключительно для удаления пирогенов оказывается дорогостоящим решением, в то время как экстракция Тритоном Х-114 не обеспечивает полного удаления эндотоксина при условии его прочной связи с белком. Некоторые бактериальные белки, в частности CRM197 или антиген Usp2AMoraxella catarrhalis [12], имеют повышенное сродство к бактериальным ЛПС, в результате чего эндотоксин крайне трудно удалить из белкового препарата физико-химическими методами [2, 3]. Это верно и для ряда перспективных противоопухолевых вакцинных препаратов, например основанных на семействе белков E7 папилломавирусов [2], инновационных адъювантов на основе белков теплового шока [1] и многих других белков. Удешевление методов снижения реактогенности — важный элемент программ создания современных иммунобиологических препаратов, особенно актуальный в случае белков, служащих антигенами для создания вакцин. Ферментативная обработка белковых препаратов фосфатазой LpxE, под действием которой образуется производное липида A, 4'-монофосфорил-липида A (МФЛА), обладающий низкой реактогенностью и дополнительным адъювантным эффектом [13], служит новым перспективным вариантом решения проблемы снижения реактогенности белковых препаратов.
Получение аналитических количеств фосфатаз LpxE реализовано в исследовательских целях [14], но до недавнего времени не существовало эффективных методов их выделения в значительном количестве и высокоочищенном состоянии. Авторами статьи разработан метод получения в экс-прессионной системе в Е. coli рекомбинантной растворимой каталитически активной высокоочищенной фосфатазы LpxE F. tularensis [15, 16]. Полученный фермент обладает потенциалом для применения с целью снижения реактогенности препаратов рекомбинантных белков, содержащих бактериальный эндотоксин.
Цель работы — исследование возможности использования рекомбинантной липид-1а-фосфатазы LpxE F tularensis для снижения реактогенности бактериального эндотоксина
на примере препарата рекомбинантного белка CRM197, производного дифтерийного токсина, широко используемого для синтеза конъюгированных вакцин. В задачи работы входило получение рекомбинантного белка CRM197 продукцией в
E. coli, анализ содержания эндотоксина и реактогенности препарата белка CRM197 и изучение влияния обработки фосфатазой LpxE на пирогенность и реактогенность данного препарата на клеточных и животных моделях.
Материал и методы
Реактивы, материалы, бактериальные и клеточные штаммы, лабораторные животные. Соли, бактериальные и клеточные среды и реактивы производства компаний Sigma-Aldrich (США) и Merck (Германия). Конструирование продуцента белка CRM197 проводили на основе векторной плазмиды pET22b(+) (Merck, Германия) в штаммах e. coli DH12S и BL21(DE3) (Thermo Fisher Scientific, США).
Для получения дендритных клеток использовали 10 мышей линии BALB/c (виварий ГНЦ ПМБ), самок в возрасте 8—12 нед. Тестирование пирогенности проводили на 12 кроликах породы Советская шиншилла (ОПХ «Манихино»), самцах в возрасте 4 мес (масса тела 3—4 кг). Манипуляции с лабораторными животными выполняли в соответствии с этическими нормами, изложенными в «Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей» (Страсбург, 1985) [17].
Получение рекомбинантных белков CRM197 и LpxE
F.tularensis. Фрагмент ДНК, кодирующий полипептид CRM197, синтезировали при помощи ПЦР с перекрывающихся праймеров. Достройку концов фрагмента осуществляли с праймеров, содержащих сайты эндонуклеаз рестрикции NdeI (5'-конец) и XhoI (З'-конец), а также стоп-кодон для терминации трансляции (З'-конец). Фрагмент клонировали в плазмиду pET22b(+) по сайтам рестрикции эндонукле-аз NdeI и xhoI c образованием экспрессионной плазмиды pET22CRM197. Штамм-продуцент E. coli BL-CRM197 получали электротрансформацией компетентных клеток E. coli BL21(DE3) плазмидой pET22CRM197.
Для наработки биомассы получали ночную культуру (10 мл) штамма-продуцента в среде 2xYT, содержащей 1% глюкозы и 50 мкг/мл ампициллина, переносили культуру в 1 л среды 2xYT (4 качалочные колбы по 250 мл), содержащей 0,1% глюкозы и 50 мкг/мл ампициллина, наращивали при t = 37 °C 3 ч, после чего добавляли 0,2 мМ ИПТГ и продолжали инкубацию в течение 3 ч. Биомассу собирали центрифугированием при 5000 об/мин 10 мин и хранили при t = -70 °C.
Выделение белка CRM197 проводили при температуре +4 °C; 20 г биомассы суспендировали в 100 мл раствора, содержавшего 20 мМ трис-HCl pH 8, 0,1 М NaCl, 1 мМ фенилме-тилсульфонилфторида (PMSF), инкубировали с лизоцимом в концентрации 20 мкг/мл, лизировали бактерии Triton Х-100 (0,5%) и обрабатывали лизат ДНКазой и РНКазой в концентрации 10 мкг/мл. Тельца включения отделяли центрифугированием в течение 30 мин при 18 000 об/мин, двукратно, с промежуточным центрифугированием промывали раствором, содержащим 20 мМ трис-HCl pH 8, 0,5 М NaCl, 1% Triton x-100, и однократно тем же раствором, содержащим 2 М мочевины. Отмытые тельца включения солюбилизировали в растворе (20 мМ трис, 100 мМ NaCl, 6 М гуандин хлорида, 10 мМ дитиотрейтола (ДТТ), pH 11). Раствор телец центрифугировали 1 ч при 18 000 об/мин для удаления дебриса, супернатант троекратно диализовали против 50 объемов раствора, содержащего 20 мМ трис-HCl pH 6,8, 20 мМ NaCl, 8М мочевины, 1 мМ ДТТ (буфер А).
Очистку лизата осуществляли методами ВЭЖХ на тан-демной системе колонок, упакованных CM-Sepharose и Q-Sepharose (GE Healthcare, США) и уравновешенных буфером А. Элюцию белка с колонки Q-Sepharose проводили 40-минутным градиентом NaCl от 20 до 500 мМ в буфере А.
ORIGINAL ARTICLE
Фракции, содержащие очищенный белок CRM197, идентифицировали денатурирующим электрофорезом в 12% полиа-криламидном геле по методу Лэммли (ДСН-ПААГ).
Белок ренатурировали диализом против 3 смен раствора, содержащего 20 мМ трис-HCl pH 6,8, 20 мМ NaCl в течение 24 ч и удаляли дебрис центрифугированием. Супернатант наносили на колонку с керамическим гидроксиапатитом (ГАП) CHT (Bio-Rad, США), уравновешенную раствором 20 мМ трис-HCl, pH 6,8, 20 мМ NaCl, промывали колонку раствором 2М NaCl на том же буфере и элюировали белок 30-минутным градиентом фосфатного буфера (0,5 М Na2HPO4, pH 8) от 0 до 500 мМ. Определяли чистоту белка ДСН-ПААГ с денситоме-трией и концентрацию белка по методу Бредфорда и хранили белок в аликвотах при температуре -70 °C.
Наработку биомассы продуцента BL-pET22SUMOLpxE и выделение белка LpxE F. tularensis осуществляли в соответствии с ранее разработанной методикой [15, 16]. Удельная активность препарата фосфатазы LpxE, измеренная в реакции отщепления фосфата с использованием набора Phosphate Assay Kit, Fluorometric (BioVision, США) и ЛПС Е. coli (Sig-ma-Aldrich, США) в качестве субстрата, составила 7600 пМ PO мин-1 нМ-1.
4-
Удаление эндотоксина из препарата CRM197обработкой детергентом и хроматографической очисткой. Для
удаления эндотоксина препарат белка CRM197 смешивали с раствором Triton Х-114 в концентрации 2%, охлаждали до +4 °C для формирования гомогенной смеси, нагревали при t = 37 °C до разделения фаз и отбирали водную фазу, содержащую белок. Процедуру повторяли трижды.
Доочистку препарата проводили методом ВЭЖХ на колонке DEAE-Sepharose (GE Healthcare, США). Белок наносили в буфере, содержащем 20 мМ NaH2PO4 pH 7, и элюиро-вали 30-минутным градиентом NaCl от 20 до 500 мМ в том же буфере.
Проведение ферментативной депирогенизации фосфатазой LpxE. Обрабатывали препарат белка CRM197 фос-фатазой LpxE в течение 2 ч в растворе, содержащем 20 мМ трис-HCl pH 6,8, 100 мМ NaCl, при t = 30 oC в присутствии 0,1% Triton x-100. Фосфатазу добавляли к белку в массовом соотношении от 1:10 до 1:1000. По окончании инкубации реакционную смесь очищали от детергента и примесей фермента на колонке с керамическим ГАП, как описано выше.
Количественное определение содержания эндотоксина в препаратах белка CRM197. Для количественного определения содержания эндотоксина в препаратах белка CRM197 применяли тест с лизатом амебоцитов мечехвоста (ЛАЛ-тест). Тест проводили, используя набор Pierce LAL Chromogenic Endotoxin Quantitation Kit (Thermo Fisher Scientific, США) в соответствии с инструкциями производителя.
Кроличий тест на пирогенность препаратов белка CRM197. Тестирование пирогенности препаратов CRM197 проводили в кроличьем тесте в соответствии с МУК 4.1/4.2.588—96. Испытание каждого образца проводили на группе из 3 кроликов со стабильной исходной массой и температурой тела 38,5—39 °C. Температуру тела измеряли бесконтактным методом с использованием сканера (BMDS, США) и микрочипов, ранее имплантированных под кожу животных.
Для разведения препарата белка CRM197 использовали раствор 0,9% NaCl для инъекций. Образцы белка CRM197 (1 мг/мл) вводили в ушную вену из расчета 0,1 мл/кг массы тела животного. Температуру тела у кроликов измеряли каждые 30 мин в течение 3 ч.
В ходе исследования определяли максимальное повышение температуры (Д t) тела у кролика по сравнению с исходным значением. Препарат считали пирогенным, если хотя бы один кролик демонстрировал максимальное повышение температуры более чем на 0,6 °C либо если сумма индивидуальных максимальных повышений температур у всех кроликов данной группы превышала 1,4 °C.
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
GGT GCG GAT GAC GTT GTG GAC AGC TCT AAG AGC TTC GTG ATG GAA AAC TTC
AGC TCT TAC CAC GGC ACC AAG CCG GGT TAC GTG GAC AGC АТС CAG AAG GGT
АТС CAG AAG CCG AAG AGC GGT ACC CAG GGC AAC TAC GAT GAC GAT TGG AAG
GAG TTC TAC AGC AAC GAC AAC AAG TAC GAG GCG GCT GGT TAC AGC GTG GAC
ААС GAG AAC CCG CTG AGC GGT AAG GCC GGT GGC GTT GTG AAG GTT ACC TAC
ест GGT CTG ACC AAG GTG CTG GCC CTC AAG GTG GAC AAC АТС AAG AAA GAA
CTG GGT CTC AGC CTG ACC GAG CCG CTG ATG GAA CAG GTT GGT ACT GAA GAG
ТТС АТС AAG CGT TTC GGT GAT GGC GCA AGC CGT GTT GTG CTG AGC CTC CCG
ттт GCC GAA GGT AGC TCT TCC GTG GAA TTT АТС AAC AAT TGG GAG CAG GCC
AAG GCT CTG AGC GTG GAG АТС AAC TTC GAG ACC CGT GGT AAG CGT GGT CAG
GAC GCC ATG TAC GAA TAC ATG GCC CAG GCT TGC GCC GGT AAC CGT GTG CGC
CGT AGC GTT GGT GGC TCT AGC CTG TCC TGC АТС AAC CTG GAC TGG GAT GTG
АТС CGT GAC AAG ACC AAG АТС GAA AGC CTG AAG GAG CAC GGT CCT АТС AAG
ААС AAG AAT ATG AGC GAA TCT CCG AAC AAG ACC GTG AGC GAA GAG AAG GCG
AAA CAG TAC CTG GAA GAG TCC CAC CAG ACC GCC CTG GAA CAC CCT GAG CAC
CCG GAA CTG AGC GAG CTG AAG ACC GTG ACT GGT ACC AAC CCT GTG TTC GCC
GGT GCT AAC TAC GCT GCC TGG GCT GTG AAC GTT GCC CAG GTG АТС GAC AGC
GAG ACC GCC GAC AAC CTG GAG AAG ACC ACT GCG GCT CTG AGC АТС CTT CCT
GGT АТС GGT AGC GTG ATG GGT АТС GCC GAC GGT GTT CAC CAT AAC ACC GAA
GAG АТС GTG GCT CAG AGC АТС GCC CTG AGC TCT CTG ATG GTG GCC CAG GCT
АТС ест CTG GTG GGT GAA ТТТ GCC GCT TAC AAC TTC GTG GAG AGC АТС ATT
ААС CTG TTC CAG GTT GTG CAT AAC AGC TAC AAC CGT CCG TAT AGC CCG GGT
CAC AAG ACC CAG CCG TTC CTG CAC GAC GGT TAT GCC GTG AGC TGG AAC ACC
GAG GAC AGC АТС ATT CGT ACC CAG GGT GAG AGC GGT CAC GAC АТС AAG АТС
ACC GAA AAC ACC CCT CTG GGC АТС GCT GGT GTG CTT CTG CCG AAC АТС CCT
GGT AAG CTG GAC GTG AAC AAG AGC AAG ACC CAC АТС AGC GTG AAC GGT CGT
AAG CGC ATG CGT TGC CGC GCT АТС GAC GGT GAT GTG AAC TTC TGC CGT CCG
AAG AGC CCG GTG TAC GTT GGT AAC GGT GTC CAC GCT AAC CTG CAT GTG GCT
TTC CAC CGT AGC TCT GTT GCC TTC CAC CGT AGC TCT AGC GAG AAG АТС CAC
AGC AAC GAA АТС AGC TCT GAC AGC АТС GGT GTG CTG GGT TAC CAG AAG ACC
GTG GAC CAC ACC AAG GTG AAC AGC AAG CTG AGC CTG TTC TTT GAG АТС AAG
AGC
Рис. 1. Синтетическая последовательность ДНК, кодирующая продукцию белка CRM197, разработанная с учетом предпочтительной утилизации кодонов в Е. coli.
Анализ реактогенности препаратов CRM197. Для получения дендритных клеток мышей умерщвляли передозировкой эфирного наркоза, проводили выделение костного мозга из бедренных и берцовых костей по протоколу, описанному в работе [18]. Культивацию клеток вели на среде RPMI 1640 (Thermo Fisher Scientific, США), содержащей 10% фе-тальной сыворотки крупного рогатого скота, 1 мМ пирувата натрия, 10 мМ HEPES, 0,1 мМ 2-меркаптоэтанола и смесь антибиотиков (Antibiotic-Antimycotic, Thermo Fisher Scientific, США). Дифференциацию клеток костного мозга в дендритные клетки стимулировали в течение 10 дней добавлением гранулоцито-макрофагального колониестимулирующего фактора 2 (GM-CsF, Sigma, США) в концентрации 100 нг/ мл. К дендритным клеткам (5 • 105) добавляли обработанные и необработанные фосфатазой LpxE в массовом соотношении от 1:10 до 1:1000 фермента к белку препараты CRM197 (1/20 объема среды, 100 мкг/мл среды для культивации) и инкубировали в течение 24 ч. В качестве положительного и отрицательного контроля использовали необработанный и обработанный фосфатазой LpxE стандарт эндотоксина Е. coli O55:B5 (Sigma Aldrich, США) и препарат МФЛА (Invivo-Gen, США). Продукцию цитокинов IL-1ß, IL-6, IL-10 и TNFa определяли иммуноферментным анализом (ИФА) с использованием наборов производства Thermo Scientific (США).
Результаты
Продукция и очистка рекомбинантного CRM197 и LpxE F. tularensis. С учетом использования кодонов, предпочтитель-
ных для обеспечения высокоэффективной трансляции белка в Е. coli, проведен дизайн и ПЦР-синтез последовательности ДНК, кодирующей белок CRM197 (рис. 1). Полученный ПЦР-фрагмент клонирован в составе экспрессионной конструкции плазмиды pET22b(+) с получением экспрессионной плазмиды pET-CRM197, которая далее была использована для наработки белка CRM197 в бактериях Е. coli в виде нерастворимых телец включения. Уровень продукции CRM197 составил до 25% суммарного бактериального белка, по данным ДСН-ПААГ и денситометрии (500 мг с литра бактериальной культуры без ферментации). Отмывка телец включения с использованием детергента (1% Triton Х-100) и 2 М мочевины позволила достичь 75% чистоты белка. Чистота белка CRM197 после хроматографической очистки на тандемной системе колонок, упакованных CM- и Q-Sepharose, составила 90%, по данным ПААГ и денситометрии. Выход очищенного белка после процедуры рефолдинга и очистки на колонке с ГАП составил 75% количества белка, взятого на рефолдинг Белок обладал чистотой 98%, по данным ПААГ и денситометрии. Степень чистоты белка CRM197 на этапах его очистки из бактериальной биомассы показана на рис. 2, а.
Продукция и очистка белка LpxE F. tularensis в Е. coli проведена в соответствии с разработанной ранее методикой [15, 16]. В экспериментах использован активный фермент LpxE с чистотой 98%, по результатам ДСН-ПААГ и денситометрии, и выходом 230 мг с литра бактериальной культуры без ферментации (60% синтезированного белка) (рис. 2, б).
ORIGINAL ARTICLE
а б
100—► 50 —► 40 —► 1- - - __ CRM197 58,4 70 55 40 35 25 ttttt т LpxE 27
35 —► 25 —► 1 15
1 2 3 4 5 1 2
Рис. 2. Получение рекомбинантных белков CRM197 и LpxE F. Tularensis, кДа.
а — электрофореграмма препаратов CRM197 на этапах очистки белка; 1 — маркер молекулярной массы Spectra Broad Range Protein Ladder (Thermo Scientific, США); 2 — нерастворимая фракция лизата бактериальной биомассы продуцента BL-CRM197; 3 — препарат отмытых телец включения; 4 — элюат белка с колонки Q-Sepharose; 5 — элюат белка с колонки ГАП; б — электрофореграмма очищенного препарата рекомбинантной фосфатазы LpxE F. tularensis; 1 — маркер молекулярной массы SM0671 (Thermo Scientific, США); 2 — фосфатаза LpxE 12% ДСН-ПААГ, окрашивание Coomassie R-250.
Влияние обработки фосфатазой LpxE на уровень содержания эндотоксина и пирогенность препаратов белка CRM197. Активность бактериального эндотоксина в препарате CRM197, по результатам ЛАЛ-теста, составляет 500 МЕ/мг белка. Обработка препарата CRM197 с использованием классических подходов (экстракция Тгкоп-Х114 и анио-нообменная хроматография на сорбенте DEAE-Sepharose) привела к снижению уровня активности эндотоксина до 50 МЕ/мг белка, однако при повторной обработке препарата дальнейшего снижения не наблюдали. Потери целевого белка при такой обработке составляли около 50%. Активность эндотоксина в препаратах белка, обработанных фосфатазой LpxE, снижалась пропорционально количеству фосфатазы, использованной для обработки. Препарат белка CRM197, обработанный фосфатазой LpxE в массовом соотношении фосфатазы к белку CRM197 1:250, в ЛАЛ-тесте демонстрировал активность эндотоксина на уровне 25 МЕ/мг белка. Результаты измерения активности эндотоксина в препаратах CRM197 представлены в табл. 1.
Сравнение пирогенности препаратов белка CRM197 в
кроличьем тесте показало, что введение препарата CRM197, прошедшего обработку фосфатазой LpxE в массовом соотношении фосфатазы к белку CRM197 1:250, через 2 ч после введения вызывало у кроликов незначительный подъем температуры, практически не отличающийся от результатов, наблюдавшихся в контрольной группе животных, однако суммарный подъем температуры на 1,4 °С, позволяющий признать препарат пирогенным, происходил у кроликов при введении препарата CRM197, очищенного экстракцией Тгкоп-Х114 и анионообменной хроматографией на сорбенте DEAE-Sepharose. Максимальный подъем температуры (более чем на 1 °С у каждого из животных) наблюдали в группе кроликов, которым был введен препарат CRM197, не прошедший дополнительных раундов очистки. Результаты кроличьего теста приведены в табл. 2.
Влияние обработки фосфатазой LpxE на реактоген-ность препаратов белка CRM197. Тестирование реак-тогенности препаратов белка СГМ197 проводили на дендритных клетках мыши, дифференцировавшихся из клеток костного мозга под действием GM-CSF [19]. Определение
Активность эндотоксина в препаратах cRM197, обработанных и необработанных фосфатазой LpxE, по данным ЛАЛ
Таблица 1 теста
Препарат CRM197
Активность эндотоксина, МЕ/мг
Препарат CRM197, очищенный по стандартной методике, без разведения 500
Препарат CRM197, очищенный по стандартной методике с доочисткой экстракцией Triton Х-100 и анионообменной хро- 50 матографией, без разведения
Препарат фосфатазы LpxE, разведение 1:10 0,9% раствором NaCl для инъекций 10
Препарат CRM197, очищенный по стандартной методике, обработка LpxE, массовое соотношение фосфатаза/белок 1:10 25
Препарат CRM197, очищенный по стандартной методике, обработка LpxE, массовое соотношение фосфатаза/белок 1:50 25
Препарат CRM197, очищенный по стандартной методике, обработка LpxE, массовое соотношение фосфатаза/белок 1:100 25
Препарат CRM197, очищенный по стандартной методике, обработка LpxE, массовое соотношение фосфатаза/белок 1:250 25
Препарат CRM197, очищенный по стандартной методике, обработка LpxE, массовое соотношение фосфатаза/белок 1:500 100
Препарат CRM197, очищенный по стандартной методике, обработка LpxE, массовое соотношение фосфатаза/белок 1:1000 250
Отрицательный контроль: фосфатный буфер, использованный на финальном этапе хроматографической очистки белка > 5 CRM197
Иммунология. 2017; 38(1)
DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2017-38-1-19-26 ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Таблица 2
результаты кроличьего теста на пирогенность препаратов cRM197
Введенный препарат Кролик, № At, °C* Сумма At в группе
кроликов, °C
Препарат CRM197, очищенный по стандартной методике
Препарат CRM197, очищенный по стандартной методике с доочисткой экстракцией Triton Х-100 и анионообменной хроматографией, без разведения
Препарат CRM197, очищенный по стандартной методике, обработка LpxE, массовое соотношение фосфатаза/белок 1:250
Отрицательный контроль: 0,9% раствор NaCl для инъекций
1,3 1,5 1,1 0,5 0,4 0,5
0,2 0,3 0 0,1 0,2 0,1
3,9
1,4
0,5
0,4
Примечание. * — рассчитано по сумме трех измерений через 2 ч после введения препарата, ошибка составила ±0,2 °С.
выброса цитокинов ГЬ-ф, ГЬ-6, ГЬ-10 и TNFa оценивали в ИФА при добавлении 3 препаратов CRM197, включая препарат, выделенный стандартным методом, препарат, очищенный экстракцией Тгйоп-Х114 и анионообменной хроматографией на DEAE-Sephаrose, и препарат, обработанный фосфатазой LpxE. Результаты приведены на рис. 3.
Данные измерений свидетельствуют, что секреция про-воспалительных цитокинов в случае добавления к клеткам препарата белка CRM197, обработанного фосфатазой LpxE, отсутствовала или была существенно ниже, чем в случае добавления препаратов белка, выделенных стандартным методом или с экстракцией Triton-X114 и анионообменной хроматографией на DEAE-Sepharose. Обработки ферментом LpxE препарата белка CRM197 в массовом соотношении 2:250 было достаточно для полного подавления выброса провоспалительных цитокинов в модели активации дендритных клеток.
Обсуждение
Созданию продуцентов белка CRM197 в Е. coli посвящен ряд исследований [20, 21], но в большинстве из них вопрос снижения пирогенности и реактогенности препаратов CRM197 не обсуждают. Как правило, CRM197 получают в Е. coli в виде нерастворимых телец включения. В одной из недавних работ приводят данные о получении растворимого CRM197 на фоне оверэкспрессии цитоплазматических шаперонов [22]. Однако преимущества синтеза растворимого белка относительны. Во-первых, выход растворимого CRM197 значительно ниже, чем белка, включающегося в нерастворимую фракцию (150 против 700—1000 мг/л). Во-вторых, необходимость удаления примесей, в частности прочно связанного ЛПС, делает денатурацию белка предпочтительной, при этом рефолдинг не представляет трудностей и проходит с выходом около 90%. В-третьих, возможность проведения отмывки телец включения сокращает число хроматографических процедур и потери целевого белка.
Недавно опубликованная методика удаления эндотоксина из препарата CRM [20] несет в себе ряд противоречий. При наличии указания на необходимость рефолдинга бел-
35 30" 25" 2015-
ю-
5-
о-
3,5-
IL-6
t 2,5-
к
§ 2 S. 1,5-
I 1"
I 0,5-
12 3 4
5 6 7 TNF-a
8 9 10 11 12
^ 0,3,
| 0,25-
оГ 0,2-s
га 0,15-
I 0.1"
I 0,55 0-
IL-1ß
1 2 3 4 5
6 7 IL-10
8 9 10 11 12
о
о
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
3,5 п
з- 2,5- 1 1 \
2 | 1
1,5- | 1 1
1 - 1 1 1
0,5- 1 р \ i
о- — , 2 , V
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Рис. 3. Результаты ИФА по определению уровня продукции провоспалительных цитокинов дендритными клетками мыши через 24 ч после инкубации с препаратами рекомбинантного белка CRM197.
По оси абсцисс — следующие варианты агентов, исследованных на стимуляцию дендритных клеток к продукции цитокинов: 1 — среда RPMI 1640, нестимулированные клетки (отрицательный контроль); 2 — ЛПС Е. coli O55:B5 (Sigma-Aldrich, США) 50 ME эндотоксина (ЛАЛ-тест), 5 нг (положительный контроль); 3 — ЛПС Е. coli O55:B5, 50 МЕ эндотоксина (ЛАЛ-тест), 5 нг, обработанный рекомбинантной фосфатазой LpxE F. tularensis в массовом соотношении 1:10; 4 — МФЛА (InvivoGen, США), 5 нг; 5 — препарат CRM197, очищенный по стандартной методике, 50 МЕ эндотоксина (ЛАЛ-тест), 100 мкг; 6 — препарат CRM197, дополнительно очищенный экстракцией Triton Х-100 и ионообменной хроматографией, 5 МЕ эндотоксина (ЛАЛ-тест), 100 мкг; 7—12 — препарат CRM197, 50 МЕ эндотоксина (ЛАЛ-тест), 100 мкг, обработанный рекомбинантной фосфатазой LpxE F. tularensis в массовом соотношении 1:1000 (7), 1:500 (8), 1:250 (9), 1:100 (10), 1:50 (11) и 1:10 (12).
ка методика не приведена. Описанный в работе способ гидрофобной жидкостной хроматографии высокого давления (ГФ-ЖХВД) в предположительно денатурирующих условиях может быть эффективным методом депирогенизации, учитывая высокую гидрофобность ЛПС. Однако препаративная ГФ-ЖХВД — дорогостоящая процедура: стоимость твердой фазы ГФ-ЖХВД (SOURCE15 или аналогов) в пересчете на удельную емкость этой фазы превосходит стоимость ионообменных и металл-хелатных носителей более чем на порядок, а срок службы в агрессивных хаотропных средах, применяемых для солюбилизации белка и его диссоциации от ЛПС, существенно меньше, чем срок службы носителей на основе модифицированной агарозы или дек-страна.
Гель-фильтрационная хроматография также малоэффективна при промышленной технологии очистки белка. Потери при финальной очистке CRM197 гель-фильтрацией достигают 50% [21].
Полученный в рамках данного исследования продуцент BL-CRM197 обладал высоким уровнем синтеза целевого белка. Поскольку в рамках разрабатываемой системы очистки требовалось достичь максимального выхода белка в нерастворимой форме, наращивание бактериальной биомассы и наработку белка CRM197 штаммом BL-CRM197 вели при одинаковой оптимальной для бактерий температуре 37 °C.
Продуцент формировал плотные тельца включения, полное растворение которых происходило только высокощелочном растворе (pH 11) под действием жесткого хао-тропного агента (6 М гуанидин хлорид) при разрушении произвольно сформированных дисульфидных связей в присутствии 10 мМ ДТТ. В дальнейшем растворимость белка поддерживалась в растворе 8 М мочевины и 1 мМ ДТТ. Денатурированный белок очищали на тандемной системе из 2 колонок, упакованных CM-Sepharose и Q-Sepharose. Поскольку CRM197 имеет большой нетто-отрицательный заряд, белок связывался с колонкой Q-Sepharose, несмотря на то, что pH буфера был близок к нейтральному (6,8), в то время как многие примеси задерживались на катионооб-менной колонке с CM-Sepharose, повышая эффективность разделения фракций на анионообменном сорбенте. Элюция градиентом концентрации NaCl при pH 6,8 приводила к выходу целевого белка из колонки в начале градиента (150 мМ соли), что позволяло успешно отделить фракцию не связанного с белком эндотоксина, смываемую концентрацией NaCl в диапазоне 350—500 мМ.
Важное значение в успешной очистке CRM197 имело использование керамического ГАП — относительно недорогого сорбента с уникальными характеристиками. Элюция с ГАП с одновременным изменением 2 параметров — концентрации фосфата и pH — была применена авторами ранее [23]. Качество очистки повышено промывкой сорбента 2 М раствором NaCl при низком значении pH. При этом происходило удаление как белковых, так и небелковых примесей (пигментов, части эндотоксинов).
Несмотря на высокую степень очистки белка CRM197 (98%, по данным ДСН-ПААГ), активность эндотоксина в препарате CRM197, по данным ЛАЛ-теста, составила 500 МЕ/мг белка. Известно, что ряд белков различных организмов обладают высокой степенью сродства к эндотоксинам Е. coli [1—3]. Такие белки при продукции в е. coli требуют разработки специальных дорогостоящих процедур очистки для обеспечения соответствия требованиям к инъекционным препаратам.
В препаратах терапевтических белков, не используемых для внутривенного введения (например, компонентов вакцин, в том числе конъюгированных), физическое удаление эндотоксина можно заменить его конверсией в МФЛА, малотоксичное производное, обладающее значи-
ORIGINAL ARTICLE
тельным адъювантным эффектом. Химическая конверсия ЛПС в МФЛА проводится в жестких условиях и может привести к деградации белка. Нами и другими авторами описана продукция и очистка фермента LpxE, специфически дефосфорилирующего ЛПС е. coli и конвертирующего его в МФЛА [14—16]. Активность полученного нами фермента LpxE позволяет использовать его для депироге-низации белка CRM197 в массовом соотношении 1:250. Невысокое содержание белка фермента и значительное отличие значения его изоэлектрической точки от такового целевого белка (5,83 для CRM197 и 9,61 для LpxE) позволяют эффективно удалить примесь LpxE ионообменной хроматографией. Полученный препарат содержит МФЛА, обладающий адъювантным эффектом и потенциально усиливающий действие вакцин, которые будут впоследствии синтезированы на основе конъюгирования небелковых антигенов бактерий с CRM197.
Сравнительный анализ пирогенности и реактогенности препаратов, содержащих ЛПС и МФЛА, имеет методические ограничения. Классический ЛАЛ-тест не может служить свидетельством активности эндотоксина после обработки ЛПС ферментом LpxE, поскольку эффективность полимеризации ЛАЛ под действием МФЛА не намного меньше, чем под действием интактного ЛПС [24]. Кроличий тест на пирогенность дает качественное представление об активности эндотоксина в препарате, но его результат может значительно варьировать в зависимости от целого спектра условий. Поэтому помимо качественной модели для определения присутствия эндотоксина в препаратах CRM197 использовали свойство интакт-ного ЛПС индуцировать выброс иммунокомпетентыми (дендритными) клетками in vitro провоспалительных цитокинов IL-1ß, IL-6, IL-10 и TNFa в сравнении с МФЛА, который практически не вызывает подобного цитокинового ответа [25]. Отмечено, что обработка LpxE эффективно снижает способность препарата CRM197 активировать выброс цитокинов, указывая на конверсию ассоциированного с CRM197 ЛПС в МФЛА.
Заключение
В рамках исследования сконструирован штамм-продуцент Е. coli BL-CRM197 и разработана методика хроматографиче-ской очистки белка-партнера для создания конъюгированных вакцин CRM197 из телец включения, предусматривающая выделение белка на тандемной системе ионообменных колонок CM- и Q-Sepharose, рефолдинг и финальную доочистку на керамическом ГАП. В соответствии с данной методикой получен препарат рекомбинантного белка CRM197 с чистотой более 98%, по данным ДСН-ПААГ и денситометрии, и содержанием эндотоксина не более 500 ME/мг, по данным ЛАЛ-теста. С использованием кроличьего теста и методом ИФА на модели продукции провоспалительных цитокинов IL-1ß, IL-6, IL-10 и TNFa дендритными клетками мыши под действием бактериального ЛПС показано, что обработка препарата белка CRM197 рекомбинантной липид-1а-фосфатазой LpxE F. tularensis устраняет пирогенность и реактогенность белкового препарата за счет дефосфорилирования основного компонента ЛПС Е. coli липида A и его конверсии в нереакто-генное производное МФЛА. Полученные данные позволяют рассматривать ферментативную обработку фосфатазой LpxE в качестве перспективной промышленной стратегии снижения реактогенности синтезированных в Е. coli рекомбинантных белков, используемых для получения иммунобиологических препаратов.
Финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке Минобрнауки России в рамках Соглашения о субсидии от 27июня 2014 г. №14.604.21.0067 (уникальный идентификатор соглашения RFMEFI60414X0067).
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
литература
15. Колесников А.В., Козырь А.В., Рябко А.К., Лисицкая Л.А., Зе-нинская Н.А., Марьин М.А., Шемякин И.Г. Способ получения рекомбинантной фосфатазы бактериальных липополисахари-дов. Заявка на Патент РФ № 2015156682; 2015.
16. Марьин М.А., Козырь А.В., Колесников А.В., Рябко А.К., Лисицкая Л.А., Зенинская Н.А. и др. Способ получения рекомбинантной фосфатазы для модификации бактериальных эндотоксинов. В кн.: Материалы vIII Российского ежегодного конгресса по инфекционным болезням. М.; 2016.
17. Кополадзе Р. А. Регламентация экспериментов на животных — этика, законодательства, альтернативы. Успехи физиологических наук. 1998; 29(4): 74—89.
20. Духовлинов И.В., Федорова Е.А., Богомолова Е.Г., Добровольская О.А., Черняева Е.Н., Аль-Шехадат Р.И. и др. Получение рекомбинантного белка CRM197 в клетках E. coli. Инфекция и иммунитет. 2015; 5(1): 37—44.
references
1. Habich C., Kempe K., van der Zee R., Rumenapf R., Akiyama H., Kolb H. et al. Heat shock protein 60: specific binding of lipopolysac-charide. J. Immunol. 2005; 174(3): 1298—305.
2. Wilson M.J., Haggart C.L., Gallagher S.P., Walsh D. Removal of tightly bound endotoxin from biological products. J. Biotechnol. 2001; 88(1): 67—75.
3. Dudley A., McKinstry W., Thomas D., Best J., Jenkins A. Removal of endotoxin by reverse phase HPLC abolishes anti-endothelial cell activity of bacterially expressed plasminogen kringle 5. Biotechniques. 2003; 35(4): 724—6, 728, 730.
4. Marshall J.C. Lipopolysaccharide: an endotoxin or an exogenous hormone? Clin. Infect. Dis. 2005; 41(7): 470—80.
5. Galen J.E., Simon R., Ernst R.K. Salmonella expressing detoxified lipopolysaccharide is immunogenic and protective both as an attenuated vaccine and for delivery of foreign antigens. Expert Rev. vaccines. 2011; 10(12): 1679—82.
6. Raetz C.R., Reynolds C.M., Trent M.S., Bishop R.E. Lipid a modification systems in gram-negative bacteria. Annu. Rev. Biochem. 2007; 76: 295—329.
7. Stark R., Choi H., Koch S., Lamb F., Sherwood E. Monophosphoryl lipid A inhibits the cytokine response of endothelial cells challenged with LPS. InnateImmun. 2015; 21(6): 565—74.
8. Casella C.R., Mitchell T.C. Putting endotoxin to work for us: monophosphoryl lipid A as a safe and effective vaccine adjuvant. Cell. Mol. Life Sci. 2008; 65(20): 3231—40.
9. Ongkudon C.M., Chew J.H., Liu B., Danquah M.K. Chromatographic removal of endotoxins: a bioprocess engineer's perspective. ISRN Chromatography. 2012; 2012. 8 Available at: https://www.hindawi. com/journals/isrn/2012/649746/.
10. Basto A.P., Morais J., Marcelino E., Leitao A., Santos D.M. An efficient depyrogenation method for recombinant bacterial outer membrane lipoproteins. ProteinExpr. Purif. 2014; 98: 10—7.
11. Issekutz A.C. Removal of gram-negative endotoxin from solutions by affinity chromatography. J. Immunol. Meth. 1983; 61(3): 275—81.
12. Magalhaes P.O., Lopes A.M., Mazzola P.G., Rangel-Yagui C., Penna T.C.V., Adalberto Pessoa A. Jr. Methods of endotoxin removal from biological preparations: a review. J. Pharm. Pharmaceut. Sci. 2007; 10(3): 388—404.
13. Patil H.P., Murugappan S., ter Veer W., Meijerhof T., de Haan A., Fri-jlink H.W. et al. Evaluation of monophosphoryl lipid A as adjuvant for pulmonary delivered influenza vaccine. J. Control. release. 2014; 174: 51—62.
14. Karbarz M.J., Six D.A., Raetz C.R. Purification and characterization of the lipid A 1-phosphatase LpxE of Rhizobium leguminosarum. J. Biol. Chem. 2009; 284(1): 414—25.
15. Kolesnikov A.V., Kozyr A.V., Ryabko A.K., Lisitskaya L.A., Zen-inskaya N.A. Mar'in M.A., Shemyakin I.G. Method of producing a recombinant phosphatase of bacterial lipopolysaccharides. Patent application RF №2015156682; 2015. (in Russian)
16. Mar'in M.A., Kozyr A.V., Kolesnikov A.V., Ryabko A.K., Lisitskaya L.A., Zeninskaya N.A. et al. A method of producing a recombinant phosphatase for the modification of bacterial endotoxins. In: Proceedings of the vIII annual Russian Congress on infectious diseases. [Materialy VIII rossiyskogo ezhegodnogo kongressa po infektsion-nym boleznyam]. Moscow; 2016. (in Russian)
17. Kopaladze R.A. Regulation of animal experimentation — ethics, legislation, alternatives. Uspehi fiziologicheskih nauk. 1998; 29(4): 74—89. (in Russian)
18. Swamydas M., Lionakis M.S. Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. J. Vis. Exp. 2013; (77):e50586. Available at: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3732092/.
19. Cui W., Joshi N.S., Liu Y., Meng H., Kleinstein S.H., Kaech S.M. TLR4 ligands LPS and MPLA differentially regulate effector and memory CD8+ T cell differentiation. J. Immunol. 2014; 192(9): 4221—32.
20. Dukhovlinov I.V., Fedorova E.A., Bogomolova E.G., Dobrovol'skaya O.A., Chernyaeva E.N., Al-Shekhadat R.I. et al. The preparation of recombinant protein CRM197 in E. coli cells. Infektsiya i immunitet. 2015; 5(1): 37—44. (in Russian)
21. Stefan A., Conti M,, Rubboli D., Ravagli L., Presta E., Hochkoep-pler A. Overexpression and purification of the recombinant diphtheria toxin variant CRM197 in Escherichia coli. J. Biotechnol. 2011; 156(4): 245—52.
22. Mahamad P., Boonchird C., Panbangred W. High level accumulation of soluble diphtheria toxin mutant (CRM197) with co-expression of chaperones in recombinant Escherichia coli. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2016; 100(14): 6319—30.
23. Kolesnikov A.V., Kozyr A.V., Alexandrova E.S., Koralewski F., Demin
A.V., Titov M.I. et al. Enzyme mimicry by the antiidiotypic antibody approach. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000; 97(25): 13526—31.
24. Takayama K., Qureshi N., Raetz R.H., Ribi E., Peterson J., Cantrell J.L. et al. Influence of fine structure of lipid A on Limulus amebocyte lysate clotting and toxic activities. Infect. Immun. 1984; 45(2): 350—5.
25. Schülke S., Flaczyk A., Vogel L., Gaudenzio N., Angers I., Löschner
B. et al. MPLA shows attenuated pro-inflammatory properties and diminished capacity to activate mast cells in comparison with LPS. Allergy. 2015; 70(10): 1259—68.
Поступила 22.10.16 Принята в печать 03.11.16
