CC BY
35
8. Kelman B. Z., Prokocimer M., Peller S. et al. // Blood. — 1989. — V. 74.— P. 2318—2324.
9. Lane D. P. II Nature. — 1992. — . 358. — P. 15—16.
10. Levine A. J. // Cancer Surv. — 1992. — V. 12. — P. 59—79.
11. Levine A. J, Momand J., Finlay C. A. II Nature. — 1991. — V. 351 — P. 453—456.
12. Lozzio G.M., Lozzio B. B. II Blood.— 1975. V. 45. — P. 321— 334.
13. Lubbert M„ Miller C. W, Crawford H. P., Koeffler H. P. Hi. Exp. Med. — 1988. — V. 167. — P. 873—886.
14. Miller C. W., Asia A., Tsay C. et al. // Cancer Res. — 1990. — V. 50. — P. 7950—7954.
15. Milner J., Medcalf E. A. II Cell. — 1991. — V. 65. — P. 765—774.
16. Prives C., Manfredi J. J. II Genes Dev. — 1993. — V. 7.—
p 529____534,
17. Vogelstein B„ Kinzler K. W. II Cell. — 1992. — V. 70. P. 523— 526.
18. Yonish-Rouach E., Resnitzky D., Lotem J,, et al. II Nature. — 1991. — V. 352. — P. 345—347.
Поступила 05.07.93
© Коллектив авторов, 1994 УДК 616-006.34.04-092.9:615.015
Е. А. Серебрякова, А. Е. Золотарев, И. Кара,
В. Деткова, Н. И. Зимакова
ФАРМАКОКИНЕТИКА ПОЛУСИНТЕТИЧЕОСОГО ФОСФОЛИПИДА У МЫШЕЙ
НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей,
НИИ молекулярной биологии ЧА Н, Прага
В настоящее время в практике лечения онкологических заболеваний стали появляться препараты, содержащие фосфолипиды [1, 3]. J. Kara и соавт. [4, 5, 7] показали, что алкил-фосфолипид, т.е. плазманил-N-ацил-эта-нол-амин (PNAE), выделенный из противоопухолевого препарата с ACPL, обладает цитолитическим действием in vitro при добавлении в культуру опухолевых клеток человека Hep-2, HeLa, Т-24, а также противоопухолевой активностью in vivo при лечении животных с саркомами S-180 и МС-11.
Показано, что PNAE ингибирует синтез ДНК опухолевых клеток, но не влияет на синтез ДНК и нормальный рост человеческих фибробластов.
Кроме того, обнаружено, что PNAE повреждает клеточную мембрану опухолевых клеток [7].
Задача настоящего исследования заключалась в изучении фармакокинетики и метаболизма PNAE у мышей при однократном и многократном введениях.
Материалы и методы. В исследовании фармакокинетики и метаболизма PNAE использовали полусинтетический препарат 14С-PNAE(l-0-octadecyl-2-oleyI-sn-glycero-3-phospho-(N-[U-l4C-p almitoyl])-ethanolam¡ne).
Эксперименты проводили на мышах ВДГ| массой 22—25 г, ин-тактных и с трансплантированной опухолью МС-11. I4C-PNAE вводили однократно внутривенно или перорально в виде водной эмульсии в дозе 40 мг/ 9,2-108 dpm/кг.
В интервалах времени от 0,083 до 168 ч у животных З^али образцы крови и определяли в них содержание 1 С-соединений. Параллельно собирали и анализировали мочу и экскременты. Курсовое введение 4C-PNAE проводили в режиме ежедневных 5-кратных внут-
ривенных инъекций препарата, разовая доза препарата составляла 36 мг/ 10-108 ¿рт/кг.
После введения препарата животных декапитировали, выделяли органы, ткани и экскременты, взвешивали, обрабатывали 2NKOH в соотношении 60 мг ткани: 1 мл КОН выдерживали на водяной бане при 100° С в течение 5 мин. Образцы переносили в сцинтилляционную жидкость и радиометрировали на (3-счетчике «\Vallac». Концентрацию препарата в органах и тканях выражали в условных единицах («мкг»/г).
С целью изучения метаболизма |4С-РИАЕ в органах и тканях проводили экстракцию смесью растворителей (метанол—хлороформ, 2:1) образцов крови, печени, опухоли и головного мозга по методу Фолха [2]. Органическую фракцию упаривали, затем в небольшом количестве хлороформа наносили на хроматографическую пластину (силикагель 60—254 иУ Мегск; 0,5 мм, 20 х 20 см). Для освобождения фосфолипидов от нейтральных липидов пластину обрабатывали ди-этиловым эфиром. После этого проводили хроматографирование в подвижной фазе (хлороформ—метанол:—аммиак—вода, 65:25:4:1).
Идентификацию фосфолипидов на пластине проводили с помощью раствора нингидрина в ацетоне и реактива молибденового синего.
Результаты и обсуждение. На рис. 1 представлены фармакокинетические кривые, описывающие изменение концентрации |4С-РМАЕ и |4С-метаболитов в крови мышей ВДР1 после однократного внутривенного (а)
б
Рис. 1. Фармакокинетические кривые 14С-РМАЕ в крови мышей ВДР1 после внутривенного (а) и перорального (6) введений препарата в дозе 40 мг/9,2 10* арт/кг.
По оси ординат — концентрация "мкг’Умл; по оси абсцисс —время, ч.
Способ введения Полупериод Полупериод Полупериод Площадь под Клиренс ренальный, Клиренс общий,
всасывания, распределения, элиминации, фармакокинетической мл/ч мл/ч
ч ч ч кривой, "мкг'Умл-1
Внутренний — 2,5 ± 0,7 61,6 ± 1,2 1486 ± 19 0,29 ± 0,006 0,7 ± 0,04
Пероральный 1,2 ± 0,35 — 131,8 ± 2,3 500 ± 7 0,03 ± 0,002 1,9 ± 0,01
и перорального (б) введения животным l4C-PNAE. Экспериментальные данные удовлетворительно описывались биэкспоненциальными уравнениями, соответствующими фармакокинетическим моделям: двухкамерной (рис. 1, а) и однокамерной с всасыванием (рис. 1, б).
Фармакокинетические параметры, характеризующие два пути введения препарата, представлены в табл. 1.
В интервале времени 0—5 мин после внутривенного введения препарата наблюдалось быстрое распределение 14С-соединений в организме животных и концентрация радиоактивности в крови составляла 121 "мкг'Умл, к 24 ч она снижалась на порядок и к концу наблюдения концентрация 14C-PNAEh 14С-метаболитов снизилась до 2 "мкг'Умл.
После перорального введения PNAE концентрация препарата в крови достигала максимальных значений 2,6 "мкг'Умл через 3 ч и практически удерживалась на постоянном уровне в течение 48 ч, после чего наблюдалось незначительное уменьшение уровня радиоактивности в крови до 1,0 "мкг'Умл.
Кумулятивные кривые экскреции радиоактивных соединений с мочой и калом представлены на рис. 2. За 168 ч наблюдения было выведено 12 и 76% от введенной дозы, соответственно, после внутривенного (рис. 2, а) и перорального (рис. 2, б) введения препарата. Очевидно, что при пероральном введении l4C-PNAE в организм животного, происходило ограниченное всасывание препарата и основное его количество выводилось с калом.
Таким образом, после внутривенного введения |4С-PNAE препарат активно распределялся в органах и тканях, и практически вся введенная доза удерживалась в организме в течение длительного времени, что, вероят-
а б в
Рис. 2. Кумулятивные кривые элиминации 14С-соединений с мочой (1) и калом (2) после однократного внутривенного (а), однократного перорального (б) и пятикратного внутривенного (в) введения 14С-РМАЕ мышам ВДР-ь
По оси ординат — процентные показатели; по оси абсцисс — время наблюдения, ч.
но, обусловлено высоким связыванием l4C-PNAE и его |4С-метаболитов с клеточными структурами, а также активным участием в процессе метаболизма. После перорального введения l4C-PNAE примерно через 3 ч было установлено стационарное равновесие между процессами поступления препарата в кровь из желудочно-ки-шечного тракта, его распределением в организме животных и экскреции. Вследствие высокого процента выведения из организма животных невсосавшегося препарата в 1-е сутки после введения per os, через 24 ч наблюдалось незначительное превалирование процесса элиминации l4C-PNAE из крови над процессом всасывания. Однако полупериод элиминации l4C-PNAE из крови был довольно длительный и составлял 131,8 ч.
О медленной элиминации l4C-PNAE из организма животных при двух способах введения свидетельствуют также величины ренального и общего клиренсов (см. табл. 1) препарата.
Соотношения площади под фармакокинетическими кривыми, (1 и 2), формально характеризующие биодоступность l4C-PNAE при пероральном введении относительно внутривенного, рассчитанные для разных временных интервалов, имеют существенные отличия: показатель, полученный с учетом данных для интервала времени от 0 до °°, был равен 36%, и, соответственно, от 0 до 48 ч — 12%.
В табл. 2 представлены данные по изучению распределения радиоактивных соединений в крови и органах
Таблица 2. Распределение 14C-PNAE в организме животных после повторных инъекций
Ткань/орган
Уровень концентрации, "мкг'Уг
1-й день 2-й день 3-й день 5-й день 5-Й день 1 -й день
Кровь 10,44 13,3 17,6 31,7 3
Почки 23,4 53,3 75,6 100,4 4,3
Семенники 8,28 15,5 21,6 35,6 1,9
Селезенка 42,5 86,4 99,7 216,0 5,1
Тимус 18,0 67,3 51,5 61,9 3,4
Сердце 14,0 30,2 39,2 56,9 4,1
Легкие 63,4 94,7 95,7 110,9 1,8
Жировая ткань 6,84 33,8 98,6 153,7 22,8
Лимфоузлы 22,3 57,9 77,4 78,5 3,5
Костная ткань 10,8 21,2 31,7 65,5 6
Мышцы 4,7 10,8 14,8 22,7 5
Печень 148,0 166,3 180,7 334,1 2,3
Мозг 2,99 4,7 6,8 20,1 6,7
Опухоль 15,5 28,3 39,6 62,8 4,1
мышей ВДР1 с саркомой МС-11 при 5-кратном ежедневном внутривенном введении 14C-PNAE. Величины удельной радиоактивности определяли через 24 ч после
1, 2, 3 и 5 введений.
Данные табл. 2 показывают разную скорость изменения удельной концентрации 14С-соединений в органах и тканях. Так, после первой инъекции наиболее высокие уровни радиоактивности наблюдали в печени, легких и селезенке, они превышали концентрации |4С-соединений в крови в 14,6; 6,1 и 4 раза, соответственно.
Однако в легких и печени концентрации |4С-пре-парата после окончания введений увеличивалась всего в 2 раза. С большей скоростью кумулируют l4C-PNAE жировая и костная ткань, селезенка и мозг. В таких органах, как почки, вилочковая железа, лимфоузлы, уровни радиоактивных соединений после третьего введения менялись незначительно. В опухолевой ткани наблюдали 4-кратное увеличение уровня радиоактивных продуктов после 5-й дозы препарата по сравнению с его однократным введением.
Исследования показали [7], что как PNAE, так и его метаболиты нетоксичны для нормальных физиологических клеток по сравнению с опухолевыми. По-види-мому, накопление фосфолипидов в организме при курсовом лечении способно оказать более высокое противоопухолевое действие, не усугубляя при этом токсическое воздействие на организм.
Кумулятивные кривые выведения радиоактивности при многократном введении (рис. 2, в) свидетельствуют о медленном выведении 14С-соединений из организма животных: через 11 сут было выведено с мочой и калом 3,3% и 6% от суммарной дозы.
Таким образом, повторные инъекции PNAE необходимы для достижения терапевтических уровней эфира-фосфолипида в крови и опухолевой ткани.
Проведенные хроматографические исследования липидных фракций крови, печени, опухолевой и мозговой ткани, полученных от животных, которым внутривенно вводили l4C-PNAE, показали наличие неизмененного препарата во всех указанных органах (рис. 3). Кроме того, обнаружено лизо-|4С-производное (лизо-PNAE), которое, вероятно, образуется при ферментативной активности фосфолипазы А2.
J. Kara и соавт. [6] обнаружили, что лизо- PNAE нетоксично для нормальных клеток и активно по отношению к опухолевым клеткам.
Интересно отметить, что незначительные количества l4C-PNAE были определены в мозге животных. Таким образом, неизмененный эфир-фосфолипид может проникать через гематоэнцефалический барьер.
|4С-пальмитиновая кислота, присутствующая в N-acyl связи молекулы l4C-PNAE iп vivo ферментативно переносится на другие фосфолипиды: фосфатидилхо-лин (PC), фосфатидилэтаноламин (РЕ) и на нейтральные липиды (NL). Показано, что около 50% l4C-PNAE в крови подвергается ферментативной N-трансациляции.
Показано накопление l4C-PNAE и nmo-l4C-PNAE в крови, опухолевой ткани и печени. Вероятно, противоопухолевая активность PNAE может быть обеспечена благодаря двум эфирам-фосфолипидам.
Выводы. 1. Фармакокинетика l4C-PNAE может быть представлена двухкамерной моделью при внутривенном введении и однокамерной моделью при перо-ральном введении.
PC
V
Рис. 3. Содержание фосфолипидов в опухоли (а), крови (6), печени (в) и мозговой ткани (г) после внутривенного введения 14C-PNAE мышам BflF1.
2. Длительный полупериод элиминации препарата из крови определен для двух способов введения препарата, что характеризует его медленное выведение из организма.
3. Экскреция l4C-PNAE из организма независимо от способа введения происходит в основном с калом. Так, через 168 ч после однократного перорального и внутривенного введения с калом и мочой вывелось 75 и 12%
препарата. Через 264 ч после многократного внутривенного введения — 10% от введенной дозы.
4. Установлено, что повторные инъекции фосфолипида приводят к накоплению |4С-соединений во всех органах.
5. Метаболизм РИЛЕ происходит до образования лизо-РМАЕ, которое также обладает противоопухолевой активностью.
ЛИТЕРА ТУРА
1. Berdel W. Б., Bausert W. R. Е., Fink U. et al. // Anticancer Res. — 1981—№ 1, —P. 345—352.
2. Folch Lees V., Sloane-Stanley G. H. II J. Biol. Chem. — 1957. — Vol. 226. — P. 497.
3. Herrmann D. B. J., Neumann H. A., Berdel W. E. et al. // Lipids. — 1987. — Vol. 22. — P. 962—966.
4. Kara J., Borovicka М., Liebl V. et al. // Neoplasma. 1986. — Vol. 33.— P. 187—205.
5. Kara J., Konovalova M. A., Liebl V. et al. // Neoplasma. — 1993. — Vol. 40.— P. 213—217.
6. Kara J., Liebl V., Dedkova V. et al. //Czechoslovak patent. — 1987. — PV-08341-87.
7. Kara J., Lienl V., Pelzbauer Z. II Highlights of Modern Biochemistry, Proceedings of the 14h International Congress of Biochemistry, Prague, Czechoslovakia, 10—15 July, 1988 (Editors A. Kotyk, J. Skoda, V. Paces and V. Kostka) nr. 2, 1989, 1459—1474, VSP Zeist, the Netherlands.
Поступила 04.11.93
© Т. М. Явишева, А. С. Ягубов, 1994 УДК 616-006,04:611.841.2
Т. М. Явишева, А. С. Ягубов
КОЛИЧЕСТВЕННАЯ МОРФОЛОГИЯ ЭНДОТЕЛИЯ РОГОВИЦЫ ЧЕЛОВЕКА ПРИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ОПУХОЛЯХ РАЗЛИЧНОЙ ЛОКАЛИЗАЦИИ
Отдел молекулярно-биологических и радиоизотопных методов исследования РАМН
Изучение любой ткани при различных видах патологии всегда представляет большой интерес, так как дает возможность глубже понять свойства той или иной ткани в норме. Еще К. Бернар (1866) писал, что «нет никакого коренного различия между природой явлений физиологических и патологических. Физиологические законы повторяются и в патологических явлениях».
Исследование эндотелия роговицы человека при злокачественных заболеваниях различных органов даст возможность более глубокого анализа количественного распределения клеток в популяции эндотелия в условиях действия пролиферативных факторов.
Материал и методы. Изучались площади различных клеток, их процентное содержание в эндотелии глаз у больных 41—60 лет и 61 — 80 лет, умерших от злокачественных опухолей различной локализации (молочная железа, легкие, желудок, кишечник). Всего изучено 20 случаев.
Анализ эндотелиальных клеток проводился с помощью специализированного компьютера 1Ьаз-2000 Коп1гоп (ФРГ) для цифровой
обработки изображений. Исследование клеток велось с фотопленок, полученных с плоскостных препаратов эндотелия, обработанных нитратом серебра.
Получены гистограммы распределения клеток различной площади в каждой возрастной группе. Площадь клеток заданного размера находилась в определенном интервале, отличаясь от площади последующих клеток на 1 класс, который соответствовал 24 мкм2.
Результаты и обсуждение. В предыдущих наших исследованиях подробно изучалась количественная морфология эндотелия роговицы человека в норме и при некоторых заболеваниях, сопровождающихся хронической интоксикацией (алкогольный цирроз печени, обширные пролежни вследствие тяжелых параличей и др.) [3, 4]. Выявлено, что основная масса клеток эндотелия представлена клетками среднего класса, площади которых неуклонно увеличиваются в каждой возрастной группе на 1 класс (24 мкм2). В популяции клеток эндотелия у лиц 20—60 лет средние клетки каждой возрастной группы составляли 61—62% от числа всех клеток и лишь у лиц старше 60 лет наблюдалось уменьшение содержания средних клеток до 55%, что объясняется, по-видимому, процессами старения.
Все клетки меньшей площади, чем средние, в каждой возрастной группе относили к малым, а большей площади — к большим клеткам.
Среди средних клеток выделяются оптимальные клетки, которые в наибольшем и постоянном количестве встречаются в эндотелии всех возрастных групп (9,68—10,12%). В условиях хронической интоксикации, когда происходит массовая гибель клеток и снижаются плотности эндотелиальных клеток в 1 мм2, колебания площадей оптимальных клеток минимальны, что свидетельствует о стабильности этих параметров и, возможно, генетической запрограммированности оптимальных клеток.
В настоящем исследовании нами проведен анализ гистограмм распределения площадей клеток эндотелия при заболеваниях, сопровождающихся активной пролиферацией эндотелия.
Ранее нами выявлено [1, 2], что при злокачественных опухолях различной локализации (молочная железа, легкие, желудок и др.) происходит активация митотического деления клеток эндотелия с увеличением их плотности. В то же время процессы пролиферации в большей мере выражены у лиц 41—60 лет, чем 61—80 лет (плотность клеток эндотелия в 41—60 лет по сравнению с контролем увеличилась на 36%, а в 61—80 лет — только на 15%).
Математическая обработка материала на анализаторе изображения 1Ьав-2000 позволила дифференцированно изучить состав популяции клеток эндотелия в зависимости от их площади при опухолях различной локализации.
Так же, как и в предыдущем исследовании [4], основное наше внимание было сосредоточено на изучении клеток средних размеров.
При анализе гистограмм у больных с онкологическими заболеваниями в ряду средних клеток произошли некоторые изменения (рис. 1, 2). По сравнению с нормой соответствующего возраста левый предел площа-
