CC BY
69
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ В БИОЛОГИИ И МЕДИЦИНЕ
УДК 615.32-092:616.61
Т.А. Ажунова С.В. Лемза А.О. Занданов 2, З.Г. Самбуева С.М. Николаев Е.Д. Гармаева 1
ФАРМАКОТЕРАПЕВТИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ РАСТИТЕЛЬНЫХ ЭКСТРАКТОВ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ПОВРЕЖДЕНИИ ПЕЧЕНИ
1 Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, Улан-Удэ 2 Бурятский государственный университет, Улан-Удэ
Растительные экстракты нормализуют активность системы гидроксилирования и деятельность дыхательной цепи ЭПР. Под их влиянием в микросомах сохраняется функционально активный и стабильный цитохром. Р-450. Фармакотерапевтическая эффективность обусловлена ингибированием процессов перекисного окисления липидов.
Ключевые слова: растительные экстракты, цитохром Р-450, детоксицирующая функция печени
PARMACOTHERAPEUTIC EFFICACY OF PLANT EXTRACTS IN EXPERIMENTAL LIVER DAMAGES
T.A. Azhunova S.V. Lemza A.O. Zandanov 2, Z.G. Sambueva S.M. Nikolaev
E.D. Garmaeva 1
11nstitute of General and Experimental Biology, SB RAS, Ulan-Ude
2Buryat State University, Ulan-Ude
Plant extracts normalize activity of the hydroxylation system, and the work of the respiratory chain. Under their unfluence, functional activity and stability of cytochrome P-450 are supported. Pharmacotherapeutic efficacy is provided by inhibition of lipid, peroxidation.
Key words: plant extracts, cytochrome P-450, detoxicating function of the liver
В настоящее время в Российской Федерации болезни органов пищеварения занимают третье место по распространенности среди основных классов болезней сразу после болезней органов дыхания и системы кровообращения [10]. В связи с этим возрастает актуальность поиска новых лекарственных препаратов, обладающих гепато-защитными свойствами, в частности, фитопрепаратов, которые имеют широкий диапазон действия и обладают такими важными преимуществами, как малая токсичность, высокая эффективность, доступность, взаимозаменяемость и возможность длительного применения без побочных проявлений [3].
Клевер лупиновый (Trifolium lupinaster L.). В надземной части клевера лупинового содержится 100—140 мг % аскорбиновой кислоты, 17,07 % протеина, 2,33 % жира, 34,04 % клетчатки, 23,4 мг/г флавоноидов [2]. Выделено и идентифицировано около 20 соединений флавоноидной природы, являющихся флавонолами и изофлавонолами. В народной медицине клевер лупиновый применяют в качестве ранозаживляющего и противовоспалительного средства [5]. Цветки употребляют в виде отвара и чая в качестве мочегонного, антисептического и отхаркивающего средства. Их применяют
при малокровии и похудании, лихорадке, простуде, хроническом ревматизме, легочных заболеваниях, туберкулезе. Наружно в виде припарок клевер назначают при нарывах и ожогах как мягчительное и болеутоляющее средство. В тибетской медицине траву клевера лупинового используют при желтухе и в качестве мочегонного средства [6].
Шлемник байкальский (Scutellaria baicalensis Georgi.). В качестве сырья для медицинских целей используют корни шлемника вместе с корневищами. Во всех органах шлемника байкальского найдены флавоноиды: общее содержание флаво-ноидных соединений в корнях составляет более 10 %, а в надземной части — до 10 %. Они представлены флавонолами, флавонами и оксифлавонами [2]. Кроме флавоноидных соединений, в корнях найдено до 2,5 % дубильных веществ пирокатехи-нового ряда, смолы, эфирные масла. В народной медицине шлемник байкальский применяется как кровоостанавливающее средство, при острых и хронических инфекциях, остром ревматизме, миокардитах, гипертонической болезни, гриппе, пневмонии, воспалительных процессах желудочнокишечного тракта [5]. В китайской медицине его используют как седативное, жаропонижающее, противосудорожное и укрепляющее средство [6].
В Монголии шлемник применяется как кровоостанавливающее, регулирующее обмен веществ и замедляющее процессы старения средство [6]. В тибетской медицине корни шлемника байкальского входят в состав сложных лекарственных смесей, используемых для лечения острых и хронических инфекционных заболеваний, при болезнях печени и желчного пузыря [6].
Толокнянка обыкновенная (Arctostaphylos uva-ursi (L.) Spreng.). В листьях толокнянки обыкновенной содержится от 11,0 до 19,4 мг/г флавоноидов: кверцетин, изокверцетин, гиперозид, мирицитин, а также органические кислоты, дубильные вещества пирогалловой группы. Содержание гликозида арбутина и свободного гидрохинона в листьях толокнянки колеблется от 11 до 18 %, количество танидов составляет 25,9 — 27,5 %, аскорбиновой кислоты — 134,6—193,6 % [2]. В народной медицине листья толокнянки используют при водянке, в качестве средства, нормализующего сон и болеутоляющего при ревматизме. В тибетской медицине листья толокнянки употребляются при болезнях печени и как желчегонное средство [6].
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Экстракты из указанных растительных средств получены по ресурсосберегающей технологии и представляют собой легкорастворимые аморфные порошки от светло- до темно-коричневого цвета. Исследования проводили на крысах линии Wistar обоего пола с исходной массой 160 — 210 г. Содержание животных и проведение экспериментальных исследований осуществлялось в соответствии с правилами, принятыми Европейской Конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и научных целей (Страсбург, 1986).
Острый токсический гепатит вызывали у крыс путем введения четыреххлористого углерода (СС14, тетрахлорметан) в виде 50 % (У\У) масляного раствора при подкожном введении, в объеме 4,0 мл/кг массы (четырехкратно, 1 раз в сутки) [7]. Экстракт клевера лупинового (ЭКЛ), экстракт шлемника байкальского (ЭШБ) и экстракт толокнянки обыкновенной (ЭТО) вводили в форме водных растворов внутрижелудочно крысам в экспериментально-
терапевтических дозах 100 — 300 мг/кг 1 раз в сутки в течение 10 дней, начиная с 3 дня от начала введения СС14 объеме 10 мл/кг массы крыс. Крысы контрольной группы получали воду очищенную в эквиобъемных количествах по аналогичной схеме. Исследования проводили через 7, 14 и 21 сутки от начала эксперимента.
Активность процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) оценивали при определении содержания вторичных продуктов перекисного окисления липидов — малонового диальдегида (МДА) в сыворотке крови [9]. Определяли активность индикаторных ферментов цитолитического синдрома — аланинаминотрансферазы (АлТ), аспартатамино-трансферазы (АсТ) и альдолазы в сыворотке крови с использованием стандартных наборов реактивов ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск). Для оценки антитоксической функции печени в микросомах печени крыс определяли содержание цитохрома Р-450 [1], скорость инактивации восстановленного цитохрома Р-450 [1]. Желчеобразовательную и желчевыделительную функцию печени оценивали по скорости секреции и общему количеству выделенной желчи, в которой определяли содержание основных ее ингредиентов: желчных кислот, билирубина, холестерина [7].
Полученные данные обработаны с использованием ^критерия Стъюдента [8]. Различия считали достоверными при P < 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Курсовое введение испытуемых экстрактов приводило к торможению свободнорадикальных реакций в биологических мембранах гепатоцитов (табл. 1). Как следует из таблицы 1, скорость накопления малонового диальдегида в сыворотке крови под действием фитоэкстрактов снижалась в среднем на 30 — 43 % по сравнению с данными в контроле. Следует отметить, что экстракт шлемника байкальского в наибольшей степени препятствовал образованию ТБК-активных продуктов в крови.
Результаты исследований показали (табл. 2), что содержание цитохрома Р-450 в микросомах печени крыс и скорость его инактивации при токсическом гепатите у крыс при введении указанных фитоэкстрактов сопровождалось повышением
Таблица 1
Изменение содержания малонового диальдегида (МДА) в сыворотке крови крыс при введении экстрактов клевера лупинового (ЭКЛ), шлемника байкальского (ЭШБ) и толокнянки обыкновенной (ЭТО)
при СС14-гепатите
Группы животных МДА, мкМ/мл мин
7-е сутки 14-е сутки 21-е сутки
Интактная 2,14 ± 0,16 - -
Контрольная (СС14) 5,76 ± 0,36 4,54 ± 0,24 3,99 ± 0,13
Опытная 1 (СС14 + ЭКЛ) 3,60 ± 0,16* 3,21 ± 0,15* 3,10 ± 0,11*
Опытная 2 (СС14 + ЭШБ) 2,70 ± 0,10* 2,99 ± 0,15* 2,61 ± 0,13*
Опытная 3 (СС14 + ЭТО) 3,30 ± 0,17* 3,71 ± 0,19* 2,60 ± 0,14*
Примечание: * - здесь и далее разница достоверна по сравнению с контролем при Р < 0,05.
Таблица 2
Динамика изменения содержания цитохрома Р-450 в микросомах печени крыс и скорости его инактивации при назначении фитоэкстрактов при экспериментальном тетрахлорметановом гепатите (10-е сутки)
Группы животных Белок Цитохром Р-450 Степень инактивации цитохрома Р-450 к 30 мин, %
мг/мл мг/г ткани нмоль/мг белка нмоль/г ткани
Интактная 18,30 ± 1,00 3,66 ± 0,20 0,72 ± 0,04 2,64 ± 0,15 28,0 ± 1,0
Контрольная (СС14) 20,51 ± 2,20 4,10 ± 0,44 0,24 ± 0,02 0,98 ± 0,12 76,3 ± 3,0
Опытная 1 (СС14 + ЭКЛ) 39,33 ± 2,21* 7,86 ± 0,44* 0,25 ± 0,02 1,96 ± 0,16* 54,2 ± 3,1*
Опытная 2 (СС14 + ЭШБ) 36,60 ± 1,00* 7,32 ± 0,20* 0,54 ± 0,03* 3,95 ± 0,22* 37,0 ± 2,0*
Опытная 3 (СС14 + ЭТО) 17,55 ± 0,19 3,50 ± 0,18 0,44 ± 0,02* 1,54 ± 0,07* 36,6 ± 2,1*
Таблица 3
Влияние фитоэкстрактов на содержание гликогена в печени крыс при СС14-гепатите
Группы животных Гликоген, мг %
7-е сутки 14-е сутки 21-е сутки
Интактная 1858± 40 - -
Контрольная (тетрахлорметан) 392 ± 20 569 ± 41 1729 ± 79
Опытная 1 (тетрахлорметан + ЭКЛ) 1131 ± 36* 1318±51* 2767 ± 65*
Опытная 2 (тетрахлорметан + ЭШБ) 1115±31* 1214 ± 58* 4253±71*
Опытная 3 (тетрахлорметан + ЭТО) 1920 ± 56* 2017±81* 4370±71*
Таблица 4
Влияние фитоэкстрактов на скорость секреции желчи у крыс при экспериментальном тетрахлорметановом
гепатите
Группы животных Скорость секреции желчи, мг/мин/100 г
1 ч 2 ч 3 ч 4 ч
7-е сутки
Интактная 5,4 ± 0,3 5,2 ± 0,4 5,4 ± 0,2 4,7 ± 0,1
Контрольная (тетрахлорметан) 3,6 ± 0,2 3,7 ± 0,3 3,8 ± 0,2 2,9 ± 0,2
Опытная 1 (терахлорметан + ЭКЛ) 5,2 ± 0,5* 6,1 ± 0,3* 5,3 ± 0,2* 5,5 ± 0,3*
Опытная 2 (тетрахлорметан + ЭШБ) 4,1 ± 0,1* 4,3 ± 0,2 4,6 ± 0,1* 3,6 ± 0,09*
Опытная 3 (тетрахлорметан + ЭТО) 4,4 ± 0,3* 5,9 ± 0,4* 6,2 ± 0,3* 5,4 ± 0,2*
14-е сутки
Контрольная (тетрахлорметан) 3,4 ± 0,2 3,6 ± 0,1 3,3 ± 0,2 3,2 ± 0,3
Опытная 1 (терахлорметан + ЭКЛ) 4,7 ± 0,4* 6,1 ± 0,5* 5,9 ± 0,1* 4,5 ± 0,3*
Опытная 2 (тетрахлорметан + ЭШБ) 4,1 ± 0,2* 4,4 ± 0,3* 3,6 ± 0,1 3,4 ± 0,1
Опытная 3 (тетрахлорметан + ЭТО) 4,6 ± 0,3* 5,2 ± 0,4* 5,3 ± 0,2* 4,7 ± 0,4*
21-е сутки
Контрольная (тетрахлорметан) 3,9 ± 0,2 3,9 ± 0,1 3,2 ± 0,2 3,7 ± 0,1
Опытная 1 (терахлорметан + ЭКЛ) 6,2 ± 0,5* 7,0 ± 0,4* 6,1 ± 0,3* 6,9 ± 0,3*
Опытная 2 (тетрахлорметан + ЭШБ) 4,6 ± 0,2* 4,6 ± 0,2* 4,3 ± 0,1* 4,1 ± 0,2
Опытная 3 (тетрахлорметан + ЭТО) 5,3 ± 0,2* 6,1 ± 0,4* 5,2 ± 0,3* 4,5 ± 0,2*
содержания указанного гемопротеида при введении экстракта шлемника байкальского в 2,3 раза, толокнянки обыкновенной — на 83 %, клевера лупинового — в 2 раза по сравнению с контролем. В то же время, введение крысам с токсическим гепатитом экстрактов клевера лупинового и шлемника байкальского сопровождалось усилением синтеза
белка в паренхиме печени. Регуляция интенсивности перекисного окисления липидов указанными фитоэкстрактами приводила к уменьшению проницаемости биомембран гепатоцитов, о чем свидетельствовало снижение скорости перехода цитохрома Р-450 в функционально неактивный цитохром Р-420.
Еще одним подтверждением повышения детоксицирующей функции печени у животных с СС14-гепатитом явилось увеличение содержания гликогена в печени (табл. 3). Следует отметить, что наиболее заметное влияние на биосинтез гликогена в печени оказывал экстракт толокнянки обыкновенной.
При оценке влияния фитоэкстрактов на желчеобразовательную и желчевыделительную функции
печени было установлено, что экстракт клевера лупинового наиболее существенно усиливал холерез: скорость секреции желчи возрастала на 64 — 78 % по сравнению с контролем. Экстракт шлемника байкальского в меньшей степени влиял на скорость выделения желчи, а экстракт толокнянки обыкновенной повышал холерез на 36 — 59 % по сравнению с контрольными показателями (табл. 4).
Таблица 5
Влияние фитоэкстрактов на биохимический состав желчи у крыс при СС14-гепатите
Группы животных Общее количество желчи, мг/100 г Желчные кислоты, мг/100 г Билирубин, мг/100 г Холестерин, мг/100 г
Интактная 1242 ± 78 5,38 0,105 0,090
7-е сутки
Контрольная (тетрахлорметан) 837 ± 47 2,91 0,079 0,057
Опытная 1 (тетрахлорметан + ЭКЛ) 1326 ± 72* 8,88 0,142 0,111
Опытная 2 (тетрахлорметан + ЭШБ) 1005 ± 43* 3,89 0,142 0,074
Опытная 3 (тетрахлорметан + ЭТО) 1314±111* 9,77 0,107 0,104
14-е сутки
Контрольная (тетрахлорметан) 811 ± 54 2,13 0,099 0,055
Опытная 1 (тетрахлорметан + ЭКЛ) 1272 ± 45* 8,85 0,152 0,105
Опытная 2 (тетрахлорметан + ЭШБ) 930 ± 39 3,85 0,150 0,066
Опытная 3 (тетрахлорметан + ЭТО) 1188 ± 102* 5,67 0,105 0,090
21-е сутки
Контрольная (тетрахлорметан) 925 ± 63 3,60 0,110 0,060
Опытная 1 (тетрахлорметан + ЭКЛ) 1572 ± 114* 8,07 0,150 0,128
Опытная 2 (тетрахлорметан + ЭШБ) 1056 ± 26* 4,96 0,160 0,092
Опытная 3 (тетрахлорметан + ЭТО) 1266 ± 88* 5,83 0,108 0,083
Таблица 6
Динамика изменения активности ферментов сыворотки крови крыс под действием фитоэкстрактов
при экспериментальном гепатите
Группы животных АсТ, мкМ/мл ч АлТ, мкМ/мл ч Альдолаза, мкМ/мл ч
Интактная 2,86 ± 0,13 0,62 ± 0,02 1,02 ± 0,16
7-е сутки
Контрольная 4,73 ± 0,16 4,16 ± 0,26 7,48 ± 0,44
Опытная 1 (тетрахлорметан + ЭКЛ) 4,13 ± 0,20* 4,75 ± 0,21 5,18 ± 0,19*
Опытная 2 (тетрахлорметан + ЭШБ) 2,36 ± 0,11* 3,59 ± 0,09* 3,12 ± 0,17*
Опытная 3 (тетрахлорметан + ЭТО) 4,23 ± 0,18* 3,68 ± 0,14* 3,62 ± 0,17*
14-е сутки
Контрольная 6,74 ± 0,31 5,78 ± 0,29 4,16 ± 0,13
Опытная 1 (тетрахлорметан + ЭКЛ) 3,44 ± 0,22* 4,87 ± 0,14 3,20 ± 0,11*
Опытная 2 (тетрахлорметан + ЭШБ) 2,36 ± 0,11* 3,59 ± 0,09* 3,12 ± 0,17*
Опытная 3 (тетрахлорметан + ЭТО) 4,23 ± 0,18* 3,68 ± 0,14* 3,62 ± 0,17*
21-е сутки
Контрольная 4,26 ± 0,15 1,73 ± 0,13 3,85 ± 0,20
Опытная 1 (тетрахлорметан + ЭКЛ) 3,04 ± 0,14* 1,44 ± 0,14 3,00 ± 0,17
Опытная 2 (тетрахлорметан + ЭШБ) 3,10 ± 0,13* 0,83 ± 0,14* 2,14 ± 0,16*
Опытная 3 (тетрахлорметан + ЭТО) 2,82 ± 0,12* 1,02 ± 0,05* 1,34 ± 0,10*
При курсовом введении фитоэкстрактов в благоприятную сторону изменялся биохимический состав желчи у крыс с токсическим гепатитом. Так, содержание желчных кислот в сецернируемой желчи возрастало под влиянием экстракта клевера лупинового на ранних сроках наблюдения в 3 раза, экстракта шлемника байкальского — на 34 — 38 %, экстракта толокнянки обыкновенной — в среднем в 2,6 раза (табл. 5). Следует отметить, что экстракт клевера лупинового в наибольшей степени предупреждал холестаз, более эффективно повышал содержание в желчи желчных кислот и тем самым предупреждал развитие холестатического синдрома.
Снижение интенсивности процессов пере-кисного окисления липидов под влиянием фитоэкстрактов уменьшало проницаемость и вызывало стабилизацию биомембран, о чем свидетельствовало снижение показателей развития цитолитическо-го синдрома (табл. 6).
Особенностью действия экстракта шлемника байкальского является то, что он в наибольшей степени предупреждал повышение активности трансаминаз и альдолазы уже на ранних сроках развития экспериментального гепатита, а экстракт толокнянки обыкновенной свое мембраностабилизирующее действие оказывал в более поздние сроки эксперимента.
Таким образом, проведенные исследования свидетельствуют о выраженном фармакотера-певтическом влиянии указанных фитоэкстрактов на течение патологического процесса в печени. Испытуемые фитоэкстракты нормализуют активность системы гидроксилирования и деятельность дыхательной цепи ЭПР. Под их влиянием в микросомах печени сохраняется функционально активный и стабильный цитохром Р-450, они обеспечивают реабилитацию реакций метаболической трансформации. Этот фармакотерапевтический эффект обусловлен ингибированием процессов перекисного окисления липидов. Защитное влияние на нарушенную гепатотоксином антитоксическую функцию печени коррелирует с сильным антиок-сидантным действием. Фитоэкстракты восстанавливают нарушенную при токсическом гепатите экскреторную функцию печени и нормализуют биохимический состав желчи. При применении фитопрепаратов действует целый комплекс биологически активных веществ, которые, благодаря их оптимальному сочетанию, оказывают благотворное влияние на функциональное состояние всего организма в целом [4]. Преимущественная
фармакотерапевтическая и профилактическая эффективность многокомпонентных средств обусловлена не только их воздействием на патологический процесс, но и их регулирующим влиянием на соответствующие функциональные системы, повышая устойчивость организма [9]. Обнаруженные эффекты обусловлены содержанием в экстрактах флавоноидов, полисахаридов, витаминов, эфирных масел, макро- и микроэлементов и других природных соединений, которые в сочетании оказывают выраженный фармакотерапевтический эффект.
ЛИТЕРАТУРА
1. Бачманова Г.И. Реконструкция монооксиге-назной системы микросом печени: автореф. дис. ... д-ра мед. наук / Г.И. Бачманова. — М., 1983. — 25 с.
2. Биологически активные вещества растительного происхождения. — М., 2001 —2002. — Т. 1. — 350 с.; Т. 2. - 764 с.; Т. 3. - 216 с.
3. Ильченко Л.Ю. Гепатопротекторы при хронических заболеваниях печени / Л.Ю.Ильченко, Т.И. Карлович // Фарматека. — 2007. — № 8-9. — С. 54 — 58.
4. Лекарственные растительные средства в терапии повреждений гепатобилиарной системы / А.О. Занданов, Т.А. Ажунова, Э.А. Алексеева, С.М. Николаев // Лекарственные растительные средства в терапии повреждений гепатобилиарной системы. — Улан-Удэ, 2010. — 270 с.
5. Лебедев В.П. Клиническая фитотерапия / В.П. Лебедев. — Новосибирск, 2003. — 368 с.
6. Растения тибетской медицины: опыт фар-макогностического исследования / С.М. Баторова, Г.П. Яковлев, С.М. Николаев, З.Г. Самбуева. — Новосибирск, 1989. — 159 с.
7. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. — М., 2005. — 832 с.
8. Сергиенко В.И. Математическая статистика в клинических исследованиях / В.И. Сергиенко, И.Б. Бондарева. — М., 2000. — 256 с.
9. Темирбулатов Р.А. Метод повышения интенсивности свободнорадикального окисления липидсодержащих компонентов крови и его диагностическое значение / Р.А. Темирбулатов, Е.И. Селезнев // Лабораторное дело. — 1981. — № 4. — С. 209-211.
10. Яковлев А.А. Возможности объективного улучшения результатов терапии хронических вирусных гепатитов препаратом гептрал / А.А. Яковлев, С.И. Котлярова // Фарматека. — 2009. — С. 55 — 59.
Сведения об авторах
Ажунова Татьяна Александровна - Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, ведущий научный сотрудник лаборатории экспериментальной фармакологии, доктор биологических наук. 670042, г. Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, 6. р.т. 43-34-63. E-mail: [email protected]
Лемза Сергей Васильевич - Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, старший научный сотрудник лаборатории экспериментальной фармакологии, кандидат биологических наук. 670042, г. Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, 6. р.т. 43-34-63.
Занданов Александр Октябревич - заместитель министра здравоохранения Республики Бурятия, декан медицинского факультета Бурятского государственного университета, кандидат медицинских наук, доцент.
Самбуева Зинаида Гомбожаповна - Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, старший научный сотрудник лаборатории экспериментальной фармакологии, кандидат биологических наук. 670042, г. Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, 6. р.т. 43-34-63.
