CC BY
17
ДИАГНОСТИКА
УДК 616.932:616-093/-098
Я.А.Кибирев, И.В.Дармов, М.А.Логинова, И.В.Маракулин, Д.А.Чухланцев, Т.И.Дормидонтова,
С.Л.Кузнецов, А.В.Кузнецовский
РАЗРАБОТКА ТЕСТ-СИСТЕмы Для ТИпИРОвАНИя шТАммОв V. CHOLERAE С пОмОщью VNTR-АНАЛИЗА
ФГУ «48 Центральный научно-исследовательский институт Министерства обороны
Российской Федерации», Киров
Для типирования штаммов V. ско1егае, депонированных в музее микробных культур ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России», применен метод мультилокусного У№Ш-анализа. Выбраны наиболее информативные ло-кусы и фланкирующие их праймеры, составлены У№Ш-профили и проведен анализ аллельного разнообразия исследованных штаммов, выпущены лабораторные серии тест-системы. Разработанная тест-система может быть использована для мониторинга эпидобстановки, при проведении эпидемиологических расследований, а также для паспортизации коллекционных штаммов.
Ключевые слова: V. ско1егае, У№Ж-анализ, тест-система
Ya.A.Kibirev, I.V.Darmov, M.A.Loginova, I.V.Marakulin, D.A.Chukhlantsev, T.LDormidontova, S.L.Kuznetsov, A.V.Kuznetsovskii
Development of VNTR-Based Test System for V cholerae Typing
Russian Federation Ministry of Defense 48 Central Research Institute
Analysis of VNTRs was used for typing of V cholerae strains deposited in microbial culture collection of 48 Central Research Institute. The most informative loci and flanking primers were chosen, VNTR profiles were compiled, and allele variability analysis of the strains was carried out. Laboratory series of test system were manufactured . The developed test system can be used for epidemiological monitoring and investigations, as well as for passportization of collection strains.
Key words: V. cholerae, VNTR, test system.
Холера была и остается до настоящего времени одной из самых опасных и распространенных инфекций бактериальной природы, унесшей многие миллионы человеческих жизней практически во всех странах мира.
В период с 1817 по 1926 год отмечено шесть крупных пандемий классической (азиатской) холеры, вызванных Vibrio cholerae cholerae. После почти 35-летнего отсутствия эпидемического распространения холеры в 1961 г. вспыхнула и продолжается до настоящего времени седьмая пандемия, обусловленная новой разновидностью возбудителя V. cholerae eltor [1, 4].
Для Российской Федерации и стран СНГ проблема борьбы с холерой в настоящее время является крайне актуальной: практически ежегодно регистрируются спорадические случаи заболевания и крупные вспышки, преимущественно связанные с заносом (завозом) инфекции, отмечено возможное укоренение холеры в южных регионах страны, появление стертых форм заболевания, а также регулярное выделение холерных вибрионов из объектов внешней среды [2].
Целью настоящей работы являлась разработка тест-системы для VNTR-типирования штаммов V. cholerae.
Материалы и методы
Исследовали 45 штаммов V. екоіегае, выделенных в различные годы и депонированных в музее микробных культур ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России», из них 24 штамма вибрионов серогруппы О1, 13 - серогруппы О139 и 18 - серогруппы не-О1.
Для VNTR-типирования штаммов V. екоіегае, основываясь на представленных в международной базе данных последовательностях вариабельных ло-кусов [3], были выбраны олигонуклеотидные праймеры, фланкирующие 10 VNTR-локусов, краткие характеристики которых представлены в табл. 1.
С целью оценки пригодности выбранных локу-сов для типирования штаммов V. екоіегае в предварительных исследованиях был проведен VNTR-анализ 45 штаммов V. екоіегае из коллекции микробных культур ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России».
Для VNTR-анализа использовали хромосомную ДНК штаммов V. екоіегае, выделенную по методу Мармур из агаровых культур, выращенных при температуре (36±1) °С в течение (16±2) ч. Для оценки стабильности выбранных VNTR-локусов в геноме холерного вибриона проводили сравнительный анализ VNTR-профилей исходных культур исследуемых штаммов V. екоіегае и культур, полученных после
Таблица 1
VNTR-локусы и последовательности фланкирующих праймеров, использованные в исследовании
Таблица 2
Вариабельность VNTR-локусов у изученных штаммов V cholerae
Локус
Тандемный повтор
Последовательности праймеров
Vc1 aacaga 5і cca aac cac tgc aac gga та 3/ б/ tcg gtc ggt ttc tct tgt tc 3/
Vc2 accaga 5і gaa tca aag act tta gag gat tt 31 5і tga gtt tct ttg gag gta gc 31
Vc3 tgctgt 5і ctt gct cct gag ctg tat tt 31 5/ cac aat tta gac gtg gtc aa 3/
Vc4 gacccta 5і aac tgc tga ata agc caa gt 31 5і tga gaa cgt aga tcc cag aa 3
Vc5 gataatcca 5і gtt ttc ggc gtg gct gga та 3і 5і tcg ctg tac gcc ttt cct gt 3
Vc6 ccataaaaccttag 5і cgc ttg aag cgc tgc ttg ac 31 5і ctt атс gat cgt tta gcg gca та 3і
Vc7 gctcatggttaactt 5і aac gct tca caa aac gac tgc 31 5і cgc cac acc atg agt gaa ga 3
Vc8 aagtaagaggggataaa 5і ctg aaa ggc aag act cat aaa cg 3 5і ccc agt tta gcg aac cag ac 31
Vc9 tcaatcccattaccgcataaacgc 5і tgc aat ctg tta ogc аса ctc 3 5і gct caa gta gcg ggt tat cg 3
Vc10 taaatacctgaccaaaagagtcaaa 5і ata tct tgc gtg gga tct та 3і 5і acc gca tat ctt cct tta ga 3
Локус Количество аллельных вариантов Индекс разнообразия Нея
Vcl 9 0,8056
Vc2 16 0,8484
Vc3 16 0,9092
Vc4 9 0,7810
Vc5 9 0,8307
Vc6 4 0,6006
Vc7 3 0,2808
Vc8 1 -
Vc9 2 0,3432
Vc10 1 -
десяти пересевов в жидкой питательной среде.
При постановке ПЦР готовили реакционную смесь, содержащую 0,25 мМ каждого из дезок-синуклеозидтрифосфатов, 0,5 ед. фермента Taq-полимеразы, буферный раствор для ПЦР, производства ЦНИИ Эпидемиологии, 7,5 мМ хлористого магния, 10 пкМ каждого праймера, 10 нг хромосомной ДНК одного из исследуемых штаммов. Общий объем реакционной смеси составлял 25 мкл. Олигонуклеотидные праймеры были синтезированы специалистами ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России» фосфоамидитным методом на синтезаторе АСМ-102У («Биоссет», Новосибирск).
Режим термоциклирования реакционной смеси состоял из первичной денатурации (94 °С, 5 мин), 5 циклов, включающих денатурацию (94 °С, 20 с), отжиг (57 °С, 10 с) и элонгацию (72 °С, 5 с), и 35 циклов, включающих денатурацию (94 °С, 5 с), отжиг (57 °С, 5 с) и элонгацию (72 °С, 5 с). Для локусов Vch2 и Vch3 задаваемая температура отжига составляла 53 °С.
Разделение продуктов ПЦР (10 мкл амплифика-ционной смеси) проводили в 8 % неденатурирующем ПААГ. В качестве маркеров молекулярных масс ДНК использовали полученные в ходе отработки методики VNTR-анализа штаммов V. cholerae аллельные «лестницы», представляющие собой смесь аллелей каждого анализируемого локуса.
Определение аллотипа исследуемых штаммов проводили путем сравнения молекулярной массы амплифицированных в ПЦР VNTR-локусов с молекулярной массой фрагментов аллельной «лестницы» при электрофоретическом разделении в ПААГ.
Результаты и обсуждение
Анализ'У^^-профилейисследованныхштаммов
Примечание. Индекс разнообразия Нея определяется по формуле: DI=1-£р2 , где DI - индекс разнообразия Нея; р - частота встречаемости аллеля (отношение числа аллелей данного типа к общему числу аллелей).
V. cholerae показал, что все выбранные VNTR-локусы, амплифицированные в ПЦР с выбранными праймерами (за исключением локусов Vc8 и Vc10), обладают достаточным полиморфизмом (табл. 2). Наибольшее число аллельных вариантов - по 16, было выявлено при амплификации последовательностей локусов Vc2 и Vc3. При амплификации последовательностей локу-сов Vc1, Vc4 и Vc5 было выявлено по 9 аллельных вариантов. Более консервативны оказались локусы Vc6, Vc7 и Vc9, при амплификации последовательностей которых было выявлено 4, 3 и 2 аллельных варианта соответственно. Однако только для локусов Vc7 и Vc9 индекс разнообразия Нея составил менее 0,5. Локусы Vc8 и Vc10, имеющие по 1 аллельному варианту, были исключены из дальнейших исследований.
Для оценки стабильности выбранных VNTR-локусов исследуемых штаммов их культуры десятикратно пересевали в жидкой питательной среде во флаконах. После каждого пересева культуры инкубировали при температуре (36±1) °С в течение (16±2) ч. Выделенные после десятого пересева культуры использовали для VNTR-анализа. Полученные результаты показали полную идентичность VNTR-профилей всех исходных культур и культур, подвергнутых многократным пересевам. Это позволяет утверждать, что выбранные VNTR-локусы стабильно наследуются холерным вибрионом, а полученные VNTR-профили являются уникальными для каждого из исследованных штаммов.
Полученные данные позволили обосновать компонентный состав и разработать тест-систему для типирования штаммов V. cholerae методом VNTR-анализа (табл. 3).
Использование данной тест-системы позволит создать базу данных, содержащую сведения о VNTR-профилях штаммов V. cholerae, депонированных в коллекциях микробных культур. Включение сведений о VNTR-профилях в паспорта музейных культур
Таблица 3
Компонентный состав тест-системы для штаммовой дифференциации возбудителя холеры с помощью мультилокусного VNTR-анализа
Растворы праймеров для амплификации каждого локуса
Контрольный препарат ДНК
Маркеры молекулярной массы по каждому локусу
10хбуферный раствор
Раствор дезоксирибонуклеозид-трифосфатов
Раствор Taq-полимеразы
Минеральное масло
Бидистиллированная вода
V. cholerae будет являться важной идентификационной характеристикой депонированных штаммов. Разработанная тест-система также может использоваться при проведении мониторинга эпидобстановки в регионах, эндемичных по холере, и при эпидемиологических расследованиях вспышек этой инфекции.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Покровский В.И., Онищенко ГГ., редакторы. Актуальные проблемы холеры. М.: ГОУ ВУНМЦ МЗ РФ; 2000. 384 с.
2. Покровский В.И., редактор. Холера в СССР в период VII пандемии. М.: Медицина; 2000. 472 с.
3. GPMS. Genomes, Polymorphism and Minisatellites with a focus on Molecular Epidemiology using Tandem Repeats [Internet]. Available from: http://minisatellites.u-psud.fr.
4. Kaper, J.B., Morris J.G., Levine M.M. Cholera. Clin. Microbiol. Rev. 1995; 8:48-86.
References (Presented are the Russian sources in the order of citation in the original article)
1. Pokrovskii VI., Onishchenko G.G., editors. [Actual Issues of Cholera]. M.:Minzdrav RF; 2000. 384 p.
2. Pokrovskii VI., editor. [Cholera in the USSR During VII Pandemic]. M.: Meditsina; 2000. 472 p.
3. The Microorganisms Tandem Repeats Database. Available from: http://minisatellites.u-psud.fr/ASPSamp/base_ms/bact.php.
Authors:
Kibirev Ya.A., Darmov I.V., Loginova M.A., Marakulin I.V., Chukhlantsev D.A., Dormidontova T.I., Kuznetsov S.L., Kuznetsovskii A.V. Russian Federation Ministry of Defense 48 Central Research Institute. Kirov.
Об авторах:
Кибирев Я.А., Дармов И.В., Логинова М.А., Маракулин И.В., Чухланцев ДА., Дормидонтова Т.И., Кузнецов С.Л., Кузнецовский А.В. 48 Центральный научно-исследовательский институт Министерства обороны Российской Федерации. Киров.
Поступила 11.10.10.
Объем Количество
Наименование компонента компонента, микропроби-
см3 рок, шт.
0,06 8
0,1 1
0,1 8
0,6 1
0,6 1
0,12 1
2,0 4
2,0 1
