Хлонизол - новый эффективный противоопухолевый препарат класса нитрозоалкилмочевин Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 615.277.3.03

L.A. Ostrovskaya1, VA.Filov2, В.A.Ivin2, A.N. Strukov2, M.M. Fomina1, N.V. Bluchterova1 ,

VA.Rikova1, A.A. Konradov1

CHLONIZOL - THE NEW ALKYLNITROSOUREA DRUG WITH ANTITUMOR ACIVITY

'N.M. Emanuel Institute of Biochemical Physics RAS, Moscow 2N.N. Petrov Institute of Oncology Ministry of Health RF, S. Petersburg

ABSTRACT

Antitumor activity , pharmacokinetics , and cytogenetic effect of the new nitrosourea derivative - chlonisol -have been studied. Growth inhibitory effect of the drug against 12 experimental tumor systems, including intracranial tumors has been established. Chlonizol as it has been shown by pharmacokinetic investigation, displays enchanced accumulation in the brain and liver tissues. The strong cytogenetic activity of chlonizol against tumor cells has also been revealed. Chlonizol is more effective then other nitrosoureas as antitumor and cytogenetic agent.

Key words: chlonisol, alkylnitrosoureas, antitumor activity, experimental tumor systems, pharmacokinetic study, cytogenetic effect

Л.А. Островская1, В.А. Филов2, Б.А. Ивин2, А.Н. Стуков2, М.М. Фомина1,

Н.В. Блюхтерова1, В.А. Рыкова1, А.А. Конрадов1

ХЛОНИЗОЛ - НОВЫЙ ЭФФЕКТИВНЫЙ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЙ ПРЕПАРАТ КЛАССА НИТРОЗОАЛКИЛМОЧЕВИН

‘Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, Москва, 2Научно-исследовательский институт онкологии им. Н.Н. Петрова

Минздрава РФ, Санкт-Петербург

РЕЗЮМЕ

Исследована противоопухолевая активность, фармакокинетика и цито-генетический эффект нового препарата класса нитрозоалкилмочевин (НАМ) хлонизола. Ростингибирующий эффект хлонизола показан на 12 экспериментальных моделях, включающих интракраниальные опухоли. Препарат, по данным фармакокинетических исследований, обладает повышенной тропностью к тканям мозга и печени. Хлони-зол проявляет высокую цитогенетическую активность, индуцируя тотальные повреждения структуры хромосом клеток опухоли. По уровню противоопухолевой и цитогенетической активности хлонизол превосходит другие известные нитрозопроизводные.

Ключевые слова: хлонизол, нитрозоалкилмочевины, противоопухолевые препараты, экспериментальная химиотерапия опухолей, структура хромосом, цитогенетический анализ, фармакокинетика

ВВЕДЕНИЕ

Расширение арсенала химиотерапевтических средств для лечения опухолевых заболеваний остается одной из важнейших задач экспериментальной онкологии.

Новый активный противоопухолевый препарат хлонизол, предложенный НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова М3 РФ, относится к классу нитрозоалкилмочевин (НАМ), широко представленному в совре-

менной химиотерапии опухолей (табл.1) [1; 3; 4].

Основными показаниями к применению НАМ в клинической онкологии являются злокачественные лимфомы, мелкоклеточный рак легкого, диссемени-рованная меланома, опухоли мозга [9; 10; 18].

Молекулярные механизмы действия НАМ, согласно современным представлениям, связаны с алкили-рованием и карбомоилированием макромолекул продуктами биодеградации соединений. Эти реакции вызывают модификацию структуры ДНК, приводят

Таблица 1

Препараты группы нитрозоалкилмочевин, обладающие противоопухолевым действием

К-К-С-КН-К’

I II

N0 О

Условное название препарата Химическое рациональное название Страна

Производные нитрозоалкилмочевин, разрешенные для медицинского использования

НММ Нирозометилмочевина 1 -нитрозо-1 -метилтилмочевина ИБХФ РАН

ВСЖТ Кармустин 1,3-бис(2-хлорэтил)-1 -нитрозомочевина США

ссыи Ломустин 1-(2-хлорэтил)-3-циклогексил-1-нитрозо-мочевина США

Мессыи Семустин 1-(2-хлорэтил)-3-(4-метил)- циклогексил-1-нитрозомочевина США

Стрептозотоцин 2(3-метил-3-нитрозоуреидо)-2-деокси-О-глюкопираноз США

АСИи Нимустин 1-(2-хлорэтил)-3-(4-амино-2-метилпири-мидин- 5-ил)метил-1-нитрозомочевина Япония

Араноза 1~метил-3-(а-Ь-арабинопиранозил)-1 -нитрозомочевина РФ, ОНЦ РАМН

Производные нитрозоалкилмочевин, находящиеся в стадии клинического испытания

Нитруллин 9-(2-хлорэтил)-7,9-нитрозо-2-омоцитруллин РФ, ОНЦ РАМН Ин-т химии УНЦ РАН

Хлорозотоцин 2[3-(2-хлорэтил)-3-нитрозоуреидо]-2-деокси- О-глюкопираноз США

рачи 1-(2-хлорэтил)-3-(2,6-дезокси-1-пиперидил)-1 -нитрозомочевина США

ОАИи 1-(2-хлорэтил)-3-(В-В-глюко- пиранозил)-1 -нитрозомочевина Япония

ЯРСЫи 1 -(2-хлорэтил)-3-рибофурано- зилпропилиден-2', 3'-паранитро-бензоат-5)-1-нитрозомочевина Франция

RPCNU 1-(2-хлорэтил)-3-(рибопиранозилтриацетат-2'-3'-4')-1 -нитрозомочевина Франция

Производные нитрозоалкилмочевин, прошедшие углубленное доклиническое изучение

Диметинур 1,3-диметил-1-нитрозомочевина РФ ИБХФ РАН

АДЭКО 1 -метил-З-(В-Б-ксилозил)- 1-итрозомочевина РФ ИБХФ РАН

к повреждению аппаратов транскрипции и трансляции, блокированию систем репарации (главным образом за счёт ингибирования активности фермента О-6-алкилгуанинтрансферазы) и лежат в основе противоопухолевого эффекта НАМ [18; 19]. Показано, в частности, что хлонизол вызывает угнетение синтеза поли-АДФ-рибозополимеразы - фермента, ответственного за выживемость клеток с поврежденной ДНК [12].

НАМ обладают рядом характерных особенностей фармакологического действия, среди которых следует упомянуть широту спектра действия, способность ингибировать рост опухолей при однократном и при многократном введении парентерально и перорально, эффективность при применении на поздних стадиях процесса, обусловленную циклонес-пецифичностью их действия, а также высокую ак-

тивность при опухолях мозга, что связано со способностью НАМ проникать через гемато-энцефали-ческий барьер [9; 10; 18].

Эти уникальные особенности фармакологического действия НАМ, как оказалось, присущи и препарату нового поколения - хлонизолу, экспериментальному изучению которого посвящена данная работа.

В статье приводятся основные результаты пред-клинического исследования хлонизола, включающие такие аспекты , как:

• характеристика противоопухолевых свойств;

• изучение фармакокинетики препарата (карцинома Льюис);

• цитогенетическое изучение влияния на структуру хромосом клеток опухоли и костного мозга (опухоль Эрлиха).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Экспериментальные модели

Исследование проведено на лабораторных животных - мыши ВОЁ,, весом 18-20 г и крысы линии 'У^^аг, весом 100-120 г (питомники “Раппалово” и “Столбовая” РАМН).

Экспериментальными моделями опухолей мышей служили лейкозы Ы210 и Р388 в асцитной форме, опухоль Эрлиха в асцитной, солидной и интракраниальной формах, карцинома Льюиса, меланома В 16, саркома 37, лимфосаркома ЛИСЫ, развивающиеся в солидной форме, а также саркома 180 в солидной и интракраниальной формах. Экспериментальные опухоли крыс представлены такими моделями, как карциносаркома Уокер, саркома 45, перевиваемые подкожно, и глиома 35 в интракраниальной форме. Перевивка опухолей животным осуществлялась внутрибрюшинно, подкожно, внутримышечно или интрацеребрально в соответствии с общепринятыми стандартными методами.

Препараты

Хлонизол применялся в виде водного раствора, вводимого в дозе 20 мг/кг однократно в различные сроки после перевивки опухоли, в/б (в экспериментах по исследованию фармакокинетики препарата - в/в).

В качестве препаратов сравнения использован ряд производных НАМ, вводившихся в том же режиме, как и хлонизол, - в/б, однократно в эквиток-сических дозах, составляющих 0,67 Ы3[0: араноза -650 мг/кг, ССИи -50 мг/кг, ВСЖТ - 27 мг/кг, НММ и диметинур - по 80 мг/кг, АДЭКО - 750 мг/кг.

Противоопухолевая активность

Показателями противоопухолевого эффекта хлонизола и препаратов сравнения - аранозы и СС>Ш служили: выживаемость животных (в %), увеличение средней продолжительности жизни леченых животных по сравнению с контролем (в %), торможение роста опухоли (ТРО)1 у леченых животных по сравнению с контролем (в %).

Фармакокинетика

Исследование фармакокинетики хлонизола проведено колориметрическим методом, специфичным для нитрозоамидов [22].

Препарат вводился однократно, в/в, в дозе 20 мг/кг на 7-е сутки развития карциномы Льюиса (масса опухоли ~ 600 мг). Определялось содержание хлонизола в пробах крови, гомогенатов тканей органов (мозг, легкие, печень, почки) и опухолей, полученных через различные интервалы времени после введения препарата (0,25; 0,5; 1; 2; 3; 4; 5; 6; 18; 24 ч).

Опытные образцы биосубстратов приготовлялись путем гомогенизации 250 мг тканей различных орга-

1 Индекс торможения роста опухоли (ТРО%) определялся из соотношения размеров опухолей у леченых (Т) и контрольных (С) животных, как:

ТРО% = (С-Т)/Сх100%.

нов или опухолей в 2 мл охлажденного 0,9 %-ного раствора NaCl (в стеклянном гомогенизаторе) либо забором 2 мл крови из подключичной вены мыши.

Количественное определение хлонизола в опытных образцах тканей проводили колориметрическим методом с использованием цветного реактива Грис-са (1 %-ный раствор сульфаниловой кислоты в 20%-ной трихлоруксусной кислоте и 0,1 %-ный раствор а-нафтиламина в 30 %-ной уксусной кислоте) для окрашивания и спектрофотометрии нитритных групп (N02‘), образующихся при кислотно-катали-зируемом гидролизе нитрозамидов: н о+

Rj-N-CO-NH-R.2—-—->RrNH-C0-NH-Rz+HN02+H+ [20; 22] NO

К 2 мл гомогенизированной в физиологическом растворе суспензии ткани (крови) добавляли 2 мл 1%-ного раствора сульфаниловой кислоты в 20 %-ной трихлоруксусной кислоте и 1 мл 0,1 %-ного раствора а-нафтиламина в 30 %-ной уксусной кислоте, термо-статировали при 50 °С в течение 45 мин, центрифугировали 20 мин при 3500 об/мин (центрифуга “Beckman” с охлаждением) и отбирали надосадочную жидкость для спектрофотометрического определения хлонизола в двух параллельных пробах. Оптическая плотность анализируемых образцов измерялась на спекрофотометре “Specord” М-40, характерный максимум поглощения (Д) при /1=525 нм.

Концентрация препарата в крови и тканях животных определялась по калибровочным кривым, снятым при инкубировании хлонизола в известных концентрациях (от 0,625 до 20 мкг/мл) in vitro в исследовавшихся средах. Чувствительность метода составляет 0,125 мкг препарата на 1 г ткани.

Полученные данные представлены в виде кривых, каждая экспери-ментальная точка которых характеризует усредненные показатели для 10-12 животных, полученные в 3-4 опытах.

Анализ структуры хромосом

• Исследовано влияние хлонизола на структуру хромосом клеток опухоли Эрлиха и костного мозга у животных опухоленосителей. Препарат вводился в/в в дозе 20 мг/кг на 4-е сутки развития опухоли. Цитогенетическое исследование проведено на мета-фазных клетках [14].

Мышам-опухоленосителям вводился колхицин (0,2 мл 0,03 %-ного раствора, в/б). Через 2 ч отбирались пробы опухолевых клеток (0,2-0,4 мл асцитической жидкости из брюшной полости) и клеток костного мозга (берцовая кость). Полученные образцы помещали в пробирку с 0,576 %-ным раствором КС1 и термостатировали 20 мин при 36 °С, после чего центрифугировали при 800 об/мин в течение 5 мин. После удаления надосадочной жидкости фиксировали опухолевые клетки в системе метанол : уксусная кислота (3:1) 2 ч при 12 °С, дважды меняя фиксатор после очередного центрифугирования. Фиксированные клетки наносили на предметные стекла, подсушивали над теплой струей воздуха и окрашивали по Ро-мановскому-Гимзе. Анализировали по 100 метафаз на микроскопе “Унивар”.

Параметрами цитогенетической активности препарата служили частота клеток с перестройками хромосом (%), доля клеток с тотально поврежденными хромосомами (%), число повреждений хромосом на клетку (абс. ед.).

При анализе типов структурных повреждений хромосом различали аберрации хроматидного и

хромосомного типов, выраженные в виде микрофрагментов, делеций и транслокаций.

Исследовалась динамика изменения цитогенетических параметров на протяжении 10 сут после введения препарата. Представленные данные характеризуют усредненные показатели для 10-12 животных, полученные в 3-4 опытах.

Таблица 2

Противоопухолевый эффект хлонизола. Введение препарата однократно, внутрибрюшинно, в дозе 20 мг/кг

Штамм опухоли (способ перевивки) Время воздействия после перевивки опухоли, сут Торможение роста опухоли, % Излеченные животные, %

Лейкоз ІЛ210 (в/б) 3 1110* 75

Лейкоз Р388 (в/б) 3 894* 100

Карцинома Льюис (п/к) 4 96 —

Меланома В-16 (п/к) 1 100 —

Лимфосаркома мышей ЛИО-1,(п/к) 1 96 —

Асцитная опухоль Эрлиха (в/б) 3 100 —

Солидная опухоль Эрлиха (в/б) 6 98 —

Саркома 180 (п/к) 3 96

Саркома 37 (п/к) 1 100 —

Саркома 45 крыс (п/к) 1 100 100

Карциносаркома Уокер крыс (п/к) 1 100 —

Лимфосаркома Плисса крыс (п/к) 1 42 —

* - Увеличение средней продолжительности жизни животных по сравнению с контролем, %.

Таблица 3

Сравнение противоопухолевого эффекта хлонизола с ССГ<Ш и аранозой при внутрибрюшинном введении препаратов

Опухоль (способ перевивки) Препарат, доза, мг/кг Срок введения, сут Торможение роста опухоли, % УПЖ, %*

Хлонизол, 20 3 894

Лейкоз Р388 в/б ССЖ, 50 3 — 387

Хлонизол, 15 5 92

Меланома В-16 в/м ССЖГ, 50 5 76 —

Хлонизол, 20 1 92

ССЖ 50 1 18

Карцинома Льюис п/к Хлонизол, 20 5 92 —

ССЖ, 50 5 44

Хлонизол, 20 2 90

Опухоль Эрлиха п/к ССЖГ, 50 2 78 —

Хлонизол, 20 3 100

Саркома 180 п/к ССЖГ, 50 3 85 —

Араноза, 650 3 29

Хлонизол, 20 3 84

Саркома 37 п/к ССЖ, 50 3 54 —

Араноза, 650 3 61

Лимфосаркома мышей ЛИО- Хлонизол, 20 1 80

1, в/м Араноза, 650 1 52 -

Опухоль Эрлиха, Хлонизол, 20 1 — 78

интракраниально ССЖ, 50 1 28

Саркома 180, Хлонизол, 20 3 — 267

интракраниально ССЖГ, 50 3 12

Глиома 35 крыс, Хлонизол, 20 1 — 629

интракраниально ССЖ, 50 1 329

* - Увеличение средней продолжительности жизни леченных животных по сравнению с контролем, %

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Противоопухолевая активность хлонизола

Хлонизол обладает, подобно другим нитрозопроизводным, широким спектром терапевтической активности. Перечень чувствительных к препарату штаммов включает 12 экспериментальных опухолей различного гистогенеза, развивающихся в виде асцитных, солидных и внутричерепных новообразований (табл. 2 и 3).

Следует подчеркнуть исключительно высокий уровень активности хлонизола. Препарат способствует излечению 75 % мышей с лейкозом Ы210, всех животных с лейкозом Р388 и саркомой 45, практически полностью ингибирует развитие солидных опухолей - карциному Льюиса, меланому В16, лимфо-саркому ЛИО-1, опухоли Эрлиха, саркомы 180 и 37, карциносаркому Уокера, не говоря уже об асцитных вариантах некоторых из этих опухолей (см. табл. 2).

При сравнении действия хлонизола с одним из его ближайших аналогов - СС>Ш (ломустин) и с аранозой отчетливо видна преимущественная активность хлонизола в отношении изученных опухолей (см. табл. 3).

Необходимо подчеркнуть, что столь высокую эффективность хлонизол проявляет при однократном применении - свойство, характерное для большинства НАМ [10; 18].

Следует также особо отметить, что, подобно другим активным препаратам класса НАМ, хлонизол обладает способностью ингибировать рост опухолей на поздних стадиях развития процесса , при введении на 3-6-е сутки после их перевики (см. табл. 2 и 3). Эту важную особенность действия хлонизола - способность ингибировать развитие уже сформировавшихся опухолей - наглядно иллюстрируют

данные, полученные в экспериментах с меланомой В16 и карциномой Льюиса (рис. 1 -3).

Кинетика влияния хлонизола и ломустина на развитие меланомы В16 при введении препаратов на 5-е сутки после перевивки опухоли представлена на рис. 1. Хлонизол вызывает более глубокое и длительное ингибирование роста опухоли, чем ломустин. Так, к 16 суткам после перевивки торможение роста опухоли при введении хлонизола сохраняется на уровне 92%, а при применении ломустина составляет 76 %.

Эффективность хлонизола. в отношении карциномы Льюиса практически не зависит от времени

Введение препарата

Время после перевивки опухоли, сут

Рис. 2. Сравнительная оценка влияния хлонизола и ССГШ на развитие карциномы легких Льюиса

1400

5 9 13 17

♦ Время после перевивки опухоли, сут

Введение препарата

Рис.1. Сравнительная оценка влияния хлонизола и СС1Чи на развитие меланомы В-16

1800

1 Время после перевивки опухоли, сут

Введение препарата

Рис. 3. Сравнительная оценка влияния хлонизола и СОЧи на развитие карциномы легких Льюиса

введения препарата и отчетливо превышает активность ломустина для данного штамма опухоли. Несомненные преимущества хлонизола, вызывающего ингибирование развития карциномы Льюиса на 92 % как при раннем (1 сут), так и при позднем (5 сут) введении, очевидны при сравнении с действием ломустина, тормозящего рост опухоли не более, чем на 18 % к концу срока наблюдения (см. рис. 2, 3).

Как известно, одной из фундаментальных особенностей фармакологи-ческого действия препаратов класса НАМ является их способность проникать через гемато-энцефалитический барьер и эффективно ингибировать развитие интрацеребральных опухолей [10; 18; 19].

В связи с этим особого внимания заслуживает исключительно высокая эффективность хлонизола в отношении интрацеребральных форм карциномы Эрлиха, саркомы 180 и особенно глиомы 35, причем все указанные модели проявляют существенно более высокую чувствительность к хлони-золу, чем к его аналогу - ломустину (табл. 4-6).Очевидно, что обнаруженная значительная активность хлонизола на моделях интракраниальных опухолей имеет принципиальное значение с точки зре-

ния возможных перспектив практического использования препарата.

Таким образом, установлено, что хлонизол обладает широким спектром активности в отношении экспериментальных опухолевых моделей, проявляет ростингибирующий эффект при однократном введении не только на ранних, но и на поздних стадиях развития опухолевого процесса, эффективно ингибирует рост интрацеребральных форм опухолей, превосходит по эффективности известные аналоги - СОчТи и аранозу.

Исследование фармакокинетики хлонизола

НАМ, будучи высокореакционноспособными соединениями, подвергаются в физиологических условиях спонтанному гидролизу либо претерпевают превращения при ферментативном микросомальном денитрозировании (НММ, кармустин) или гидро-ксилировании (ломустин, семустин) с образованием алкилирующих и карбомоилирующих продуктов, ответственных за биологические эффекты препаратов. Скорость процессов, определяющие быстроту деградации соединений и преобладающий путь их биотрансформации, зависит от множества факто-

Таблица 4

Влияние хлонизола и СОШ на продолжительность жизни мышей с интракраниальной опухолью Эрлиха. Введение препаратов через 1 сутки после перевивки опухоли

Группа Средняя продолжительность жизни животных, сут Увеличение продолжительности жизни животных, %

Контроль 9,2 + 1,8 -

Хлонизол 20 мг/кг 16,4 ±2,3 80

ССІЧи 50 мг/кг 11,3 ±1,5 30

Таблица 5

Влияние хлонизола и СОШ на продолжительность жизни мышей с интракраниальной саркомой 180. Введение препаратов через 1 сутки после перевивки опухоли

Группа Средняя продолжительность жизни животных, сут Увеличение средней продолжительности жизни животных, %

Контроль 12,5 + 2,1 -

Хлонизол 20 мг/кг 26,3 + 3,7 120

ССЫи 50 мг/кг 13,7 + 2,3 12

Таблица 6

Чувствительность крыс с интрацеребральной глиомой 35 к хлонизолу и СОШ. Введение препаратов через 1 сутки после перевивки опухоли

Группа Выживаемость, % Средняя продолжительность жизни животных, сут Увеличение средней продолжительности жизни животных, %

Контроль 0 13,2+1,7 -

Хлонизол 20 мг/кг 50 80,5 + 4,8 629

ССЖГ 50 мг/кг 25 47,3 + 3,6 369

ров, и может различаться для отдельных представителей НАМ на несколько порядков [9; 18; 19].

В связи с этим при исследовании фармакокинетики НАМ весьма существенны как регистрация суммарного содержания в тканях нативного препарата и продуктов его трансформации (радиоизотопный метод) [7], так и определение неизмененного препарата в био-субсгратах in vivo (импульсная полярография, тонкослойная хроматография, колориметрия) [6; 8; 20-25].

Для изучения фармакокинетики нативного хло-низола использован колориметрический метод, применявшийся ранее для исследования других препаратов группы НАМ, таких, как НММ [12], нитрул-лин [8], диметинур [6; 21], стрептозотоцин [20], MeCCNU [25], PCNU [23].

Фармакокинетические кривые, характеризующие распределение хлонизола в организме животных с карциномой легких Льюиса, представлены на рис 4.

Приведенные фармакокинетические кривые имеют унимодальный вид, что позволяет применить для их описания одночастевую модель со всасыванием [6; 8; 13; 23], дающую следующую зависимость концентрации от времени:

Ct =------(е-Р‘-е-т) (1),

а- Р

где к - константа, зависящая от дозы; а, Р - параметры введения и выведения; t - время.

Если параметры введения и выведения близки, т.е. а ~ Р, то формулу (1) можно представить в виде Ct = Scx2te-at (2), где S - площадь под кинетической кривой - кумулятивный показатель, характеризующий биодос-тупносгь органа для препарата.

Оценка ос позволяет вычислить время полувыве-дения препарата из органа как

Показатель времени полувыведения наряду с

а

величиной S является общепринятым для характеристики фармакокинетики препарата.

При сравнительно высокой вариабельности экспериментальных данных однопараметрическая зависимость (2) может дать определенные преимущества перед двупараметрической (1), даже при ой*[3, так как а отражает как бы результирующую интенсивность фармакокинетического метаболизма, не разделяя его на процессы введения и выведения, для которых при высокой вариабельности данных может оказаться труднее выявить скрытые зависимости между параметрами.

Для более точной апроксимации полученных экспериментальных данных зависимость (2) преобразована в уравнение вида:

где h - константа, характеризующая остаточную

Ct = Sa2te-Ht + h (4),

концентрацию препарата в органе, имеющую вид плато на большинстве полученных фармакокинетических зависимостей.

Можно полагать, что величина h характеризует некий минимальный уровень препарата, сохраняющийся в органе в течение более или менее длительного времени, возможно, за счет связывания хлонизола с белками тканей. В пользу такого предположения косвенным образом свидетельствуют полученные нами данные о высокой степени связывания хлонизола с альбумином при инкубации in vitro.

25

Рис. 4. Трехмерное изображение распределения хлонизола в организме животных с карциномой легких Льюиса:

по оси абсцисс - время, ч;

по оси ординат - концентрация хлонизола, мкг/г

Численные значения фармакокинетических параметров Б, а, Ь, Ь/2, а также величины 1;тах (экспериментально фиксируемый момент достижения максимальной концентрации препарата в органе) представлены в табл. 7.

Анализ приведенных зависимостей свидетельствует о том, что препарат практически сразу после в/в введения поступает из кровяного русла в исследованные органы, обнаруживается в них уже через 157 после введения и определяется в течение суток.

Максимальная концентрация препарата достигается в легких через 157, в почках - через 30', в опухоли - через 90', а в мозге и в печени - через 18<У после введения (см. табл. 7).

В соответствии с интегральным показателем биодоступности органов для хлонизола (Б) возрастание содержания хлонизола в различных тканях происходит в такой последовательности: почки, легкое, опухоль, мозг, печень (см. табл. 7, рис. 5).

Коэффициент относительной биодоступности (ОБ) , определяемый из соотношения показателей площадей под кривыми для исследуемого органа и крови, как ОБ= 8орган/8кровь, также свидетельствует о преимущественном накоплении хлонизола в печени и мозге (см. табл. 7).

Тот факт, что хлонизол одновременно обнаруживается в крови и мозге, является доказательством способности препарата проникать через гематоэн-цефалический барьер и свидетельствует о потенциальной активности хлонизола при опухолях мозга, что и было показано на моделях интракраниальных опухолей (см. табл. 4-6).

Весьма показательно, что коэффициент относительной биодоступности мозга для хлонизола выше, чем для других НАМ, таких как НММ, диметинур и нитруллин (табл. 8).

Время полувыведения препарата 1т из тканей мозга и особенно печени имеет на порядок более высокие значения, чем для других исследовавшихся тканей, подтверждая тем самым выраженную гепатот-ропность хлонизола. Для тканей опухоли этот показатель имеет промежуточное значение относительно других тканей и составляет 55' (см. табл. 7, рис 6).

Представляется уместным сопоставить значения показателя времени полувыведения из крови для хлонизола и ряда НАМ. Для большинства препаратов, включая СОШ, АС1Чи, НММ, РСШ1, значения

в, мкг*час/ г 20

кровь легкое почки печень мозг опухоль

Рис. 5. Площади под фармакокинетическими кривыми (в), характеризующие биодоступность опухоли и органов животных с карциномой легких Льюиса для хлонизола

Таблица 8

Коэффициент относительной биодоступности (ОБ) тканей мозга для препаратов группы нитрозомочевин (в/в введение препаратов)

Препарат ОБ—Бмозг /Бкровь

Хлонизол 10,5

НММ 4,0

Диметинур 2,8

Нитруллин 1,6

биологического времени полувыведения колеблются от 1(У до 3(У. Для хлонизола этот показатель составляет 12' (табл. 9).

Таблица 7

Фармакокинетические параметры распределения хлонизола в организме животных с карциномой легких Льюис. Введение препарата в/в, в дозе 20 мг/кг

Пробы тканей 8 мкг-час г ос (час-1) н, мкг г Ь/2 (мин) їттіах (мин) Коэффициент ОБ

Кровь 0,79 3,37 0,30 12 30 -

Почки 0,78 3,04 0,28 14 30 0,98

Легкое 1,55 1,70 0,24 25 15 1,95

Опухоль 2,04 0,75 0,06 55 90 2,56

Мозг 8,34 0,20 0,06 210 180 10,50

Печень 16,15 0,13 0,04 317 180 20,36

I 1/25 МИН

400

кровь легкое почки печень мозг опухоль

Рис. 6. Время полувыведения хлонизола из тканей опухоли и органов животных с карциномой легких Льюиса

Таким образом, в результате исследования фармакокинетики хлонизола установлено, что препарат обладает тропностью к тканям печени и мозга, значит, эти органы - потенциальные мишени для противоопухолевого и токсического действия препарата.

В связи с этим отметим, что при изучении фармакокинетики НММ установлена высокая троп-ность легких к этому препарату - одному из наиболее эффективных в химиотерапии опухолей легких [8; 9; 18]. Наряду с этим была показана определенная тропность тканей почек к нитруллину, что расценивалось как потенциальная нефротоксичность препарата, подтвержденная впоследствии опытом его клинического изучения [8].

Что касается биодоступности опухоли для хлонизола, то, согласно нашим данным, она практически не зависит от способа введения препарата и сохраняется на одном уровне при его в/в и п/о применении хлонизола [10]. Этот факт представляется весьма существенным с точки зрения возможности ис-

Таблица 9

Время полувыведения (1:Ш) из крови для препаратов группы ннтрозомочевин

Препарат Время полувыведения, мин

Хлонизол в/в 12

Хлонизол п/о 21

СС№1 10

АСИи 18

ВСЖ1 16-23

НММ 25

РСМ1 29

пользования хлонизола в различных лекарственных формах, предусматривающих как внутри-, так и вне-сосудистый путь поступления препарата в организм.

Цитогенетическое исследование влияния хлонизола на структуру хромосом опухолевых и нормальных клеток

НАМ, будучи активными противоопухолевыми препаратами, являются химическими мутагенами, вызывающими генные мутации и перестройку хромосом [11]. В связи с этим очевидна необходимость характеристики действия препаратов данного класса на цитогенетическом уровне для оптимизации их использования в качестве лекарственных средств.

Судьба популяции выживших опухолевых клеток, репродуктивными потенциями которых определяется эффективность проведенного лечения, в значительной мере обусловлена повреждающим действием НАМ на структуру хромосом клеток опухоли. Ввиду цепного механизма мутационного процесса, индуцируемого большинством химических мутагенов, принципиальное значение имеет исследование кинетики изменения доли клеток с аберрациями хромосом в популяции на протяжении длительного периода, что позволяет получить полное представление о характере и продолжительности мутагенного последействия.

Кинетический подход к исследованию генотоксических эффектов противоопухолевых препаратов позволяет количественно оценить их отдаленные последствия для популяции не только опухолевых клеток, но и неопухолевых тканей (например, костный мозг). Ранее при исследовании дозозависимых эффектов препаратов группы НАМ, а также при сравнительном изучении цитогенетической активности различных нитрозопроизводных обнаружено сохранение в отдаленные сроки после воздействия повреждений хромосом в клетках опухоли при отсутствии аберрантных хромосом в клетках костного мозга. Установлена положительная корреляция между остаточным уровнем цитогенетических повреждений в популяции опухолевых клеток и противоопухолевым эффектом НАМ [5; 15-17].

Показатели цитогенетического эффекта хлонизола в отношении выжив-шей после воздействия препарата фракции делящихся клеток опухоли Эрлиха представлены на рис 7.

Доля метафаз с аберрациями хромосом в популяции клеток Эрлиха возрастает с 11 % на 1-е сутки после воздействия препарата до 100 %, регистрируемых на 6-е сутки наблюдения, снижаясь к 10-м суткам до 75 %.

Количество повреждений хромосом на клетку возрастает на протяжении 5 суток после введения препарата, достигая величины, равной 44, и остается на достигнутом уровне до конца периода наблюдения (рис. 7).

Индуцируемые хлонизолом повреждения хромосом в опухоли проявляются в виде делеций, микрофрагментов и транслокаций . Доля грубых повреждений - транслокаций преобладает, появляясь на 2-е сутки после воздействия препарата и достигая 100% к 6-м суткам наблюдения, что свидетельствует о кла-стогенном эффекте препарата (рис. 7).

Цитогенетический эффект хлонизола в отношении клеток костного мозга охарактеризован зависимостями, представленными на рис.8. Видно, что характер этих зависимостей резко отличается от закономерностей изменения соответствующих параметров в клетках опухоли. Максимальные значения доли аберрантных метафаз и числа повреждений на клетку зарегистрированы в костном мозге через 1 сут после воздействия препарата и составляют 70 % и 40 перестроек хромосом соответственно. В дальнейшем эти показатели резко снижаются, достигая на 4-е сутки значений, равных 0,5 % и 1 соответственно, что объясняется быстрой элиминацией поврежденных клеток из костного мозга.

Среди индуцированных хлонизолом аберраций в костном мозге преобладают делеции, однако доля клеток с тотальным повреждением хромосом в 1-е сут после введения препарата также весьма значительна, достигая 66 % среди всех поврежденных клеток. В дальнейшем уровень тотально поврежденных клеток резко уменьшается, составляя около 8 % на 2-е сут и менее 0,5 % на 4-е сут после воздействия (рис. 8).

Таким образом, индуцированные хлонизолом повреждения структуры хромосом в клетках костного мозга носят преходящий характер и уже к 4-м сут практически не регистрируются.

Сопоставление динамики изменения частоты метафаз с аберрациями хромосом и количества повреждений на клетку в опухоли (см. рис. 7) и кост-

ном мозге (см. рис. 8) свидетельствует о различиях в цитогенетических показателях реакции опухолевых и нормальных тканей на воздействие препарата.

Так, доля клеток с повреждениями хромосом в опухоли остается на высоком уровне (75 %) спустя 10 сут после воздействия препарата, в то время как в костном мозге аберрантные метафазы практически не обнаруживаются уже к 4 сут после введения препарата.

Анализ типов структурных повреждений хромосом указывает на более тяжелый характер нарушения структуры хромосом в опухоли по сравнению с костным мозгом. Клетки с тотальным повреждением хромосом в костном мозге регистрируются лишь в течение 3 сут, причем максимальный уровень (66 %) отмечается только в 1-е сут после воздействия. В опухоли все повреждения хромосом, начиная с б-х суток после воздействия, носят массовый характер, и все анализируемые опухолевые клетки относятся к числу тотально поврежденных.

Иными словами, хлонизол индуцирует хромосомные аберрации как в опухолевых, так и в нормальных клетках костного мозга. Однако при быстрой (к 4-м сут после воздействия) элиминации поврежденных клеток из костного мозга их доля в опухоли сохраняется весьма значительной (75 %) даже спустя 10 сут после введения препарата.

Как уже отмечалось, нами исследован цитогенетический эффект ряда активных противоопухолевых

%

Абс.ед.

%

Абс. ед.

Время после воздействия, сут

Рис. 7. Цитогенетический эффект хлонизола для опухоли Эрлиха:

1 - доля метафаз с аберрациями хромосом, %;

2 - доля клеток с тотальным повреждением хромосом, %;

3 - число повреждений хромосом на клетку, абс. ед.

Рис. 8. Цитогенетический эффект хлонизола для клеток костного мозга мышей-опухоленосителей (опухоль Эрлиха):

1 - доля метафаз с аберрациями хромосом, %;

2 - доля клеток с тотальным повреждением хромосом, %;

3 - число поврежденных хромосом на клетку, абс.ед.

препаратов класса НАМ, таких, как НММ, ВСЖД, СОШ, нашедших широкое клиническое применение, а также диметинура и АДЭКО, прошедших углубленное предклиническое изучение [5; 15-17].

Цитогенетический эффект хлонизола и упомянутых препаратов сопоставлен на рис. 9. Изменение доли клеток с аберрациями хромосом в опухоли Эрлиха описывается кривыми с экстремумом, имеющими различные для каждого конкретного препарата параметры - скорости нарастания частоты метафаз с аберрациями, их максимального уровня и скорости элиминации из популяции. Так, максимальная частота клеток с аберрациями хромосом составляет для хлонизола 100 % (4-е сут после воздействия), для ВОМи -95 % (7-е сут), для АДЭКО -80 % (2-е сут), для НММ 50 % (3-е сут), для димети-нур 45 % (6-е сут).

Остаточный уровень клеток с дефектами хромосом в опухоли на 10-е сутки после воздействия колеблется от 9 -15 % для СС1Ми и диметинура до 66 % для ВСЫи, составляя для хлонизола 75 %.

Очевидно, что по уровню цитогенетической активности хлонизол превосходит все другие исследовавшиеся препараты класса нитрозомочевин. Экстремальный характер изменения частоты аберрантных метафаз типичен для действия всех изученных НАМ, а также для многих других химических мутагенов и радиационного облучения.

Интерпретация такого рода зависимостей основана на представлениях о продленном мутагенезе, согласно которым потенциально скрытые повреждения, полученные клеткой в момент введения препарата, постепенно реализуются во времени [11; 15].

Известно, что, будучи активными алкилатора-ми, НАМ вызывают нарушения структуры ДНК за счет образования одно- и двунитевых разрывов и межмолекулярных сшивок. Наряду с этим изоцианаты, образующиеся в результате биодеградации НАМ,'ингибируют ферменты репарации и тем самым способствуют фиксации повреждений ДНК. Эти процессы лежат в основе генотоксического эффекта НАМ и проявляются на клеточном уровне в виде хромосомных аберраций [18; 19].

Совокупность имеющихся сведений о цитогенетическом эффекте НАМ позволяет предположить, что одним из отдаленных последствий применения препаратов этой группы является сохранение определенного остаточного уровня повреждений хромосом в опухоли, положительно коррелирующего с ростин-гибирующей активностью соединений [5; 15-17].

Результаты изучения цитогенетического эффекта хлонизола дают новые экспериментальные доказательства справедливости данного наблюдения.

Весьма существенно, что при столь выраженной генотоксичности в отношении опухолевых клеток хлонизол вызывает в хромосомном аппарате клеток костного мозга умеренные и достаточно быстро элиминируемые (4-е сут после воздействия) повреждения, что также является характерным для большинства известных НАМ [9].

Таким образом, при исследовании нового противоопухолевого препарата класса НАМ - хлонизола

сут

%

сут

сут

%

сут

%

сут

Рис. 9. Доля метафаз с аберрантными хромосомами в популяции клеток опухоли Эрлиха при воздействии хлонизола (1), НММ (2), ВСГЧи (3), ССРГО (4), диметинура (5), АДЭКО (6):

по оси абсцисс - время в сут;

по оси ординат - доля клеток с повреждениями хромосом, %

подтверждено обнаруженное нами ранее явление индукции длительно существующих повреждений хромосом, сохраняющихся в опухоли спустя длительное время после воздействия при отсутствии к этому сроку клеток с аберрациями хромосом в костном мозге, причем по уровню цитогенетического эффекта - тотальное повреждение всех делящихся клеток опухоли с остаточной долей аберрантных метафаз в популяции опухолевых клеток, равной 75 % (10-е сут после воздействия), - хлонизол превосходит все исследовавшиеся препараты класса НАМ.

ВЫВОДЫ

Результаты проведенных экспериментальных исследований свидетельствуют о том, что хлонизол является новым высокоэффективным противо-опу-холевым препаратам, ингибирующим развитие 12 экспериментальных опухолевых моделей, в том числе интракраниальных опухолей.

Препарат, по данным фармакокинетического исследования, проявляет повышенную тропность к тканям печени и мозга, а также высокую цитогенетическую активность, индуцируя тотальное повреждение хромосом опухолевых клеток.

Обладая набором ценных фармакологических свойств, присущих препаратам класса НАМ, хлонизол превосходит по уровню противоопухолевой и цитогенетической активности известные препараты данной группы, что, по нашим представлениям, открывает новые возможности применения нитрозопроизводных в химиотерапии опухолей.

ЛИТЕРАТУРА

1. Ивин Б.А., Крайз Б. О., Корсаков М.В. и др. Итоги изучения этилениминотриазинов // Вопросы онкологии.

- 1990.-Т. 36, №1,- С. 6-11.

2. Конрадов А.А., Кутыркин В.А., Ким В.А. Оптимизация и прогно-зирование эффективности применения нитро-зометилмочевины для лечения больных злокачественными опухолями по фармакокинетическим параметрам // Изв. АН СССР, сер. биол. - 1985. - № 1. - С. 16-24.

3. Коньков С. А., Крылова И.М., Стуков А.Н. и др. М-нит-розоуреидо-1,3-пропандиолы и диоксаны - новые противоопухолевые агенты // Проблемы современной онкологии. IV Всероссийский съезд онкологов. Ростов на Дону. - 1995. - Т. 1. - С. 202-203.

4. Коньков С.А., Стуков А.Н., Резцова В.В. и др. Алкил-нитрозоуреидодиоксаны и алкшшитрозоуреидопропан-диолы- новые группы противоопухолевых соединений. -Вопросы онкологии. - 1998. - Т. 44, № 1. - С. 97-99.

5. Островская Л.А., Фомина М.М., Богословская Е.П. и др. Сравнительная оценка противоопухолевого, цитогенетического и иммунодепрессивного эффектов диметину-ра при пероральном и парентеральном применении // Экспер. Онкология. - 1988. - Т. 10, № 6. - с. 44-48.

6. Островская Л.А., Рыкова В.А., Конрадов А.А., Корман Д. Б. Фармакокинетика противоопухолевого препарата диметинур // Эксперимент. Онкология. - 1989. - Т.

11, №2.-С. 58-62.

7. Островская Л.А., Рыкова В.А., Конрадов А.А. и др. Кинетика распределения 14СО-диметинура в организме интактных животных и опухоленосителей // Эксперим. Онкология. - 1990. - Т. 12, № 1. - С. 70-74.

8. Островская Л.А., Рыкова В.А., Конрадов А.А., Корман Д. Б. Экспериментальное изучение фармакокинетики нитруллина // Химиотерапия опухолей в СССР. - 1990. -Т. 55.-С. 198-207.

9. Островская Л.А., Фомина М.М. Биологические основы применения нитрозоалкилмочевин в химиотерапии опухолей // Химическая физика. - 1995. - Т. 14, № 11. -С. 71-83.

10. Островская Л. А., Корман Д.Б., Дементьева Н.П. и др. Препараты класса нитрозоалкилмочевин в отечественной противоопухолевой химиотерапии // Российский биоте-рапевтический журнал. - 2004. - Т. 3, № 1. - в печати.

11. Рапопорт И. А. Особенности и механизм действия супермутагенов / Супермутагены. - М.: Наука, 1966. - С. 9-23.

12.Резцова В.В., Филов В.А. О роли НАД в инициации гибели или трансформации клеток с поврежденной ДНК // Экспериментальная онкология. - 1998. - Т. 18.

- С. 202-212.

13 .Соловьев В.Н., Фирсов А.А., Филов В. А. Фармакокинетика. - М.: Медицина, 1980. - 423 с.

14. Фомина М.М., Мииенкова Е.А., Порошенко Г.Г. Характер повреж-дений хромосом нормальных и опухолевых клеток под влиянием нитро-зометилмочевины // Экспер. Онкология. - 1980. - Т.2, № 4. - С. 74—78.

15 .Фомина М.М., Богословская Е.П ., Конрадов А. А., Островская Л.А. Динамика повреждений хромосом клеток асцитного рака Эрлиха и костного мозга мышей противоопухолевым препаратом диметинур // Экспе-римен. Онкология. - 1986. - Т. 8, № 3. - С. 70-74.

16. Фомина М.М., Богословская Е.П., Островская Л.А. Кинетика структурных повреждений хромосом и их роль в противоопухолевом эффекте нитрозоалкилмочевин // Актуальные проблемы экспериментальной химиотерепии опухолей. - Т. 2. - Черноголовка, 1987. - С. 43.

11. Фомина М.М., Доюаманбаев Ж.А., Островская Л.А. И Дозо-зависимый цитогенетический и ростингибирую-щий эффект нового противоопухолевого препарата группы нитрозомочевин // Изв. АН СССР, сер. биол.

- 1991.-№3,-С. 436-444.

18.Эмануэль Н.М., Корман Д.Б., Островская Л.А. и др. Нитрозо-алкилмочевины - новый класс противоопухолевых препаратов. - М.: Наука, 1978. - 285 с.

19.Gnewuch С. Т., Sosnovsky G. A Critical Appraisal of the Evolution of N-Nitrosoureas as Anticancer Drugs // Chem. Rev. -1997. - Vol. 97, № 3. - P. 829-1013.

20.Forist A. Spectrophotometric determination of streptozotocin // Anal. Chem. -1964. - Vol. 36, N 5. - P. 1338-1339.

21. Ostrovskaya L.A. Dimethynur // Drugs of the future. -1989.-Vol. 14, N 11.-P. 1038-1039.

22. Preussmann R., Schaper-Druckrey F. Investigation of a colorimetric procedure for determination of nitrosoamides and comparison with other method // IARC Sci Publ. -1972.-N3.-P. 81-85.

23.Rahman A., Luc Ph-V.T., Shein Ph.S., Wooley P.V. Pharmacological disposition of l-(2-clorethyl)-3-(2,6-dioxo-3-piperidyl)-l-nitrosourea in mice // Cancer Res. -1984. - Vol. 44, № 1. - P. 149-153.

24. Russo R.G., Cattaneo M.T., Bartosek I. Pharmacokinetics of nitrosoureas: comparison of l,3-bis-(2-chloroethyl-l-nitrosourea (BCNU) and l-(2-chloroethyl)-3-cyclohexyl-l-nitrisourea (CCNU) after oral and intravenous administration to rats // Tumori. - 1984. - Vol. 70. - P. 499-502.

25.Schmid F.F., Otter G.M., Perri G.C. et. al. Differential uptake of l-(2-chlorethyl)-3-(trans-4-methyl-cyclohexyl)-1-nitrosourea and doxorubicin by Lewis lung carcinoma and Ridgway osteogenic sarcoma // Cancer Res. - 1983. -Vol. 43, № 3. - P. 976-979.