Электрическое поле в цитомембране как фактор интенсификации метаболизма клеток Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

ТЕОРИЯ ЭВОЛЮЦИИ

ЭЛЕКТРИЧЕСКОЕ ПОЛЕ В ЦИТОМЕМБРАНЕ КАК ФАКТОР ИНТЕНСИФИКАЦИИ МЕТАБОЛИЗМА КЛЕТОК

1Зарицкий А. Р., 1Зайцева Г. В., 2Грачев В. И., 1Кириченко М. Н.

Физический институт им. П.Н. Лебедева, Российская академия наук, http://www.lebedev.ru 119991 Москва, Российская Федерация

2Институт радиотехники и электроники им. В.А. Котельникова, Российская академия наук, http:// www.cplire.ru

125009 Москва, Российская Федерация Поступила 28.05.2016

В работе рассматривается эволюционное развитие клеточных структур и роль в этом процессе электрических полей в цитомембране. Перечислены каналы генерации трансмембранной разности потенциалов в липидном бислое цитомембраны. Показано, что она осуществляется за счет выхода протонов при утилизации энергоёмких субстратов в цитоплазме, а также за счет различных скоростей проточного метаболизма липидной массы во внутреннем и внешнем слоях цитомембраны. Рассмотрены механизмы генерации полей в углеводородной части мембраны (в области липидных «хвостов») при согласованном наклоне «головок» липидов в одном из слоев. Приводятся аргументы в пользу того, что измеряемый на опыте потенциал Доннана не является потенциалом термодинамического равновесия, а существует из-за наличия в клетках архаичного метаболизма. Показано, что под влиянием электрического поля в мембране возникает асимметрия ее проницаемости для молекул, обладающих дипольным моментом и максимумом электронной плотности на их отрицательном или положительном концах. В процессе эволюции эта асимметрия проницаемости цитомембраны определила отбор молекул в цитоплазму по хиральной асимметрии, связанной с дипольным моментом. Это объясняет наличие в живом мире только тех молекул, которые имеют одну и ту же хиральность по отношению к своему дипольному моменту. В опытах с эритроцитами показано, что чем сильнее поле на их мембране, тем более значимо перераспределение глюкозы (имеющей дипольных момент и минимум электронной плотности на положительном «острие» диполя) из плазмы крови в цитоплазму. В опытах также обнаружен предсказанный эффект асимметрии проницаемости мембраны эритроцита для воды, обеспечивающий сохранение объема эритроцитов при оксигенации венозной крови.

Ключевые слова: липидный бислой, трансмембранный потенциал, проточный метаболизм, диполь, домен, потенциал Доннана, асимметрия проницаемости, глюкоза, вода, осмотические частицы

УДК: 576.1+551.7

Содержание

1. Введение (92)

2. Трансмембранная разность потенциалов как один из ведущих факторов в становлении, эволюционном развитии и функционировании клеток (92)

2.1. Неизбежность появления электрического поля в липидах мембран живых клеток (92)

2.2. Электрическое поле в цитомембране как фактор отбора органических соединений по типу симметрии в

формирующихся клетках (закон пастера-Кюри) (95)

3. Асимметрия проницаемости липидных мембран для молекул воды под действием электрического поля (эффект Чарахчьяна) (97)

4. Экспериментальные исследования эффекта асимметрии проницаемости цитомембран для молекул глюкозы и воды (97)

4.1. Асимметрия проницаемости цитомембран для глюкозы (98)

4.2. Асимметрия проницаемости

ТЕОРИЯ ЭВОЛЮЦИИ

цитомембран для воды (99)

5. обсуждение результатов (99)

6. заключение (102) литература (102)

1. ВВЕДЕНИЕ

Генеральной линией развития клеточного мира с самого начала его зарождения является неуклонная интенсификация энергетического метаболизма клеточных структур. В настоящей работе рассматривается роль в этом процессе такого фактора, как электрическое поле в цитомембране.Известно,чтотрансмембранный потенциал клеток отрицателен и варьируется в пределах примерно от 10 мВ до 150 мВ. Поэтому напряженность поля в липидах таких мембран может достигать 10-15 кВ/мм, то есть может находиться вблизи пробойной зоны. Порог электрического пробоя двойного слоя липидов снижают встроенные и ассоциированные с ним белки. Некоторые из таких белков являются молекулярными насосами и их деятельность направлена на генерацию и подержание трансмембранной разности потенциалов. На синтез этих белков и их функционирование отводится значительная доля энергии, генерируемая в клетках. Предмет настоящей работы — ответ на вопрос, зачем в процессе эволюционных преобразований клеткам потребовалось все более увеличивать трансмембранную разность потенциалов, повышая напряженность поля в липидах вплоть до величин, предшествующих их электрическому пробою.

2. ТРАНСМЕМБРАННАЯ РАЗНОСТЬ ПОТЕНЦИАЛОВ КАК ОДИН ИЗ ВЕДУЩИХ ФАКТОРОВ В СТАНОВЛЕНИИ, ЭВОЛЮЦИОННОМ РАЗВИТИИ И ФУНКЦИОНИРОВАНИИ КЛЕТОК

2.1. неизбежность появления

электрического поля в липидах мембран живых клеток

Эволюционный подход по необходимости должен учитывать основные черты живых систем, которые отличают их от структур неживой природы. Во-первых, это поддержание термодинамически неустойчивого состояния

живой системы, требующее непрерывных затрат свободной энергии. Во-вторых, это проточное гомеостатирование элементов системы — их непрерывная разборка и воспроизведение de novo.

Поддержание состояния липидных везикул (предшественников клеток и первых клеток [1]) обеспечивалось и обеспечивается в клетках в настоящее время за счет генерации в цитоплазме свободной энергии в процессах усвоения энергоемких субстратов. Диссоциация как самих соединений, так и конечных продуктов их распада вызывала в клетках рост концентраций ионов H+. Их выход вместе с продуктами распада в окружающую водную среду и приток крупных соединений, подлежащих ферментативному распаду, обеспечивали стационарность условий обмена веществом клеток с окружающей водной средой. При этом ионы H+, опережая все другие продукты утилизации энергоёмких субстратов, генерировали трансмембранный потенциал в слое липидов. Это ионный канал генерации в клетках трансмембранной разности потенциалов.

Другой канал появления электрических полей в липидах, столь же эволюционно древний, связан с протоком их массы в цитомембранах клеток. Этот канал неизбежно возникает при наличии даже весьма слабого (по сравнению с современными клетками) энергетического метаболизма. Синтез липидов, требующий затрат энергии, осуществлялся и осуществляется в настоящее время только во внутреннем слое мембраны, со стороны цитоплазмы, а их спонтанный и ферментативный распад происходил и происходит в обоих слоях липидов. Поэтому равновесие в протоке липидной массы мембраны устанавливалось лишь при более высокой плотности липидов во внутреннем слое. Оценки показывают, что при одинаковой плотности липидов в наружном и внутреннем слоях вертикально расположенные по отношению к поверхности мембраны дипольные «головки» липидов каждого из слоев обеспечивают скачки потенциала примерно в

ТЕОРИЯ ЭВОЛЮЦИИ

100 мВ. Эти скачки одинаковы по абсолютной величине, однако электрические поля в области «головок» наружного и внутреннего слоёв направлены противоположно. Поэтому в области липидных «хвостов» величина потенциала неизменна и поля нет. Однако эта область находится под отрицательным потенциалом по отношению как к внутренней, так и внешней водной среде (кривая 1 на рис.1а). На поля в «головках» накладываются краевые поля внутренней и внешней водных сред, заряженных отрицательно по отношению к липидам мембраны, что приводит к ослаблению полей в области «головок» и снижению глубины потенциальной ямы в области «хвостов». Кроме того, в пространство между полярными «головками» обоих липидных слоев под воздействием тепловых толчков проникают молекулы воды. Имея большой дипольный момент, они еще больше ослабляют сильное поле в области дипольных «головок» и уменьшают глубину потенциальной ямы в области углеводородных частей обоих слоев липидов примерно до 20 мВ (кривая 2 на рис. 1В).

Более плотной упаковке липидных «головок» внутреннего слоя мембраны соответствует большая величина скачка электрического потенциала, чем для слоя «головок» внешнего слоя. Из-за разной плотности «головок» в углеводородной части мембраны возникает электрическое поле, которое направлено, как и в слое «головок» наружного слоя, в сторону

Наружная 3 Цитоплазма

водная среда ^г^я^гаг^гг^й^гСЗ клетки

цитоплазмы (кривая 3 на рис. 1с). Это поле складывается с полем, генерируемым выходом из цитоплазмы в окружающую водную среду ионов Н+, обуславливая трансмембранную разность потенциалов Дф. Ход потенциала по нормали к мембране, а также величина напряжённости электрического поля в указанном направлении представлены на рис. 1й.

Суммарное электрическое поле в области «головок» наружного слоя стремится наклонить полярные «головки» липидов к поверхности мембраны. В то же время составляющая суммарного электрического поля, генерируемая выходом из цитоплазмы наружу ионов Н+, стремится выпрямить «головки» липидов внутреннего слоя. Следует заметить [2, 3], что из-за тесного расположения «головок» в обоих слоях мембраны «головки» каждого отдельного участка мембраны (домена), ограниченного встроенными в неё белками, могут наклоняться относительно поверхности мембраны только все вместе и в одном направлении. Причем направление наклона липидных «головок» в каждом домене не зависит от положения «головок» в соседних доменах (выпрямлены они или наклонены). Между этими двумя состояниями липидов в доменах с устойчивыми положениями «головок» существуют активационные барьеры. Распределение числа доменов по положениям «головок» в каждом из липидных слоёв мембраны подчиняется соотношению Больцмана и находится в строгом

Наружная 1 водная среда |

а Ь с с1

Рис. 1. Распределения потенциала поля ф по нормали к поверхности мембраны и напряженности поля йф/йг в зависимости

от величины г: а)приусловии, когда дипольный момент липидных «головок» обоих слоёв нормален к поверхности мембраны

и все прочие факторы, влияющие на поле в липидах, не учитываются; Ь)с учетом краевых полей окружающих водных сред и

углеводородной части мембраны, а также отдельных молекул воды, проникающих в толщу полярных «головок»; с)с учетом

большей плотности липидов во внутреннем слое мембраны по сравнению с наружным слоем; й)с учетом выхода ионов Н+,

генерируемых клеткой при наличии метаболизма.

ТЕОРИЯ ЭВОЛЮЦИИ

соответствии с глубиной потенциальных ям, разделённых указанными барьерами [3]. Из-за наличия электрических полей в мембранах липидных везикул и первых клеток количество доменов с полярными «головками» липидов в наклонном положении в наружном слое были представлены в большей мере, чем во внутреннем слое.

Как отмечено выше, наличие энергетического метаболизма обуславливает появление трансмембранной разности потенциалов Дф из-за выхода ионов Н+ из цитоплазмы. Причем из-за малой интенсивности архаичного метаболизма величина Дф (рис. 1с) была много меньше —10 мВ. Отметим, что генерируемое поле направлено в сторону цитоплазмы, стремясь наклонить липидные «головки» внешнего слоя мембраны и выпрямить «головки» внутреннего слоя. Это приводит к понижению активационного барьера для перехода дипольных «головок» наружного слоя липидов из вертикального положения (по отношению к плоскости мембраны) в наклонное положение. После такого перехода скачок потенциала на наружном слое мембраны уменьшается практически в два раза (кривая 5 рис. 2а). Для липидов внутреннего слоя ситуация обратная. Поле в липидах стремится удержать «головки» в вертикальном положении. Активационный барьер их перехода из вертикального положения в наклонное положение возрастает,

что делает переход менее вероятным. В результате воздействия на диполи липидов всех перечисленных выше полей в условиях, сложившихся на рассматриваемом эволюционном этапе, на большинстве доменов наружного слоя мембраны липидные «головки» находились в наклонном положении под углом примерно 60° относительно нормали к поверхности мембраны. «Головки» же внутреннего слоя сохраняли преимущественно вертикальное положение по отношению к поверхности мембраны (рис. 2а). При этом скачок потенциала на «головках» наружного слоя уменьшился примерно в два раза. Разность потенциалов на углеводородной части мембраны устанавливалась равной ~ 10 мВ. Поскольку величина потенциала Дф была много меньше 10 мВ, то в области липидных «хвостов» возникало поле напряжённостью ~ 1 кВ/мм.

Важно отметить, что именно эту разность потенциалов на углеводородной части мембраны принимают за потенциал термодинамического равновесия (потенциал Доннана), который по современным представлениям устанавливается на

цитоплазматической мембране при отсутствии в клетках энергетического метаболизма. Здесь можно выделить сразу две ошибки.

Во-первых, не учитывается влияние архаичных метаболических процессов, унаследованных клетками от прежних

^ -' Цитоплазма клетки

Рис. 2. Распределения потенциала поля ф по нормали к поверхности мембраны и напряженности поля йф/йг в зависимости от величины г: а)с учетом наклона «головок» липидов наружного слоя примерно до 60° относительно нормали к поверхности мембраны; Ь)сучетом работы появившихся в мембране К+/Ша+-АТФаз; с)показано направление эволюционных изменений распределения потенциала поля ф и напряженности поля йф/йг по мере интенсификации метаболизма клеток.

ТЕОРИЯ ЭВОЛЮЦИИ

эволюционных этапов. Эволюционно поздние сложные процессы утилизации энергоемких субстратов сравнительно простоингибировать, подавив известными средствами активность ключевых ферментов, катализирующих реакции окисления. Однако эволюционно самые ранние, простейшие процессы ферментативного распада практически всех соединений, в том числе и самих ферментов, и кумуляции части высвобождающейся при этом химической энергии в макроэргах ингибировать значительно сложнее. Напомним, что эти простейшие процессы, основанные на ферментативном распаде органических соединений (всевозможных «-аз»), обеспечивали проток всех органических соединений в липидных везикулах — предшественниках клеток — и обеспечивают его в настоящее время во всех клетках [1]. Именно так, в протоке вещества, надежно достигалась и достигается нативность (исходная сохранность) свойств подавляющей массы органических соединений,

функционирующих в цитоплазме. Чем выше скорость протока вещества, реализуемого в цитоплазме, тем ниже в ней уровень «испорченных» (вырожденных) органических соединений, не способных выполнять свои функции.

Во-вторых, упомянутая трансмембранная разность потенциалов определяется экспериментально по распределению концентраций заряженных частиц, способных диффундировать сквозь липидные слои по обе стороны мембраны. Это распределение устанавливается благодаря скачку потенциала в 10 мВ на углеводородной части мембраны (рис. 2а), вызванному наклоном основной массы липидных «головок» внешнего слоя. Так как вклад ингибированного основного метаболизма в формирование полей внутри мембраны сведён к минимуму (Дф << 10 мВ), то именно указанный скачок потенциала определяет распределение концентраций заряженных частиц (соотношение Доннана) по обе стороны мембраны.

Суммируя приведенные выше доводы, можно заключить, что при наличии в клетке даже остатков энергетического метаболизма и при отсутствии или ингибировании К+/Ма+-АТФаз на углеводородной части липидов цитомембран неизбежно устанавливается разность потенциалов. Этот фактор вызывает указанное выше перераспределение заряженных частиц, способных проходить через мембрану между цитоплазмой клетки и внешней водной средой. Цитоплазма оказывается под более низким потенциалом, чем окружающая водная среда. Особенностью генерации указанного потенциала (~10 мВ) является его независимость от размеров клетки и диссоциации белков в её цитоплазме. Если предположить, что прекратились все виды энергетического метаболизма клетки, но липиды её оболочки сохранили свою нативность, то разность потенциалов между цитоплазмой и внешней водной средой неизбежно снизилась бы до нуля.

Заключая данный раздел, отметим, что в процессах эволюционного развития клеточного мира появилось новое средство — молекулярный насос К+/Ма+-АТФаза. Его самое раннее эволюционное назначение — за счет повышения трансмембранной разности потенциалов надежно обеспечить на всех участках цитомембран (в областях «головок» и углеводородных «хвостов») наличие поля, направленного внутрь клетки (рис. 2Ь и рис. 2с). Биологическая целесообразность такого нововведения показана ниже.

2.2. Электрическое поле в цитомембране как фактор отбора органических соединений по типу симметрии в формирующихся клетках (закон Иастера-Кюри)

Соединения, составляющие основу

энергоемкого и пластического материала, участвующие в метаболизме современных клеток, как правило, мультипольны. Первый мультипольный момент — электрический дипольный момент системы зарядов органической молекулы направлен от

ТЕОРИЯ ЭВОЛЮЦИИ

отрицательного заряда к положительному. Электрическое поле мембраны, направленное внутрь клетки, «повернет» диполь любой оказавшейся в нем молекулы вдоль своих силовых линий. Мембрана будет проницаема для той молекулы, на острие вектора дипольного момента которой ее электронная плотность, а следовательно, поперечное сечение молекулы будет минимально, причем настолько, что минимальным будет сопротивление ее диффузному продвижению в липидах мембраны.

Правосторонние сахара ^-форма) и левосторонние аминокислоты (Ь-форма) именно таковы. Их дипольный момент направлен к концевой группе —СОН с минимальным поперечным сечением (рис. 3Ь). Один тип симметрии отличается от другого размерами поперечного сечения на острие вектора дипольного момента. Проницаемость мембран для молекул с таким расположением группы —СОН (рис. 3Ь) выше, чем для тех молекул, у которых эта группа расположена на противоположной стороне диполя (рис. 3с). Прохождение молекул воды (рис. 3d) извне в клетку через цитомембрану затруднено, также как для молекул, представленных на рис. 3с. Поперечное сечение на острие диполя у молекулы воды намного больше, чем сечение в "хвосте". Поэтому при наличии поля в мембране вход молекул воды в цитоплазму затруднен по сравнению с выходом. Никаких хиральных элементов в молекуле воды нет, и она не вращает поляризованный свет. Таким образом, эффект вращения молекулой плоскости поляризации света, возникающий при наличии в ней хиральных элементов, не связан напрямую с асимметрией проницаемости мембраны клеток. Определяющими факторами являются наличие дипольного момента молекул и различие в поперечных сечениях на "острие" и "хвосте" диполя. Хиральные элементы, расположенные по отношению к дипольному моменту указанным выше способом, обеспечивали и обеспечивают в настоящее время отбор и накопление биологически активных соединений, необходимых

ех

снгон

'Н

о

AI

+ +

СН20Н

in

a b c d

Рис. 3. Схема распределения электронной плотности (попречного сечения) дипольных молекул: b — правосторонний сахар, с—левосторонний сахар, d — вода. для интенсификации энергетического метаболизма. Этим и объясняется закон Пастера-Кюри1.

Неизбежным следствием рассмотренного феномена является неравенство равновесных концентраций подобных нейтральных молекул во внешней водной среде и цитоплазме с энергетическим метаболизмом. Органические соединения с минимумом их поперечного сечения на острие диполя, находясь в поле мембраны в одинаковых условиях с молекулами, имеющими максимум на острие своего диполя, накапливаются в цитоплазме до больших концентраций. Данное обстоятельство, по-видимому, сыграло решающую роль в выборе клеточным миром органических соединений, составляющих основу энергоемкого и пластического материала в метаболизме живых систем. Мы считаем, что найден по Моисееву Н.Н. [6] «тот тонкий механизм, который способен отличить один тип симметрии молекул от другого».

Отбор органических соединений по типу симметрии, возможно, стал решающим фактором в завершении формирования первых

:Л. Пастер открыл свойство биоорганики вращать вектор колебаний поперечной плоскости световой волны - поляризовать свет, поделив все оргмолекулы на два типа вращающих по и против часовой стрелки. Было показано, что живые организмы используют при синтезе своих материалов либо один из этих типов, либо другой, и никогда оба. Я.Х. Вант Гофф трактовал это свойство биомолекулы наличием асимметричного атома углерода в ее структуре, которая становилась анизотропной [4]. П. Кюри объяснил это свойство биоограники дисимметрией зеркально симметричных биомолекул. У Т. Кельвин назвал эту симметрию хиральной [5].

ТЕОРИЯ ЭВОЛЮЦИИ

клеток в короткие сроки в подходящих условиях на остывающей Земле. Если бы такого отбора не было, то процессы формирования структур-предшественников и первых клеток неизбежно затянулись бы. В этих условиях в связи с невообразимо многократным увеличением новых типов и видов соединений времени для проверки на их полезность в нарождающемся метаболизме могло бы не хватить и появление живого мира не состоялось бы.

3. АСИММЕТРИЯ ПРОНИЦАЕМОСТИ ЛИПИДНЫХ МЕМБРАН ДЛЯ МОЛЕКУЛ ВОДЫ ПОД ВОЗДЕЙСТВИЕМ ЭЛЕКТРИЧЕСКОГО ПОЛЯ (ЭФФЕКТ ЧАРАХЧЬЯНА)

Асимметрия проницаемости (пропускание в одну сторону и непропускание в противоположную) липидных мембран, наведённая их электрическим полем, может иметь место и для молекул, не поляризующих свет.

Молекулу воды, имеющую дипольный момент 1.84 О, следует отнести к классу имеющих максимум поперечного сечения на острие диполя (рис. 3с). Поэтому при наличии электрического поля в липидах цитомембрана представляет собой большее препятствие для входа молекул воды в цитоплазму, чем для выхода из неё. Проницаемость мембраны для потока воды из окружающей водной среды в цитоплазму оказывается ниже, чем из цитоплазмы.

Этот эффект асимметрии проницаемости цитомембраны для воды оказался чрезвычайно полезным для эволюционного развития клетки. Генеральная линия развития клеточного мира включает в первую очередь неуклонную интенсификацию генерации свободной энергии при усвоении энергоемких субстратов. Неизбежным следствием этой линии является накопление в цитоплазме осмотически активных частиц энергоемкого и пластического материала, а также концентрация соединений ферментативной и регуляторной базы. Поэтому осмотический поток воды в клетки неуклонно возрастал. Этому росту был противопоставлен соответствующий компенсаторный поток

воды из клеток, который обеспечивался возрастающей асимметрией проницаемости цитомембран для её молекул.

Усиление электрических полей и регулирование их напряженности в липидах стали обеспечиваться с появлением новых средств. Одним из них являются молекулы К+/Ыа+-АТФазы, действие которых повышает трансмембранную разность потенциалов и, следовательно, напряженность поля в липидах мембран. Эволюционно более раннее авторегулирование асимметрии проницаемости мембран клеток для воды сформировалось на способности белков и их комплексов ассоциироваться с мембраной и тем самым ослаблять поле в липидах. Эффект увеличения неспецифической проницаемости мембран, вызванный ослаблением поля в липидах при ассоциации с ними крупных частиц, показан в работе [7].

Завершая данный раздел, следует затронуть историю вопроса об асимметрии проницаемости мембран для молекул воды. На возможность появления этого эффекта под воздействием электрического поля в тонких пленках из органического материала, проницаемых для молекул воды, впервые указал и экспериментально исследовал сотрудник Физического института им. П.Н. Лебедева РАН (ФИАН) Андрей А. Чарахчьян. К сожалению, результаты своих экспериментов он не опубликовал, но за эффектом наведенной электрическим полем асимметрии проницаемости цитомембраны для воды, в наших работах закрепилось название «эффект Чарахчьяна».

4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ЭФФЕКТА АСИММЕТРИИ ПРОНИЦАЕМОСТИ ЦИТОМЕМБРАН ДЛЯ МОЛЕКУЛ ГЛЮКОЗЫ И ВОДЫ

В качестве модели для экспериментальных исследований были выбраны эритроциты цельной крови человека. В пробы донорской крови объёмом 5-10 мл добавлялся стандартный антикоагулянт ЭДТА-К2.

ТЕОРИЯ ЭВОЛЮЦИИ

4.1. Асимметрия ПРОНИЦАЕМОСТИ

ЦИТОМЕМБРАН для глюкозы

На первом этапе исследовалось влияние изменений напряженности электрического поля в мембране эритроцитов на равновесное распределение концентрации глюкозы между плазмой крови и цитоплазмой эритроцитов.

Известно, что молекулы деоксигемоглобина в биологическом интервале значений показателя кислотности цитоплазмы имеют значительно больший заряд [8], чем молекулы оксигемоглобина. Поэтому в указанных условиях они образуют комплексы с молекулами 2.3-дифосфоглицерата, концентрация

которых в эритроцитах примерно такая же, как и концентрация молекул гемоглобина [9]. В свою очередь, эти комплексы обладают большим сродством к мембране эритроцита, чем молекулы оксигемоглобина [7]. Поэтому адсорбированный на внутренней поверхности мембраны слой таких комплексов в эритроцитах венозной крови на десятки процентов толще, чем в эритроцитах артериальной крови. Наши измерения дали 2.5 слоя для комплексов в венозной крови и 1.5 слоя для молекул оксигемоглобина в артериальной крови.

Так как размеры молекул гемоглобина сравнимы с толщиной мембраны эритроцитов, то при одинаковой трансмембранной разности потенциалов ассоциация и диссоциация этих молекул с мембраной существенно меняет напряженность поля. Очевидно, что при оксигенации венозной крови напряженность поля в мембране эритроцита возрастает в строгом соответствии с уменьшением толщины мембраны, которая включает слои адсорбированного на ней гемоглобина, то есть на десятки процентов.

Для проверки рассматриваемого эффекта был проведен следующий эксперимент. Пробу венозной донорской крови, стабилизированную ЭДТА-К2, разделили на две равные по объему части. Одну часть крови быстро насытили кислородом (оксигенировали), после чего, размешивая ее, выдержали в течение 15 минут. Далее обе части крови отстаивали в пробирках в течение

1.5-2-х часов в условиях естественного оседания эритроцитов для отделения плазмы от других фракций крови. После забора плазмы из обеих пробирок получили соответственно пробу №1 (плазма венозной крови) и пробу №2 (плазма оксигенированной крови — аналог артериальной).

Далее измерили концентрации глюкозы п и п в этих пробах. Оказалось, что измеренные величины п1 и п2 существенно отличаются, а их средние значения, определенные по серии отдельных измерений, лежат друг от друга за пределами погрешности одного измерения.

Если бы исследуемого эффекта не было, то величина п = п / п, при наличии в цитоплазме эритроцитов гликолиза, в пробах стабилизированной донорской крови равнялась бы 1. Экспериментально измеренная величина скорости потребления глюкозы исследуемой кровью составляла примерно 0.40.5 ммоль/час, что указывало на полноценный гликолиз в цитоплазме эритроцитов во всех пробах. Однако оказалось, что отношение п = п1/п2 > 1.1. Это свидетельствовало об эффекте влияния электрического поля в липидах на асимметрию проницаемости эритроцитарной мембраны для глюкозы.

Окончательная точка в доказательстве эффекта асимметрии проницаемости клеточных мембран для молекул глюкозы была поставлена после следующих опытов.

Насыщенную кислородом пробу цельной крови (той же самой, что была упомянута выше) подвергли процессу деоксигенации (удалению из неё кислорода) до уровня, соответствующему венозной крови (40 мм рт. ст. в плазме). Измерили концентрацию глюкозы в этой пробе. Далее путем естественного оседания эритроцитов отделили плазму от клеток крови, после чего измерили концентрацию глюкозы в отобранной плазме. Результаты измерений показали,чтовеличиныконцентрацийглюкозы, как в пробе цельной деоксигенированной крови, так и в деоксигенированной плазме после её отделения от других фракций крови, восстанавливаются практически до исходного уровня глюкозы в цельной венозной крови.

ТЕОРИЯ ЭВОЛЮЦИИ

Наблюдаемое незначительное понижение этих величин следует отнести либо к инерционности структурной перестройки липидов при изменении напряженности поля в мембране эритроцитов, либо к снижению измеряемых концентраций, связанных с утилизацией глюкозы в процессах её усвоения в цитоплазме эритроцитов, либо и к первой и ко второй причинам, вместе взятым.

Итак, при наличии гликолиза в эритроцитах поддерживается наведенная электрическим полем асимметрия проницаемости их мембран для молекул глюкозы.

4.2. Асимметрия проницаемости цитомембран для воды

Экспериментальные исследования асимметрии проницаемости цитомембран для воды также проводились на эритроцитах донорской крови человека. Пробу цельной венозной крови, стабилизированной антикоагулянтом ЭДТА-К2, разделили на две пробирки. Кровь в одной из пробирок насытили кислородом до уровня артериальной крови. С помощью капиллярной центрифуги определили величину гематокрита в обеих пробирках — в пробе венозной крови и в пробе оксигенированной крови. После оксигенации венозной крови должен наблюдаться прирост объёма эритроцитов, а, следовательно, и гематокрита, вызванный увеличением осмолярности цитоплазмы эритроцитов примерно на 5 ммоль из-за диссоциации комплексов молекул 2.3-дифосфоглицерата и молекул гемоглобина. К этому следует добавить увеличение осмолярности

цитоплазмы, вызванное перераспределением молекул глюкозы при оксигенации крови, рассмотренным выше.

Оценки показывают, что гематокрит крови, измеряемый в процентах, после насыщения крови кислородом должен был бы увеличиться не менее чем на 1%. Но в сериях измерений (с использованием не менее 6 капилляров для каждой пробы) величина гематокрита для пробы оксигенированной крови оказалась на 0.2% меньше, чем для пробы венозной крови.

Погрешность среднего значения гематокрита в каждой серии составляла менее 0.05%.

Таким образом, избыточный осмотический поток воды в цитоплазму эритроцитов, связанный с ростом осмолярности цитоплазмы при насыщении крови кислородом, с высокой точностью компенсируется дополнительным потоком воды из эритроцитов в плазму крови, вызванным ростом асимметрии проницаемости мембран для молекул воды под воздействием возросшей напряженности электрического поля в липидах мембраны.

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Эволюционный подход к анализу биологической значимости отрицательного потенциала на цитомембранах позволил выявить неизбежность его появления при наличии метаболизма у клеток и их непосредственных предшественников. В первую очередь это касается проточного гомеостаза липидов цитомембран.

Покажем, что так называемый потенциал Доннана, равный ~10 мВ, не является потенциалом термодинамического равновесия, а реализуется из-за наличия в клетках архаичного метаболизма. При выключении в клетках эволюционно более поздних типов энергетического метаболизма сравнительно быстро снижается трансмембранная разность потенциалов. Архаичный метаболизм, основанный на освобождении химической энергии только посредством одноактного органического катализа распада сложных соединений, выключить чрезвычайно трудно. Для этого требуется ингибировать действие всех ферментов. Поэтому даже при выключении основных процессов энергетического метаболизма в клетках всегда остается, хоть и слабый, но устойчивый архаичный источник свободной энергии, за счет которого и генерируется указанный потенциал. При выключении архаичного источника энергии, то есть при термодинамическом равновесии, потенциала на мембране клетки не будет.

Эксперименты с эритроцитами

консервированной донорской крови показали,

ТЕОРИЯ ЭВОЛЮЦИИ

что энергии этого источника достаточно для поддержания у них указанной выше трансмембранной разности потенциалов в течение продолжительного времени — от нескольких недель до 2-3-х месяцев. Несмотря на то, что запасы глюкозы в эритроцитах за такой период успевали израсходоваться, эритроциты не утрачивали своей способности насыщаться кислородом: при насыщении кислородом пробы крови меняли свой цвет с темно-красного на алый. Следовательно, энергии хватало для восстановления части метгемоглобина в нормальный гемоглобин. Поэтому не может быть речи о переходе эритроцитов в термодинамически устойчивое состояние.

При отсутствии или нехватке энергоемкого и пластического материала клетки «поедают» сами себя, то есть утилизируют в процессах энергетического метаболизма соединения, составляющие основу их структур. При этом ведущую роль в утилизации соединений играют всевозможные «-азы», например, пептидазы, липазы и другие, действие которых обеспечивает дополнительный приток свободной энергии в клетке и проток органических соединений в их цитоплазму.

Наличие трансмембранной разности потенциалов и, соответственно, электрического поля в липидах обуславливают появление асимметрии проницаемости цитомембран для молекул органических соединений и молекул воды, имеющих дипольный момент. В процессах зарождения и эволюционного развития клеточного мира из-за указанного феномена произошёл отбор органических соединений по типу симметрии (закон Пастера-Кюри). При всех равных условиях во внешней среде был выбран тот тип, который обеспечивал (за счет более высокой проницаемости мембраны при переходе таких молекул из окружающей водной среды в цитоплазму по сравнению с обратным переходом) более высокие равновесные концентрации органических соединений в цитоплазме. Для таких соединений затруднен выход из клетки и облегчен вход в клетку.

Следует особо подчеркнуть, что это относится и к основным макроэргам. Они как бы «удерживаются» в цитоплазме.

Что касается воды, то её молекулам при наличии поля в мембране легче выйти из клеток в окружающую водную среду, чем проникнуть внутрь клеток. Этот эффект («эффект Чарахчьяна») оказался полезным для сохранения целостности клеток. Он обеспечивает компенсацию осмотического потока воды в цитоплазму, связанного с более высокой концентрацией в ней ферментов, которые не способны проникать сквозь мембрану. Чем выше поле в липидах мембраны, тем мощнее указанный компенсаторный поток воды из клеток.

Следует отметить локальный характер данного эффекта. При одной и той же разности потенциалов в местах ассоциации крупных органических молекул с мембраной поле в липидах оказывается ослабленным. Соответственно, компенсаторный (по отношению к осмотическому) поток молекул воды из клетки в этих местах меньше, чем в областях мембраны без такой адгезии. Ясно, что для постоянства объёма клетки суммарный по всей площади мембраны поток воды из неё I должен быть в точности равен потоку воды I в цитоплазму клетки. Согласно закону Фика, эти потоки можно выразить соответствующими формулами. Для выходного потока из цитоплазмы:

I = (о. + о. с1^с1)(1 - п)п ,

ш 4 ш ш ' 4 'ш' ш

где ош°р — проницаемость мембраны для молекул воды из цитоплазмы в окружающую водную среду на участках мембраны без адгезии крупных молекул и их комплексов, — суммарная площадь всех открытых её участков, свободных от адгезированных на них крупных органических молекул и их комплексов; ошс1 и ^с1 — указанные величины для участков внутренней поверхности мембраны с адгезированными на них крупными молекулами и их комплексами; Пш — доля площади мембраны со стороны цитоплазмы, занятой осмотически активными частицами и препятствующими выходу

ТЕОРИЯ ЭВОЛЮЦИИ

молекул воды из клетки, а п - концентрация молекул воды в цитоплазме.

Соответственно, для входного потока воды: I = о Sn(1 — n )n ,

ex ex U ^ 'ex' ex^

где о — проницаемость мембраны для молекул воды, проникающих из окружающей водной среды в цитоплазму; SU = Sop + Scl — площадь внешнегослоялипидовцитомембраньцп^—доля площади мембраны со стороны окружающей водной среды, занятой осмотически активными частицами и препятствующими входу молекулам воды в клетку; nex — концентрация молекул воды в водной среде, окружающей клетки. Так как концентрация осмотически активных частиц в цитоплазме всегда больше их концентрации в окружающей водной среде, то величина nm всегда больше величины nex. Кроме того, органика, синтезируемая в клетках и находящаяся в цитоплазме в виде водного раствора (золя), занимает к единице её объёма большую долю, чем органика, растворенная в окружающей водной среде. Поэтому концентрация n больше величины nin. Результирующий поток воды I через мембрану клетки определяется соотношением: I = о S(1 - n )n - (о °PS°P + о clSd)(1 - n )n , (1)

res ex U4- 'ex ex ^ in in ' ^ 'in in ^ '

где за положительное направление выбрано направление в сторону цитоплазмы.

Если бы проницаемость мембраны для воды не зависела от напряженности электрического поля в мембране и ои была бы одинаковой для обоих направлений, то результирующий поток воды IU определялся бы соотношением:

IU = ои^С1 - nexkx - (1 - n>J (2)

Преобразуем последнее соотношение

к виду IU = 0uSunex[1 - nex - (1 - П>1п/пя]. Так как величина п. /п > 1, а n > n , то

in ex in ex

поток IU, направленный в цитоплазму, без соответствующей компенсации вызовет непрерывное набухание клетки. При этом концентрации растворимых веществ по обе стороны мембраны будут выравниваться. И если этот процесс, неизбежно сопровождаемый неуклонным увеличением объёма клетки, не успеет завершиться, то клетка неизбежно

погибнет по пути некроза из-за разрыва мембраны.

Поэтому следование клетками генеральной линии эволюционного развития — неуклонной интенсификации генерации свободной энергии по пути наращивания в цитоплазме ферментативного пула — быстро себя исчерпало. В процессах естественного отбора были выбраны оптимальные размеры клеток, которые гарантировали им стойкость к механическим воздействиям со стороны внешней водной среды.

Использование возникающей под воздействием электрического поля асимметрии проницаемости липидных мембран для биологически активных частиц (в том числе и для молекул воды) оказалось для клеток чрезвычайно полезным. Оно открыло для них возможность, не изменяя оптимального объема, наращивать в цитоплазме концентрации как ферментов, так и энергоёмких субстратов вместе с пластическим материалом.

Чем выше поле в мембране, тем выше равновесные концентрации осмотических частиц в цитоплазме при постоянных условиях окружающей водной среды. В процессах эволюционных преобразований за счет роста трансмембранной разности потенциалов создавались условия для роста в цитоплазме концентраций осмотически активных соединений, определяющих интенсивность энергетического метаболизма. Для этого был задействован весь возможный спектр напряженностей (вплоть до предпробойных) электрического поля в липидах.

Для наращивания трансмембранной разности потенциалов клетки началось использование крупных белков и их комплексов — «молекулярных насосов». Нельзя не отметить особую важность этого эволюционного приобретения. Клетки получили новое средство, способное из-за высокой проницаемости липидных мембран для ионов Н+ влиять на кислотность цитоплазмы а, следовательно, и на активность ферментов и метаболизм в целом.

ТЕОРИЯ ЭВОЛЮЦИИ

Ярким примером использования клетками эффекта асимметрии проницаемости липидных мембран для молекул воды является механизм откачки пресной воды из цитоплазмы амебы. Рост ее вакуолей связан с синтезом липидов de novo только во внешнем слое их мембраны. Наличие трансмембранного потенциала и поля в углеводородных частях липидов обусловлено, как показано выше, именно этим обстоятельством. Это поле направлено обратно направлению поля в цитомембране амёбы. Поэтому, во-первых, реализуются условия накопления воды в вакуолях и их роста. Во-вторых, реализуется ситуация, когда на отдельных участках цитомембраны, где нет адгезированной на ней органики, результирующий поток воды направлен наружу клетки, в то время как на других участках, с адгезированными на них крупными молекулами, наоборот, внутрь. Оба потока в точности равны друг другу, что обеспечивает постоянство объёма амёбы (анализ соотношения (1) показал, что такие условия реализуемы за счет варьирования входящих в него величин). Сформированные при этом в цитоплазме потоки воды используются для транспорта вакуолей к местам, не подвергнутым указанной адгезии. Здесь они сливаются с мембраной, вынося пресную воду в окружающую водную среду.

Транспорт крупных соединений

и везикул с биологически активными соединениями в цитоплазме современных клеток осуществляется механизмами, действие которых основано на эффекте асимметрии проницаемости липидных мембран для воды, возникающем под воздействием электрического поля. Формируемые в цитоплазме водные потоки переносят их от места образования к местам, где их действие наиболее продуктивно, или к местам, где они наиболее эффективно удаляются из клетки.

6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе рассмотрен ряд эффектов, которые прямо или опосредованно влияют на клеточный метаболизм. Показано, каким образом на

их основе в клетках были сформированы механизмы, которые в процессах эволюционных преобразований обеспечили клеткам неуклонную интенсификацию их энергетического метаболизма — следование генеральной линии эволюционного развития живых систем. Указаны принципы и полезные следствия действия таких механизмов. Обозначены другие возможности для использования их в регуляции клеточного метаболизма.

Проведенный анализ охватывает огромный период времени от возникновения первых животных клеток и вплоть до появления в цитоплазме соединений — предшественников гормонов, синтезируемых клетками в составе многоклеточных организмов. Поэтому этот анализ в известной степени схематичен и носит постановочный характер. Однако это не умаляет его значимости.

Отметим лишь два важных момента. Во-первых, показано, что известный в литературе «потенциал Доннана» генерируется за счет энергии архаичного метаболизма, сохраненного современными клетками, что не соответствует представлениям о состоянии термодинамического равновесия. Во-вторых, обнаружено, что под воздействием электрического поля в липидах наводится асимметрия проницаемости мембран для соединений, обладающих дипольным моментом.

ЛИТЕРАТУРА

1. Зарицкий АР, Грачев ВИ, Воронцов ЮП, Пронин ВС. Абиогенез на этапе перехода из атмосферы в водную среду: от везикул к протоклеткам. РЭНСИТ, 2014, 6(2):221-231.

2. Грачев В.И., Лобченко И.М. Собственные частоты колебаний домена липидного бислоя цитоплазматической мембраны. Краткие сообщения по физике ФИАН, 1991, 8:7-10.

3. Фок МВ. Некоторые аспекты биохимической физики, важные для медицины. М., Физматлит, 2007, с. 85-90 и с. 29.

4. Cintas P. Tracing the Origins and Evolution of Chirality and Handedness in Chemical Language. Angew. Chem. Int. Ed, 2007, 46(22):4016-24,

ТЕОРИЯ ЭВОЛЮЦИИ

D01:10.1002/anie.200603714.

5. Kelvin W T. Baltimore lectures on molecular dynamics and the wave theory of light. London, CJ. Clay and sons, 1904.

6. Моисеев НН. Расставание с простотой. М., АГРАФ, 1998: 91-93, с. 480.

7. Фок МВ, Зарицкий АР, Зарицкая ГА, Переведенцева ЛП. Авторегуляция неспецифической проницаемости мембраны эритроцита. М., Наука, 1999, с.77.

8. Wyman J. The heat of oxygenation of hemoglobin. Journal of biological chemistry, 1939, 129:681-692.

9. Черницкий ЕА, Воробей АВ. Структура и функции эритроцитарных мембран.. Минск, Наука и техника, 1981, с. 215.

Зарицкий Александр Романович с.н.с.

Физический институт им. П.Н.Лебедева РАН

53, Ленинский пр., 119991 Москва, Россия

[email protected].

Зайцева Галина Владимировна

м.н.с.

Физический институт им. П.Н.Лебедева РАН 53, Ленинский пр., 119991 Москва, Россия [email protected]. Грачев Владимир Иванович

чл.-корр. РАЕН

ИРЭ им. В.А.Котельникова РАН

11/7, ул. Моховая, 125009 Москва, Россия

[email protected].

Кириченко Марина Николаевна

к.ф.-м.н, н.с.

Физический институт им. П.Н.Лебедева РАН 53, Ленинский пр., 119991 Москва, Россия [email protected].

ELECTRIC FIELD IN THE CYTOPLASMIC MEMBRANE AS FACTOR FOR IMPROVED CELL METABOLISM

Alexander R. Zaritsky, Galina V. Zaytseva, Marina N. Kirichenko

Lebedev Physics Institute, Russian Academy of Sciences, http://www.lebedev.ru 53, Leninsky prosp., 119991 Moscow, Russian Federation [email protected], [email protected], [email protected]

Vladimir I. Grachev

Kotel'nikov Institute of Radio Engineering and Electronics, Russian Academy of Sciences, http://www.cplire.ru

11/7, Mokhovaya str., 125009 Moscow, Russian Federation

[email protected]

Abstract. This work is devoted to the evolutionary development of cellular structures and role of the electric fields in the cell membrane. We showed that the main channels of transmembrane potential generation are the output from cell of hydrogen ions, appearing under utilization of energy-intensive substrates in the cytoplasm, and different rates of metabolism of lipid mass in the internal and external layers of membrane. We considered also the mechanisms of electric field generation in the hydrocarbon part of the membrane (in the region oflipid "tails") under coordinated lean of the "heads" in one layer of bilayer. According to proposed logic, Donnan potential seems not a potential of thermodynamic equilibrium and exists on the membrane due to the process of archaic metabolism in the cells. We showed also that the asymmetry of membrane permeability arisen for molecules with dipole moment and minimum cross-section at its positive and negative ends because of the presence of the electric field in the membrane. In the evolutionary process, this asymmetry determined the selection of molecules by chiral symmetry associated with the dipole moment. It explains existence in the living world only those molecules, having the same chirality with respect to their dipole moment. In the experiment with erythrocytes we found that the stronger electric field on their membrane, the more significant redistribution of glucose molecule (having the dipole moment and minimal cross-section at the positive end of dipole) between plasma and cytoplasm in favor of the last. In the experiments with erythrocytes, we also revealed predicted effect of asymmetry of permeability for water molecules, providing preservation of erythrocyte volume under oxygenation of venous blood.

Keywords: lipid bilayer, membrane potential, flower metabolism, dipole, domain, Donnan potential, permeability asymmetry, glucose, water, osmotic particles

PACS: 87.23.Kg

Bibliography — 9 references Received 28.05.2016 RENSIT, 2016, 8(1):91-103_DOI: 10.17725/rensit.2016.08.091