Факторы, влияющие на адъювантные свойства производных хитозана, при парентеральном введении инактивированных гриппозных вакцин Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

Факторы, влияющие на адъювантные свойства производных хитозана, при парентеральном введении инактивированных гриппозных вакцин

А.Д. Переверзев1, С.М. Шинкарев2 (smshin@mail.ru), С.Г. Маркушин1 (s.g.markushin@rambler.ru), И.И. Акопова1, И.Б. Коптяева1, К.В. Лисовская1, О.В. Борисова1, Г.Г. Кривцов1

1НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН, Москва

2Всероссийский научно-исследовательский и проектно-технологический институт биологической промышленности РаСХН, московская область

Резюме

Цель. Были исследованы факторы, влияющие на адъювантные свойства производных хитозана при парентеральном введении инактивированных вирусных вакцин. Материалы и методы. Использовали инактивированные гриппозные вакцины: Ваксигрип (Sanofi Pasteur, Франция), Флюарикс (GSK, Нидерланды) и Агрипал (Novartis, Италия) и Гриппол («Микроген», Россия). В качестве адъювантов применяли производные хитозана, предоставленные Всероссийским научно-исследовательским и проектно-тех-нологическим институтом биологической промышленности РАСХН. Эксперименты проводили на мышах линии СВА, а также на беспородных мышах. Для определения иммунного ответа использовали ИФА и РТГА. Защитный эффект иммунизации оценивали при интраназальном заражении мышей вирулентным штаммом вируса гриппа. Результаты. Адъювантные свойства производных хитозана зависели от величины суммарного положительного заряда NH^^-групп и химических свойств противоанионов. Наиболее выраженными адъювантными свойствами характеризовались глютамат хитозана и реацетилированный хитозан (хитин). Показано, что парентеральное введение мышам инактивированных гриппозных вакцин, контактировавших со слабокислой средой (рН 5,0), приводило к снижению титров сывороточных антител, ингибирующих вирус-специфическую гемагглютинацию. В этой связи были исследованы свойства глютамата хитозана в качестве адъюванта для инактивированных гриппозных вакцин при различных значениях рН. Полученные данные показали, что глютамат хитозана обладает хорошими адъювантными свойствами как при рН 6,2, так и при рН 5,0. Выводы. Производные хитозана обладали различными адъювантными свойствами в зависимости от особенностей химической природы. Наиболее выраженными адъювантными свойствами обладали глютамат хитозана и реацетилированный хитозан (хитин). При парентеральном введении мышам инактивированных гриппозных вакцин совместно с глютаматом хитозана в качестве адъюванта последний обладал высокими адъювантными свойствами в широком диапазоне рН, в том числе при пониженных значениях (5,0). Ключевые слова: вакцина, адъювант, хитозан

Factors Affecting on Adyuvant Properties of Chitosan Derivatives at Parenteral Administration of Inactivated Viral Vaccines

A.D. Pereverzev1, S.M. Shinkarev2 (smshin@mail.ru), S.G. Markushin1 (s.g.markushin@rambler.ru),

1.1. Akopova1, I.B. Koptiaeva1, K.V. Lisovskaya1, O.V. Borisova1, G.G. Krivtsov1

1 Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, Moscow

2 All-Research and Technology Institute of the Biological Industry, Moscow Region All-Russian Research Abstract

Aim. The investigation of factors affecting on adjuvant properties of chitosan derivatives at parenteral administration of inactivated viral vaccines. Materials and Methods. Vaxigrip («Sanofi Pasteur», France), Fluarix (GSK, Holland), Agripal («Novartis», Italy) and Grippol («Microgen», RF) were investigated. As adjuvants, we used chitosan derivatives, kindly provided All-Research and Technology Institute of the Biological industry. Experiments were conducted on mice CBA and also on nonpedigreed mice. ELISE and HI test were used for determination of immune response. Protective effect of immunization was appreciated during intranasal infection by virulent influenza virus. Results. Adjuvant properties of chitosan derivatives depended from size of summary positive charge of NH2-groups and chemical properties of anions. Chitosan glutamate and reacetylated chitosan (chitin) have most impressive adjuvant properties. It was shown, that the contact of inactivated influenza vaccines with acid media (pH 5.0) before immunization assists visible decrease of HA -antibodies titer owing to conformation changes of hemagglutinin. In this connection adjuvant properties of glutamate chitosan were investigated at different values of pH. Data obtained shown, that glutamate chitosan has excellent adjuvant properties both pH 5.0 and

6.2. Conclusion. Chitosan derivatives have different adjuvant properties depend on chemical nature peculiarities. Glutamate chitosan and reacetilated chitosan (chitin) have more impressive adjuvant properties. Glutamate chitosan has excellent adjuvant properties at wide range of pH, including low values (5.0).

Key words: vaccine, adjuvant, chitosan

Введение

В последние годы для усиления иммунного ответа при иммунизации инактивированными вирусными вакцинами успешно применяют адъ-юванты различной химической природы [2, 3, 6, 7, 9 - 11]. В частности, было показано, что хито-зан - поликатионный полисахарид естественного происхождения - повышает эффективность инак-тивированных гриппозных и полиовирусных вакцин при парентеральном введении [4, 5]. Вместе с тем механизмы адъювантного действия хитоза-на, а также факторы, влияющие на его адъювант-ные свойства, остаются малоисследованными. В частности, отсутствуют данные о сравнительной адъювантной активности различных форм хито-зана, мало известно о зависимости адъювантных свойств производных хитозана от особенностей их химической природы. Хитозан хорошо растворим и обладает хорошими адъювантными свойствами в глютаматном буфере при кислых и слабокислых значениях рН. Повышение значений рН приводит к потере суммарного положительного заряда NH2-группами молекул хитозана и выпадению молекул хитозана в осадок. С другой стороны, известно, что гемагглютинин вируса гриппа при сдвиге рН в кислую сторону может значительно изменить свою конформацию, а это при вакцинации может снизить эффективность иммунного ответа.

Цели данной работы - попытка исследования зависимости адъювантных свойств производных хитозана от особенностей их химического строения, а также изучение влияния различных значений рН на свойства глютамата хитозана, используемого в качестве адъюванта при парентеральном введении гриппозных инактивирован-ных вакцин.

Материалы и методы

Производные хитозана. В работе использовали хитозан, полученный из панциря креветок путем однократного депротеинирования крошки панциря в 5%-ном растворе гидроокиси натрия и деминерализации в 2,5%-ном растворе соляной кислоты с последующим деацетилированием в 40%-ном растворе гидроокиси натрия. Он обладал молекулярной массой (ММ) 200 кДа, степенью деацетилирования 83,7%, содержал не более 0,5% белка и 0,3% минеральных примесей (золы). Индекс полидисперсности исходного хитозана равнялся 6,27, что свидетельствует о широком молекулярно-массовом распределении. Для определения адъювантных свойств хитозана также использовали его производные - натриевую соль сукциноила хитозония и солевые формы (глютамат и сукцинат хитозана). Для синтеза солей применяли нативный хитозан и деполимеризованный (получен путем обработки исходного полимера в 0,2%-ном водном растворе перекиси водорода при 52 °С). В качестве адъю-ванта также применялась солевая форма соляной кислоты. Характеристики использованных в работе солей и производных хитозана указаны в таблице 1. Молекулярную массу полимеров определяли вискозиметрическим методом, степень деацетилирования и степень замещения аминогрупп - кон-дуктометрически.

Вакцины. В опытах использовали инактивиро-ванные расщепленные гриппозные вакцины Вак-сигрип (Sanofi Pasteur, Франция), Флюарикс (GSK, Нидерланды), Агрипал (Novartis, Италия) и Гриппол («Микроген», Россия) сезона 2010/2011 годов.

Вирусы. Былииспользованыследующие штаммы вируса гриппа А: (H1N1)IVR-116, (Н^1)/Калифор-ния/7/2009, (И1М1)/Врисбен/59/07, (H1N1)/ PR8/34, (H3N2)/Перт/09/87, (H2N2)/Краснодар/101/59,

Таблица 1.

Физико-химическая характеристика производных хитозана

№ модификация MM, кда Степень деацетилирования, % рН Степень замещения NH..-групп, % Гемагглютинирующий титр 1%-ного р-ра или 1%-ной суспензии*

1 ^сукциноил хитозония (натриевая соль) 200 83,7 7,6 56,0 1:2

2 Глютамат/сукцинат хитозана (солевая форма) 67 83,7 5,1 - 1:512

3 Глютамат хитозана (ограниченно-деполимеризо-ванная солевая форма) 67 83,7 5,1 - 1:2048

4 Глютамат хитозана (солевая форма) 200 83,7 5,0 - 1:10 000 - 1:160 000

5 Хлорид хитозана(деполи-меризованная солевая форма) 4 85,0 6,3 - 1:5000 - 1:10 000

6 Реацетилированный хитозан (хитин) (микрочастицы 1000 - 3000 нм) - 0 7,0 Ацетилированы все NH2-rpynnbi 1:3000 - 1:5000

Примечание: *К двукратным разведениям производных хитозана в 96-луночных плашках добавляли равный объем 1%-ной суспензии куриных эритроцитов. Через 45 минут инкубации при комнатной температуре определяли титр гемагглютинации.

(H5N2)/Утка/Пенсильвания/10218/84. Вирусы выращивали в девятидневных куриных эмбрионах при 37 0С в течение 48 часов. Вируссодержащую аллантоисную жидкость освобождали от клеточного дебриса в течение 30 минут при комнатной температуре в центрифуге при 6000 об./мин и применяли для определения гемагглютинирующей активности при различных значениях рН.

Мыши. Эксперименты проводили на мышах линии СВА, а также на беспородных белых мышах (самках) весом 10 - 12 г.

Иммунизация. К инактивированным гриппозным вакцинам добавляли равные количества 1%-ного раствора глютамата хитозана с определенным рН либо буферный раствор (контроль).

Мыши были вакцинированы внутримышечно 0,2 мл препарата, содержащего по 3 мкг каждого компонента вакцины в комбинации с 0,5%-ным глютаматом (в конечной концентрации) хитозана с различным рН или буфером. Вакцинировали двукратно. Повторную иммунизацию проводили на 21-й день после первой. Через 10 дней после второй иммунизации у животных брали кровь в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных».

При изучении влияния конформационных изменений гемагглютинина вируса гриппа на интенсивность гуморального иммунного ответа инакти-вированную гриппозную вакцину или очищенный препарат вируса смешивали в равных количествах с 0,05 М Трис-Н^-буфером или 0,05 М ацетатным буфером, имеющими различные значения рН, и затем парентерально иммунизировали мышей.

Анализ ингибирующих специфическую гемаг-глютинацию антител. Сыворотку крови иммунни-зированных животных обрабатывали рецептор-разрушающим энзимом (RDE) по методу, рекомендованному ВОЗ [13]. Анализ сывороточных антител проводили по стандартному методу [8].

ИФА для определения вирус-специфических IgG проводили по описанной ранее методике [14] в 96-луночных планшетах (Corning incorporated 3591), которые предварительно стабилизировали 400 ГАЕ/0,1 мл очищенного штамма AIVR-116 (H1N1). За конечное разведение принимали наивысшее разведение оптической плотности (ОП) образца при 490 нм, превышающее среднюю ОП в контрольных образцах более чем на три стандартных отклонения.

Статистическую обработку данных проводили с использованием t-критерия Стьюдента [1].

Результаты и обсуждение

На первой стадии работы были исследованы адъювантные свойства производных хитозана. Как видно из таблицы 2, исследуемые производные хитозана значительно отличались по своим адъювант-ным свойствам, наиболее выражены они были у раствора глютамата высокомолекулярного и менее выражены - у деполимеризованного хитозана, а также у суспензии микрочастиц реацетилированно-го хитозана (хитина). Глютамат высокополимерного хитозана при комбинированном парентеральном введении с инактивированными гриппозными вакцинами Ваксигрип и Флюарикс повышал титр сывороточных антител, ингибирующих гемагглютинацию

Таблица 2.

Адъювантные свойства производных хитозана при комбинированном парентеральном введении мышам инактивированных гриппозных вакцин Ваксигрип и Флюарикс *

№ Модификация Титр сывороточных антител в РЗГА при парентеральном введении мышам в комбинации с вакцинами Титр сывороточных антител в ИФА при парентеральном введении мышам в комбинации с вакцинами

Ваксигрип Флюарикс Ваксигрип Флюарикс

1 ^сукциноил хитозония (натриевая соль) 74,6 ± 48,8 40,0 ± 24,0 2400,0 ± 1131,0 2000,0 ± 1697,0

2 Глютамат-сукцинат хитозана (солевая форма) 394 ± 203,2 181,3 ± 66,6 - -

3 Глютамат хитозана (солевая форма), ММ 67,0 кДа 1237,3 ± 727,8 960,0 ± 452,5 38 400 ± 18 101 42 666 ± 14 780,1

4 Глютамат хитозана (солевая форма), ММ 200 кДа 3413,3 ± 973,7 533,3 ± 184,1 76 800 ± 2262,7 68 266 ± 59 119,5

5 Хлорид хитозана (солевая форма) 213,3 ± 73,7 106,6 ± 37,6 - -

6 Реацетилированный хитозан (хитин) (микрочастицы) - 480,0 ± 277,1 32 000 ± 20 238,5 38 400 ± 18 101,9

7 Вакцина + физраствор 213,3 ± 73,7 90,6 ± 33,3 4800 ± 2262,2 4266,6 ± 1847,5

Примечание: *К инактивированным гриппозным вакцинам добавляли равные количества 1%-ного раствора глютамата хитозана или 1%-ной суспензии микрочастиц реацетилированного хитозана. Затем проводили иммунизацию мышей внутримышечно в объеме 0,2 мл. Мышей иммунизировали двукратно. Сыворотки крови иммунизированных животных обрабатывали RDE. Титр сывороточных антител определяли с помощью РЗГА или ИФА.

вирусов, в среднем в 6 - 8 раз (Р < 0,05), а в ИФА отмечалось повышение титра сывороточных антител по сравнению с контролем в 5 - 15 раз. Следует отметить, что глютамат ограниченно деполимеризо-ванного хитозана (67 кДа) обладал сходными хорошими адъювантными свойствами. По данным ИФА, в этом случае титр сывороточных антител повышался в 5 - 15 раз (Р < 0,05). У суспензии микрочастиц реацетилированного хитозана (хитина) также были сравнимые адъювантные свойства: мы наблюдали повышение титра сывороточных антител, ингиби-рующих гемагглютинирующую активность вирусов гриппа при парентеральном введении мышам инак-тивированной гриппозной вакцины Флюарикс, в 6 - 8 раз (Р < 0,05), а введение микрочастиц реацетилированного хитозана (хитина) в состав инакти-вированных гриппозных вакцин сопровождалось, по данным ИФА, повышением титра сывороточных антител в 5 - 15 раз (Р < 0,05). Как видно из этих данных, несмотря на существенные различия физико-химических свойств, эти модификации хитозана обладали сходными хорошими адъювантными свойствами.

С другой стороны, некоторые модификации хитозана характеризовались полным отсутствием адъювантных свойств. Как видно из таблицы 2, у N-сукциноила хитозония со значительной степенью замещения NH2-групп (56%) и, следовательно, значительным снижением суммарного положительного заряда полностью отсутствовали адъювантные свойства. В большинстве опытов мы наблюдали даже некоторое снижение титров сывороточных антител в РЗГА и ИФА при парентеральном введении мышам инактивированных гриппозных вакцин в комбинации с данным соединением, что указывало на наличие слабовыраженных иммуносупрессиру-ющих свойств. Почти полное отсутствие адъювант-ного действия отмечено у хлорида хитозана. Парентеральное введение мышам вакцин Ваксигрип и Флюарикс, содержащих в качестве адъюванта данный препарат, не сопровождалось повышением титров сывороточных антител, ингибирующих гемагглютинирующие свойства вируса гриппа. Данный факт свидетельствует о том, что адъювантные свойства солевых модифицированных форм хитозана могут также зависеть от химической природы противоиона. Модификациям хитозана в виде солевой формы глютаминовой и янтарной кислоты также присущи невысокие адъювантные свойства. Как видно из таблицы 2, в большинстве опытов при введении инактивированной гриппозной вакцины с использованием глютамата/сукцината хитозана в качестве адъюванта наблюдалось только двукратное превышение титров сывороточных антител, ин-гибирующих вирусную гемагглютинацию, по сравнению с контролем.

Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что глютамат хитозана обладает хорошими адъювантными свойствами. Следует отметить, что положительно заряженные NH-группы хитозана

в глютаматном буфере находятся в протонирован-ном состоянии при рН не выше 6,4 - 6,5 и при незначительном повышении рН молекулы хитозана теряют растворимость и выпадают в осадок. Это обстоятельство указывает на целесообразность использования водорастворимых производных хитозана в диапазоне рН 5,0 - 6,2. Однако известно, что гемагглютинин вируса гриппа при кислых значениях рН (5,0 - 5,5) подвергается серьезным кон-формационным изменениям [12], это может приводить к частичному снижению иммунного ответа при использовании инактивированных гриппозных вакцин. Как видно из таблицы 3, контакт вирионов ряда штаммов вируса гриппа типа А, а также инактивированных гриппозных вакцин с 0,05%-ным ацетатным буфером (рН 5,0) приводит к значительному падению гемагглютинирующей активности, что можно объяснить частичным изменением кон-формации гемагглютининов. Парентеральное введение мышам вирионов вируса гриппа или инактивированных гриппозных вакцин, содержащих молекулы гемагглютинина с измененной конформацией, вызывало заметное снижение титра сывороточных антител, ингибирующих гемагглютинирующую вирусную активность (табл. 4).

Представляло интерес также выяснить возможность производных хитозана взаимодействовать с поверхностными белками вирионов вируса гриппа или с липидной оболочкой вирионов. С этой целью к определенному объему вируссодержащей жидкости (штамм А(H2N2)/Краснодар/101/35/59) добавляли равный объем 1%-ного раствора глютамата хитозана, 1%-ной суспензии микро-/наночастиц сульфата хитозана или физраствора (контроль). Смеси инкубировали при комнатной температуре в течение часа и затем титровали в девятидневных куриных эмбрионах. Как видно из таблицы 5, наблюдалось заметное снижение инфекционного титра вируссодержащей жидкости в куриных эмбрионах, инфицированных материалом, содержащим 0,5%-ный глютамат хитозана или 0,5%-ную суспензию микро-/ наночастиц сульфата хитозана, по сравнению с контролем. Можно предположить, что снижение титра инфекционности вируссодержащей жидкости в этом случае обусловлено взаимодействием молекул хитозана с вирионами вируса гриппа и экранированием поверхностных белков вирионов.

На последнем этапе нашей работы мы попытались исследовать адъювантные свойства глютамата хитозана при парентеральном введении мышам инактивированных гриппозных вакцин и вирионов отдельных штаммов вируса гриппа при различных значениях рН. Для этого проводили парентеральное введение мышам инактивированной гриппозной вакцины в комбинации с глютаматом хитозана в качестве адъюванта, имеющим рН 6,2 или 5,0. Как видно из таблицы 6, мы не наблюдали значительных различий в им-муногенности инактивированной гриппозной вакцины Ваксигрип в комбинации с глютаматом хитозана при указанных значениях рН.

Таблица 3.

Гемагглютинирующая активность инактивированных гриппозных вакцин и отдельных штаммов вируса гриппа А при различных значениях рН*

№ Наименование вакцины или гриппозного штамма Гемагглютинирующая активность при рН 7,0 Гемагглютинирующая активность при рН 5,0

1 Флюарикс (GSK) 21 300 ± 9237,2 1877 ± 1138,4

2 Ваксигрип (Sanofi Pasteur) 2389 ± 1564,3 4,6 ± 3,5

3 Гриппол («Микроген») 156 ± 67,2 73 ± 24,7

4 Агрипал (Novartis) 298 ± 195,5 53,3 ± 18,4

5 A(H1N1)IVR-116 482±101,2 179±67,4

6 А(Н1Ш)/Калифорния/7/2009 554 ± 449,1 6,7 ± 2,3

7 А(Н1Ш)/Брисбен/59/07 74,6 ± 48,8 19,7 ± 9,4

8 A(H1N1)/PR8/34 426,6 ± 147,8 106 ± 36,9

9 A(H3N2)/Перт/09/87 149,3 ± 97,7 13,3 ± 4,6

10 A(H2N2)/Краснодар/101/59 534±165,6 189±104,6

11 А(H5N2)/Утка/Пенсильвания/10218/84 170,6 ± 74,2 26,6 ± 9,2

Примечание: *К определенному объему инактивированных гриппозных вакцин или вирусов гриппа добавляли равное количество 0,05 М Трис-Н^-буфера с рН 7,0 или 0,05 М ацетатного буфера с рН 5,0. Затем проводили определение гемагглютинирующей активности проб.

Таблица 4.

Влияние конформационных изменений гемагглютинина вируса гриппа на интенсивность гуморального иммунного ответа мышей* при их парентеральной иммунизации

№ Материал для иммунизации Титр сывороточных антител, ингибирующих гемагглютинацию, у иммунизированных мышей

1 Инактивированная расщепленная вакцина Флюарикс + 0,05 М Трис -Н^-буфер (рН 7,0) 128 ± 56,7

2 Инактивированная расщепленная вакцина Флюарикс + 0,05 М ацетатный буфер (рН 5,0) 32 ± 22,6

3 А(Н1Ш)Ш-116 + 0,05 М Трис-Н^ - буфер (рН 7,0) 597 ± 391,1

4 А(Н1Ш)Ш-116 + 0,05 М ацетатный буфер (рН 5,0) 149 ± 97,7

Примечание: *К определенному объему инактивированной гриппозной вакцины Флюарикс добавляли равный объем 0,05 М Трис-HCL-буфера с рН 7,0 или 0,05 М ацетатного буфера с рН 5,0. Затем проводили внутримышечную вакцинацию мышей в объеме 0,2 мл. Мышей вакцинировали двукратно. Вторую вакцинацию проводили через 21 день после первой. Сыворотку крови иммунизированных животных обрабатывали RDE и определяли титр сывороточных антител с помощью РЗГА.

Таблица 5.

Влияние производныххитозана на биологическую активность вирионов вируса гриппа*

№ Материал для инфицирования куриных эмбрионов (штамм A(H2N2)/Краснодар/101/35/59) Инфекционный титр вируссодержащей жидкости в куриных эмбрионах (lg ЭИД50/0,2 мл)

1 Вируссодержащая жидкость + 1%-ный раствор глютамата хитозана 6,5 ± 0,4

2 Вируссодержащая жидкость + 1%-ная суспензия микро-/ наночастиц сульфата хитозана 7,0 ± 0,5

3 Вируссодержащая жидкость + физраствор (контроль) 8,0 ± 0,4

Примечание: *К 0,5 мл вируссодержащей жидкости добавляли равный объем 1%-ного раствора глютамата хитозана, 1%-ной суспензии микро-/наночастиц сульфата хитозана или физраствора (контроль). Смеси инкубировали при комнатной температуре в течение часа и затем титровали в 9-дневных куриных эмбрионах.

Сравнительное исследование позволяет сделать некоторые выводы о зависимости адъювантных свойств группы производных хитозана от их химических особенностей. Хорошими адъювантными свойствами обладали некоторые солевые формы хитозана. Как видно из наших исследований, большое значение имеет химическая природа противоиона. В частности, ярко выраженными адъювантными свойствами обладал глютамат хитозана, в то время как

хлорид хитозана имел заметно более сниженную адъювантную активность. Ковалентные связи между значительным количеством (56%) первичных NH2-групп хитозана и остатками янтарной кислоты приводили к полной потере адъювантного действия, как это видно на примере натриевой соли ^сукциноила хитозония, и даже способствовали появлению им-муносупрессирующей активности. С другой стороны, препарат реацетилированного хитозана (хитина)

Таблица 6.

Титр гуморальных антител, ингибирующих гемагглютинирующую активность вируса гриппа в крови мышей, иммунизированных инактивированной гриппозной вакциной Ваксигрип в комбинации с глютаматом хитозана, имеющим различные значения рН*

№ Материал для иммунизации Титр сывороточных антител, ингибирующих гемагглютинирующую активность вируса гриппа, к штаммам вируса гриппа, входящих в состав вакцины

A(Н1N1)/Калифоpния/09/07 A(Н3N2)/Пepт/09/87

1 Ваксигрип + глютамат хитозана (0,5%), рН 6,2 384,0 ± 181,0 576,0 ±03,9

2 Ваксигрип + глютамат хитозана (0,5%), рН 5,0 1280,0 ± 1086,1 640,0 ± 543,0

3 Ваксигрип + физраствор, рН 7,0 64,0 ± 24,9 48,0 ± 22,6

4 Неиммунные мыши 8,0 ± 4,0 4,0 ± 2,0

Примечание: *К определенному объему инактивированной гриппозной вакцины Ваксигрип добавляли равный объем 1.0%-ного глютамата хитозония с рН 6,2 или с рН 5,0 или физраствора (контроль). Этими материалами внутримышечно иммунизировали мышей в дозе 0,2 мл. Мышей иммунизировали двукратно. Титр сывороточных антител определяли в РЗГА. В качестве антигенов использовали штамм А(НШ1)/Калифорния/09/07 или А(Н3^)/Перт/09/87.

характеризовался почти полным отсутствием заряженных NH2-rpynn, однако не уступал по эффективности адъювантного действия глютамату хитозана. Этот факт свидетельствует о том, что высокая адъю-вантная активность хитозана не может объясняться только значительным суммарным положительным зарядом N^-групп. По-видимому, определенный вклад в адъювантную активность хитозана могут также вносить ацильные группировки, распределенные кластерами по всей длине молекулы хитозана. Ограниченная деполимеризация молекул глютамата хитозана не ослабляла его адъювантных свойств.

Использование глютамата хитозана в качестве адъюванта наиболее эффективно в условиях слабокислой среды, учитывая большой суммарный положительный заряд N^-групп и высокую растворимость молекул хитозана в этих условиях. С другой стороны, парентеральное введение мышам инактивированных гриппозных вакцин, контактировавших со слабокислой средой (рН 5,0), приводило к заметному снижению титров сывороточных антител, ингибирующих вирус-специфическую гемагглютинацию. Этот факт можно объяснить конформационными изменениями молекул гемагглютинина, а также их агрегацией в результате обнажения гидрофобных участков этих молекул [12].

В этой связи было целесообразно провести сравнительное исследование адъювантных

свойств хитозана при различных физиологических значениях рН с целью нахождения определенного оптимума. Как показали наши исследования, глютамат хитозана обладает хорошими адъювантны-ми свойствами как при рН 6,2, так и при рН 5,0. Эти факты позволяют сделать вывод, что препарат нейтрализует воздействие слабокислой среды на гемагглютинин и в какой-то степени блокирует изменение конформации молекул гемагглютинина. Молекулярный механизм этого явления неясен, однако можно предположить, что взаимодействие молекул хитозана с поверхностными белками ви-риона может привести к повышению ригидности молекул гемагглютинина.

Выводы

1. Высокая адъювантная активность хитозана не может объясняться только значительным суммарным положительным зарядом.

2. Ограниченная деполимеризация молекул глютамата хитозана не ослабляла его адъювантных свойств.

3. Глютамат хитозана обладает хорошими адъю-вантными свойствами как при рН 6,2, так и при рН 5,0. Препарат нейтрализует воздействие слабокислой среды на гемагглютинин вируса гриппа и в какой-то степени блокирует изменение конформации гемагглютинина. ш

Литература

1. Руководство к практическим занятиям по генетике / Под ред. проф. М.Е. Лобашева.- М.: Просвещение, 1972. С. 135 - 146.

References

1. Rukovodstvo k prakticheskim zanjatijam po genetike / Pod red. prof. M.E. Lobasheva. - M.: Prosveshchenie, 1972. P. 135 - 146.

Bacon A., Makin J., Sizer PJ. et al. Carbohydrate biopolymers enhance antibody responses to mucosally delivered vaccine antigens // Infect. Immun. 2000. V. 68. P. 5764 - 5770.

Claassen I., Osterhaus A. The ISCOM structure as an immune-enhancing moiety: experience with viral systems // Res. Immunol. 1992. V. 143. P 531 - 540. Ghendon Y., Markushin S., Krivtsov G., Akopova I. Chitosan as an adjuvant for parenterally administered inactivated influenza vaccines // Arch. Virol. 2008. V. 153. P. 831 - 837.

Ghendon Y., Markushin S., Vasiliev Y. et al. Evaluation of properties of chitosan as an adjuvant for inactivated influenza vaccines administered parenterally // J. Med. Virol. 2009. V. 81. P 494 - 506.

Gupta R., Siber G. Adjuvants for human vaccines - current status, problems and future prospects // Vaccine. 1995. V. 13. P 1263 - 1276. Gupta R., Rost D., Relyyeld E. et al. Adjuvant properties of aluminium and calcium compaunds / In: Powell M., Newman M. (eds.). Vaccine design: the subunits and adjuvant approach - N.Y.: Plenum Press, 1995. P. 229 - 248.

8. Kendal A., Pereira M., Skehel J. Concepts and procedures for laboratory-based influenza surveillance, distributed by the viral diseases unit. - Geneva: WHO, 1984.

9. Kensil C. Saponins as vaccines adjuvants // Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 1996. V. 13. P 1 - 55.

10. Podda A. The adjuvanted influenza vaccine with novel adjuvants: experience with the MF 59 - adjuvanted vaccine // Vaccine. 2001. V. 19 (17 - 19). P. 2637 - 2680.

11. Podda A., Del Guidice G. MF 59-adjuvanted vaccines: increase immunogenicity with an optimal safety profile // Expert Rev. Vaccines. 2003, V. 2. P. 197 - 204.

12. Skehel J., Bayley P, Brown E. et al. Changes in the conformation of influenza virus hemagglutinin at the pH optimum of virus-mediated membrane fusion // PNAS. V. 79. P. 968 - 972.

13. The 2004 - 2005 WHO Influenza reagent kit for identification of influenza isolates (2004) WHO collaborating center for reference and research on influenza. (CDC, Atlanta, Georgia, 30333, USA.) US Department of Health and Human services.

14. Rowe T., Abernathy R., Hu-Primmer J. et al. Detection of antibody to avian influenza A(H5N1) virus in human serum by using a combination of serological assays // J. Clin. Microbiology. 1999. V. 37. P 937 - 943.

ИНФОРМАЦИЯ CDC

Регистрация 13-валентной пневмококковой конъюгированной вакцины для лиц старше 50 лет - заключение Комитета по иммунизационной практике США

13-валентная пневмококковая конъюгированная вакцина (Превенар 13, ПКВ-13) была впервые зарегистрирована Агентством по пищевому и лекарственному контролю США для активной иммунизации детей в возрасте 6 недель - 71 месяца в 2010 году. В настоящее время рекомендован график вакцинации, состоящей из четырех доз, начиная с двухмесячного возраста. 30 декабря 2011 года Агентство утвердило новое показание - иммунизация взрослых старше 50 лет для защиты против пневмоний и инвазивных пневмококковых инфекций, вызванных серотипами, включенными в 13-валентную вакцину. Регистрация ПКВ-13 для иммунизации взрослых проводилась по ускоренной процедуре, которая позволяет Агентству регистрировать препараты для лечения и профилактики тяжелых и угрожающих жизни заболеваний на основании предварительных данных об их эффективности. Регистрация ПКВ-13 была основана на исследованиях иммуногенности, в которых сравнивались уровни выработки антител в ответ на вакцинацию ПКВ-13 и зарегистрированной полисахаридной 23-валентной вакциной (ППВ-23). Следует отметить, что до настоящего момента не показана корреляция уровня выработанных после вакцинации антипневмококковых антител и защитной эффективности вакцины против пневмонии и инвазивных пневмококковых заболеваний у взрослых (в отличие от детей).

В двух рандомизированных многоцентровых исследованиях иммуногенности, проведенных в США и Европе, взрослые старше 50 лет были привиты ПКВ-13 или ППВ-23. Функциональный антительный ответ определяли через месяц после вакцинации методом определения опса-нофагоцитирующей активности (ОПА). У привитых взрослых 60 - 64 лет ПКВ-13 вызывала выработку антител к 12-ти общим серотипам в равной степени или выше по сравнению с ППВ-23, также отмечался высокий антительный ответ на серотип 6А (уникальный для ПКВ-13). Уровень ОПА антител после вакцинации ПКВ-13 у лиц 50 - 59 лет был не ниже, чем у 60 - 64-летних, ко всем 13 серотипам. У лиц старше 70 лет, привитых ППВ-23 не менее чем за пять лет до включения в исследование, уровень ОПА антител после вакцинации ПКВ-13 был равным или выше, чем после ППВ-23, по общим 12 серотипам, а для 10-ти из 12 серотипов иммунный ответ был достоверно выше. При продолжении наблюдения в течение одного года было показано, что уровень ОПА антител снижается, но после повторной вакцинации ПКВ-13 антитела вы-

рабатываются в том же титре, что и после первичной, а при вакцинации ПКВ-13 через год после введения ППВ-23 ОПА-титр антител был ниже, чем после иммунизации одной дозой ПКВ-13.

Безопасность ПКВ-13 оценивалась более чем у 6000 привитых, как ранее не получавших вакцинацию ППВ-23, так и привитых ППВ-23 в анамнезе. Общая частота серьезных нежелательных явлений в течение месяца после вакцинации ПКВ-13 или ППВ-23 составляла 0,2 - 1,7%. В последующие пять месяцев после вакцинации частота нежелательных явлений регистрировалась у 1,2 - 5,8% привитых ПКВ-13 и у 2,4 - 5,5% - ППВ-23. Частота нежелательных явлений была одинаковой в группе ранее не привитых против пневмококковой инфекции и в группе привитых ППВ-23 до включения в исследование. Распространенными поствакцинальными реакциями после введения ПКВ-13 были болезненность, покраснение и отек, ограничение движений в месте инъекции, усталость, головная боль, озноб, снижение аппетита, генерализованная мышечная боль и боль в суставах. Подобные реакции наблюдались и после вакцинации ППВ-23.

В настоящее время зарегистрированы две вакцины для предотвращения пневмококковой инфекции у взрослых - ПКВ-13 и ППВ-23. Комитет рекомендует однократную вакцинацию ППВ-23 всем лицам, достигшим 65 лет, и иммунокомпрометированным пациентам (в том числе с почечной недостаточностью и нефротическим синдромом), пациентам с функциональной или анатомической аспленией, с кохлеарными имплантами и подтеканием спинномозговой жидкости, иммунокомпетентным лицам с заболеваниями (алкоголизм, сахарный диабет, хронические заболевания легких), а также курильщикам.

Комитет не рекомендует рутинную вакцинацию ППВ2-3 из-за недостаточных доказательств ее клинической эффективности, длительности сохранения иммунитета и безопасности.

ПКВ-13 пока не рекомендована Комитетом (до получения дополнительной информации об использованию у лиц в возрасте старше 50 лет согласно инструкции по применению препарата.

Комитет продолжит рассмотрение новых появляющихся доказательств эффективности и безопасности ПКВ-13 для рутинной иммунизации взрослых старше 50 лет.

Источник: MMWR. 2012. V. 61 (21). Р. 394, 395.