CC BY
35
УДК 616.36-002-076.4
ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ КАК МЕТОД КОНТРОЛЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ТЕРАПИИ БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ ГЕПАТИТОМ С
В.М. Цыркунов, С.П. Лукалмк, Р.И. Кравчук, В.М. Шйбак,
А. С. Егоров
УО «Гродненский государственный медицинский университет» ГНУ ««Институт физиологии НАН Беларуси»
Изучены изменения ультраструктуры гепатоцитов больных хроническим гепатитом С. Анализ полученных данных показал, что у больных с полным ответом (ПО) на интерферонотерапию сохраняются признаки незавершенности патологического процесса. Изменения ультраструктуры гепатоцитов при хроническом гепатите С могут быть использованы в качестве предикторов прогноза исхода естественного течения гепатита и для оценки эффективности терапии.
Ключевые слова: гепатит, гепатоциты, ультраструктура, интерферон.
The changes of the hepatocytes ultrastructure in patients with chronic hepatitis C were studied. The analysis of the findings showed that the signs of continuous hepatic pathologic process preserved in patients with chronic hepatitis C and complete response to interferon treatment. The changes of the hepatocyte ultrastructure in chronic hepatitis C might be used as predictors of the outcome of hepatitis natural course and for evaluating the efficacy of the therapy.
Key words: hepatitis, hepatocytes, ultrastructure, interferon
Введение
Актуальность хронической НСУ-инфекции определяется ростом заболеваемости, высокой частотой хронизации, отсутствием вакцинопрофилак-тики и недостаточно эффективными мерами управления данным заболеванием на организменном уровне [1, 5, 7]. Тактика ведения больных хроническим гепатитом С (ХГС), прогноз и исход заболевания определяются результатами «золотого» диагностического стандарта: клиническое наблюдение, характер биохимического, вирусологического и морфологического ответов на терапию. Одними из основных морфологических методов оценки изменений в печени является световая микроскопия биоптата печени, выполняющая арбитражную функцию в определении активности и стадии болезни [3, 7]. Несмотря на высокую информативность, данный метод не лишен недостатков, в частности, не всегда выявляются специфические признаки, оценка которых может стать основой для более точной диагностики, служить прогнозом осложненного (рецидив, цирроз) или благоприятного исхода гепатита, критерием эффективности лечения или противопоказанием для терапии [2, 6].
Цель исследования - определить значение электронной микроскопии в оценке изменений ультраструктуры гепатоцитов и эффективности лечения у больных с полным ответом (ПО) на интерферо-нотерапии (ИФТ).
Материал и методы
Объектом исследования были 48 больных (возраст - 25,2±1,6 лет, средний стаж болезни - 7,0±1,8 лет, мужчин - 80%, женщин - 20%) с этиологически, биохимически и морфологически верифициро-
ванным ХГС: РНК НСУ в ПЦР, АлАТ 2,37±0,27 ммоль/ч-л, гистологический индекс степени активности (ГИСА, Серов В.В. и др., 1996) - 12,1±0,62 баллов, гистологический индекс стадии хрониза-ции (ГИСХ, Серов В.В. и др., 1996) - 1,2±0,20 баллов.
По данным световой микроскопии наиболее часто у наблюдаемых нами больных встречались такие морфологические признаки ХГС как лимфо-идная инфильтрация портальных трактов, жировая дистрофия гепатоцитов, фиброз. Преобладали больные с 1-й (98,1%) и 2-й (1,9%) стадией хро-низации. При изучении биоптата печени под электронным микроскопом были выявлены следующие ультраструктурные признаки реорганизации паренхиматозного и стромального компартментов печени: гетерогенность гепатоцитов; жировая дистрофия разной степени выраженности с ранней деструкцией липидных капель и формированием по периферии материала повышенной электронной плотности; преобладание гепатоцитов с локальной «опустошенностью» цитоплазмы и наличием в ней вторичных образований в виде резидуальных телец и структур, содержащих электронно-плотные участки и липидные глобулы; «закупорка» синусоидов; гиперплазия пучков коллагеновых волокон в пери-капиллярном пространстве; наличие липоцитов; наличие в цитоплазме связанных с мембранными структурами вирусоподобных частиц (НСУ?), диаметром около 50 нм, умеренной электронной плотности. Выявленные изменения ультраструктуры гепатоцитов в дальнейшем мы использовали в качестве критериев прогноза исходов ХГС после ИФТ (ремиссия, рецидив).
Журнал ГрГМУ 2007 № 1
ПРАКТИКУЮЩЕМУ ВРАЧУ
Интерферон-а2 вводился больным внутримышечно по 3 млн. ЕД 3 раза в неделю в течение 9 -12 мес. До начала ИФТ и после ее завершения производилась биопсия печени с последующим комплексным морфологическим анализом. По результатам ответа на ИФТ больные были разделены на две группы: полный ответ (ПО) и отсутствие ответа (ОО): ПО - нормализация уровня АлАТ в крови при биохимическом исследовании и отсутствие РНК НСУ в крови по данным ПЦР; ОО - сохранение повышенного уровня АлАТ и РНК НСУ в крови после курса ИФТ.
В дальнейшем комплексное исследование больных проводилось только в группе ПО - 10 пациентов: средний возраст - 25,1±2,60, уровень АлАТ -0,6±0,07 ммоль/ч-л, ГИСА - 4,2±1,49 баллов, ГИСХ 0,7±0,21 баллов. Таким образом, исследование на световом микроскопическом уровне показало отсутствие активности патологического процесса и фиброза в печени у части больных ХГС после проведенной ИФТ, что свидетельствовало о «морфологическом выздоровлении». В связи с этим было интересным оценить ультраструктурную динамику изменений гепатоцитов по вышеизложенным показателям.
В исследуемых нами образцах печени гетерогенность гепатоцитов сохранялась. «Темные» клетки характеризовались высокой плотностью цитоплазмы, в которой с трудом различались клеточные органеллы, при этом выявлялись многочисленные митохондрии с плотным матриксом и неотчетливыми кристами, более развитая ГрЭС, большее количество свободных рибосом. В гепатоцитах со светлой цитоплазмой митохондрии были более отчетливы и отличались небольшим количеством.
На диаграммах представлены данные, позволяющие оценить эффект ИФТ в зависимости от исходного показателя.
Как видно из диаграммы 1, после проведенной ИФТ частота встречаемости признака уменьшилась с 80% до 42,9%.
До начала ИФТ часто обнаруживались гепато-циты в состоянии жировой дистрофии разной степени выраженности с наличием вокруг липидных капель материала повышенной электронной плотности, который формируется, вероятно, в ответ на воздействие НСУ. В результате проведенного лечения показатель изменился. Данные представлены на диаграмме 2 и 3.
Как видно из диаграмм 2 и 3, в группе ПО после ИФТ выраженность жировой дистрофии уменьшилась со 100% до 71,4% с наметившейся тенденцией к уменьшению численности липид-ных включений с окаймлением по периферии с 40% до 28,6%.
Важным показателем
43% 43% 42% 42% 41% 41% 40% 40% 39% 39%
>
40%
42,9%
Опустошенность цитоплазмы
80% 60% 40% 20% 0%
"Г
80%
42,90%
□ до лечения □ после лечения
Диаграмма 1. Распределение признака частоты встречаемости гетерогенности гепатоцитов в динамике ИФТ в группе ПО
100%-80%-60%-40%-20%-0%
_
100%
71,4%
жировая дистрофия
_
28,60%
□ до лечения □ после лечения
окаим ление липидных капель
Диаграммы 2 и 3. Распределение частоты встречаемости признака жировой дистрофии и окаймления липидных капель по периферии в динамике ИФТ в группе ПО
были изменения гепатоцитов, характеризующиеся частичной «опустошенностью» цитоплазмы и снижением содержания гликогена в сочетании с неизмененными ядрами. Такой признак рассматривается как «превентивное клеточное торможение», носящее защитный характер, либо как период «санации» гепатоцитов от деструктивных органелл с последующим восстановлением ультраструктурной организации [4]. Как подтверждение данного предположения, «опустошенность» цитоплазмы сочеталась с выявлением в ней вторичных образований. Данные о частоте и характере этих изменений в гепатоцитах в динамике ИФТ у больных ХГС представлены на диаграмме 4, 5, 6.
Как видно из диаграмм 4, 5, 6, в группе ПО до начала ИФТ численность гепатоцитов с наличием «опустошенности» цитоплазмы составляла 40%. После проведенного лечения ИФН существенного изменения в данном показателе не произошло (42,9%). Резидуальные тельца наблюдались значительно реже (42,9%), в цитоплазме гепатоцитов увеличилось количество структур, содержащих
80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%
_
80%
42,90
%
Резидуальные тельца
80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%
ж
40%
71,40%
□ до лечения □ после лечения
Структуры, содержащие эл.-пл. участки и липид ные глобул ы
Диаграммы 4, 5, 6. Распределение частоты встречаемости «опустошенности» цитоплазмы гепатоцитов, признака наличия вторичных образований в цитоплазме гепатоцитов в динамике ИФТ в группе ПО
электронно-плотные участки и липидные глобулы с 40% до 71,4%.
Для морфофункцио-нальной оценки гепатоцитов представляется важным определение состояния синусо-идов, которые являются структурными компонентами микроцир-куляторного русла печени и определяют ин-
74% 72% 70% 68% 66% 64% 62% 60% 58% 56% 54%
71,40%
60%
70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%
60%
42,90%
61%
60% 60% 59% 59% 58% 58% 57% 57% 56% 56%
60%
57,10 %
Закупорка синусоидов
Пучки коллаг. волокон в перисинус. пр-ве
Липоциты активные
□ до лечения □ после лечения
Диаграмма 7, 8, 9. Распределение частоты встречаемости признаков закупорки синусоидов, формирования пучков коллагеновых волокон в перисинусоидальном пространстве, встречаемости липоцитов в динамике ИФТ в группе ПО
тенсивность гематотканевого обмена. Данные представлены на диаграммах 7, 8, 9.
Как видно из диаграмм 7, 8, 9, у больных с ПО до начала ИФТ «закупорка» просветов синусоид-ных капилляров наблюдалась в 60% случаев. В синусоидах определялись клеточный детрит, единичные вакуоли, эритроциты, лимфоциты, гранулярные лейкоциты, липидные капли. Встречались звездчатые клетки Купфера. Пространства Диссе были умеренно расширены, в них со стороны гепатоци-тов внедрялось значительное количество удлиненных микроворсинок. После проведенного курса лечения возросло число пациентов, у которых степень выраженности «закупорки» синусоидов увеличилась (71,4%).
Характерным признаком при HCV-инфекции являлось усиленное формирование крупных пучков коллагеновых волокон в перикапиллярном пространстве. Наблюдалась тенденция к снижению колла-генизации перикапиллярных пространств: до начала ИФТ признак наблюдался в 60% случаев, после проведенной ИФТ - в 42,9% в динамике ИФТ в группе ПО.
В связи с этим было интересно проанализировать частоту встречаемости липоцитов - клеток продуцентов коллагеновых волокон - в динамике ИФТ. Как видно из диаграммы, в группе ПО до начала ИФТ липоциты встречались в 60% случаев. Чаще содержали мелкие и немногочисленные липидные капли, однако встречались клетки, в цитоплазме которых наблюдались и крупные жировые включения. После проведенной ИФТ количество липоцитов существенно не изменилось, однако в их цитоплазме уменьшилось число крупных капель, увеличилось число гетерогенных липоци-тов с содержанием как мелких, так и крупных жировых включений.
Выводы
1. Вирус гепатита С вызывает в клетках печени комплекс стереотипных структурных изменений: мелкокапельная жировая дистрофия гепатоцитов с ранней деструкцией липидных капель и формированием материала повышенной электронной плотности по периферии; преобладание гепатоци-тов с обратимой редукцией цитоплазматических органелл, визуальной картиной «опустошенности» клеток и наличием в цитоплазме вторичных обра-
зовании; гиперплазия пучков коллагеновых волокон в перикапиллярном пространстве; увеличение количества липоцитов; вирусоподобных частиц, диаметром около 50 нм, умеренной электронной плотности, связанных с мембранными структурами.
2. Изменения показателей ультраструктуры гепатоцитов при ХГС более информативны, чем данные световой микроскопии, так как более точно отражают изменения внутриклеточных компонентов, функционально и структурно ответственных за внутриклеточный метаболизм, рецепторные взаимоотношения между гепатоцитом, его органел-лами и вирусом С.
3. У больных ХГС с ПО на ИФТ имеет место изменение метаболической активности гепатоци-тов: сохраняются признаки незавершенности патологического процесса в печени в виде изменений ультраструктуры гепатоцитов: гетерогенность гепатоцитов - 42,9%, жировая дистрофия разной степени выраженности - 71,4% с формированием материала повышенной электронной плотности по периферии липидных капель - 28,6%, «опустошенность» цитоплазмы - 42,9%, наличие вторичных образований в цитоплазме (резидуальные тельца - 42,9%, структуры, содержащие электронно-плотные участки и липидные глобулы 71,4%), «закупорка» синусоидов - 71,4%, гиперплазия пучков коллагеновых волокон в перикапиллярных пространствах в умеренном и большом количестве - 42,9%, наличие активных липоцитов - 57,1%.
Литература
1. Змушко, Е.И. Вирусный гепатит / Е.И. Змушко, Е.С. Белозеров, Е.А. Ионниди. - Москва, 2002. - 157 с.
2. Лукашик, С.П. Патоиммуноморфогенез первичнохроническо-го гепатита С / С.П. Лукашик, В.М. Цыркунов, Р.И. Кравчук / / Инфекционные болезни. - 2006. - Т. 4. - № 2. - С. 10 - 16.
3. Серов, В.В. Морфологическая диагностика заболеваний печени / В.В. Серов, Лапиш К. - М.: «Медицина», 1989. - 337с.
4. Ультраструктурные реакции клеточных популяций печени при действии РНК- и ДНК-геномных вирусов гепатата В+С / Непомнящих Г.И., Толоконская Н.П., Непомнящих Л.М., Айда-гулова С.В. // Бюлл. эксперим. биологии и медицины. - 1999. -Т.128. - №7. - С.101-105.
5. Цыбин, А.К. Структура инфекционной заболеваемости в Беларуси в 2003 г. / А.К. Цыбин, А.А. Астапов, И.А. Карпов // Здравоохранение, 2004.-№ 12.- С.3 - 9.
6. Хронический вирусный гепатит / Под. ред. В.В. Серова, З.Г. Апросиной. - М.: Медицина, 2002. -384 с.
7. Desmet, J.G. Classification of chronic hepatitis: diagnosis, grading and staging / J.G. Desmet, M. Gerber, J.H. Hoofnagele // Hepatol.ogy, 1994. -Vol. 19. - P. 1513-1520.
Поступила 30.01.07
