CC BY
40
УДК 535.4:53.047:576.3:616-71
ЭФФЕКТ УМЕНЬШЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ГЛЮКОЗЫ В ПЛАЗМЕ КРОВИ ПОСЛЕ НАСЫЩЕНИЯ КРОВИ
КИСЛОРОДОМ
Г. В. Зайцева1, А. Р. Зарицкий1, М. Н. Кириченко1, М.А. Краснова1, А. В. Крайский1, В. А. Постников2, М.А. Шевченко1
Экспериментально обнаружено, что после насыщения венозной крови кислородом (процесс оксигенации) происходит уменьшение концентрации глюкозы в плазме крови. Этот эффект был зарегистрирован для нескольких десятков проб донорской крови с помощью портативных глюкометров "IME-DC" (Германия) и "Optium Omega" (США), а также с помощью не зависящего от присутствия кислорода в плазме оптического метода, использующего голографические сенсоры на основе полимерных пленок из гидрогеля. При оксигенации крови в организме идет перераспределение глюкозы между плазмой крови и цитоплазмой эритроцитов в пользу цитоплазмы. Наблюдаемый эффект объясняется возрастанием при окси-генации крови электрического поля в липидах цитоплаз-матической мембраны эритроцита, которое ориентирует по нормали к поверхности мембраны диполи молекул глюкозы, имеющие асимметричную форму. Это приводит к асимметрии проницаемости мембраны эритроцита.
Ключевые слова: глюкоза, эритроциты, оксигенация, цитоплазматическая мембрана, асимметрия проницаемости.
Введение. Глюкоза является главным энергоемким субстратом (среди сахаров), обеспечивающим процессы углеводного обмена всех клеток многоклеточного организма. Концентрация глюкозы в плазме крови в норме поддерживается на постоянном уровне
1 ФИАН, 119991 Россия, Москва, Ленинский пр-т, 53; e-mail: [email protected].
2 ФКНЦ физико-химической медицины, ФМБА России, Москва, ул. Малая Пироговская, 1а.
за счет обмена этим субстратом как с цитоплазмой эритроцитов, так и с внешней по отношению к крови средой. В работах [1-3] показано, что при оксигенации крови in vivo проницаемость цитоплазматической мембраны эритроцита для кислорода меняется существенным образом. Поскольку проницаемость мембраны неспецифична, то ее изменение влияет на скорость обмена субстратами, проходящими через мембрану, а также на установление их равновесных концентраций после кислородного обмена. Поэтому вызывает интерес вопрос об особенностях трансмембранного транспорта глюкозы в эритроцитах при оксигенации.
Целью данной работы является исследование изменений концентрации глюкозы в плазме крови in vitro после насыщения крови кислородом с помощью электронных глюкометров и не зависящего от присутствия кислорода в плазме оптического метода, а также попытка объяснить полученные в экспериментах результаты.
Материалы и методы. Всего в работе было исследовано около 30 проб донорской крови: часть проб была приготовлена из цельной венозной крови (здоровых и диабетиков) с добавлением антикоагулянта ЭДТА-К2 или гепарина, другая часть - из консервированной эритроцитарной массы с добавлением 3.8%-раствора цитрата натрия. В последнем случае в пробы крови помимо антикоагулянта добавлялся изотонический раствор Рингера для уменьшения показателя гематокрита примерно до 40-45%.
В ходе экспериментов в пробах крови измерялись следующие характеристики: 1) показатель гематокрита Ht (доля от общего объема крови, которую составляют эритроциты) измерялся с помощью центрифуги "СМ-70 Sky Line" (Elmi, Латвия) с частотой вращения 7000 об/мин; 2) уровень кислотности pH - с помощью рН-метра "Cheker" (Германия); 3) концентрация глюкозы в плазме крови пгл - с помощью одного из двух электронных глюкометров "IME-DC" (в основе тест-полосок фермент GOD) или "Optium Omega" (в основе тест-полосок фермент GDH-PQQ), а также с помощью метода, основанного на оптических свойствах гидрогелевых пленок [4, 5]; 4) степень насыщения крови кислородом (а) - с помощью созданного в ФИАНе прибора "КИНОКС" [3].
Так как концентрация кислорода в плазме крови и другие факторы могут в той или иной степени влиять на показания электронных глюкометров [6-8], для ряда проб крови был проведен проверочный эксперимент, где уровень глюкозы до и после окси-генации измерялся оптическим методом с высокой точностью. Этот метод использует голографические сенсоры на основе полимерных пленок из гидрогеля, и его результаты не зависят от присутствия кислорода в плазме крови [4, 5]. Для получения образцов плазмы использовалась лабораторная центрифуга "ЦЛК-1" с частотой вращения
3000 об/мин. Перед измерением образец (объемом не менее 300 мкл) проходил процедуру пробоподготовки, в процессе которой плазма разводилась в 15-20 раз [5]. Время измерения одного образца составляло 10-15 минут.
Процесс насыщения проб крови кислородом осуществлялся с помощью прибора "КИ-НОКС" [3]. Для этого от каждой пробы с помощью шприца отбиралось по 1 мл крови. Этот объём помещался в одну из кювет прибора для оксигенации. Время оксигенации составляло 7-10 минут. Сразу после процесса оксигенации для каждой пробы измерялся уровень глюкозы в плазме насыщенной кислородом крови (поху), взятой непосредственно из кюветы прибора (табл. 1). На основе полученных значений определялась величина разности концентраций глюкозы до и после оксигенации Дп = п0 — поху (табл. 1).
Таблица 1
Результаты измерений десяти выборочных проб крови: гематокрит крови (ИЬ), показатель кислотности в плазме крови рН, концентрации глюкозы в плазме крови до и после оксигенации (щ) и (п0ку), и их 'разность Дп = (п0) - (п0ху). Точности измерения указанных величин указаны в
верхней строке таблицы
№ пробы Характеристика пробы крови (Hi), % Д = 0.5% pH, Д = 0.01 (no), ммоль/л Д = 0.3 ммоль/л (Поху), ммоль/л Д = 0.3 ммоль/л Дп = (no)- (noxy ) , ммоль/л
1 Цельная кровь 41.7 7.52 12.05 10.60 1.45
2 Цельная кровь 46.0 7.39 15.40 14.15 1.25
3 Цельная кровь 40.4 7.64 7.80 6.90 0.90
4 Цельная кровь 38.0 7.43 4.33 3.65 0.68
5 Цельная кровь 49.1 7.37 3.85 3.25 0.60
6 Цельная кровь 35.9 7.42 6.85 6.35 0.50
7 Эр. масса 48.7 6.93 14.40 11.40 3.00
8 Эр. масса 48.3 6.87 13.65 11.90 1.75
9 Эр. масса 42.1 6.85 16.55 15.60 0.95
10 Эр. масса 48.0 6.89 6.80 6.20 0.60
Результаты измерения равновесной концентрации глюкозы в плазме крови с помощью глюкометров. Принцип действия глюкометров "IME-DC" и "Optium Omega" основан на химическом взаимодействии молекул фермента в составе тест-полосок с молекулами глюкозы, в результате которого возникает электрический ток, регистрируемый приборами. В табл. 1 приведены результаты измерений с помощью этих глюкометров для десяти выборочных проб крови, шесть из которых были приготовлены из цельной венозной крови, а четыре - из эритроцитарной массы. Для каждой пробы делалась серия измерений величины п0, после чего находилось ее среднее арифметическое (игл).
Погрешность одного измерения (пгл) составляла 0.3 ммоль/л. Величины (ИЬ) и рН, повторно определенные для ряда проб крови после оксигенации, с точностью до экспериментальной ошибки измерений совпадали с исходными значениями этих величин, поэтому в табл. 1 они не представлены.
Из табл. 1 видно, что во всех пробах после их оксигенации концентрация глюкозы в плазме крови уменьшалась на величину Ап - от нескольких десятых до нескольких единиц ммоль/л. Эти результаты были проверены независимым методом, поскольку, согласно работам [6-8], на точность измерения электронных глюкометров могут влиять в той или иной степени различные факторы, включая изменение концентрации кислорода в плазме крови.
Определение концентрации глюкозы с помощью метода, основанного на работе го-лографических сенсоров. Для проверки полученных с помощью глюкометров данных были проведены дополнительные измерения концентрации глюкозы в образцах плазмы цельной крови с помощью оптического метода высокой точности, с использованием го-лографических сенсоров [4, 5]. Точность измерений этим методом составляла не менее 0.02 ммоль/л. Всего было измерено четыре образца плазмы: в первых двух образцах плазма отбиралась из пары проб венозной и оксигенированной крови, отцентрифуги-рованных при 3000 об/мин в течение 10 минут; в двух других образцах плазма также отбиралась из пары проб венозной и оксигенированной крови, но отстоянных в течение часа в условиях естественного оседания эритроцитов. Результаты эксперимента, представленные в табл. 2, подтвердили уменьшение концентрации глюкозы в плазме крови при оксигенации проб.
Обсуждение результатов. В настоящей работе был обнаружен эффект уменьшения концентрации глюкозы в плазме крови после оксигенации проб. Этот эффект не может быть объяснен внутриклеточным потреблением глюкозы, так как время между измерением ее концентрации до и после оксигенации не превышало 10 минут. За это время убыль глюкозы из плазмы за счет внутриклеточного поглощения ее клетками крови составляла не более 1%. Для объяснения наблюдаемого эффекта нами выдвигается гипотеза, в основе которой лежит физическая модель асимметрии проницаемости мембраны эритроцита, наведенной электрическим полем, для молекул, имеющих форму стрелы и дипольный момент, направленный вдоль оси стрелы. К таким молекулам относится молекула глюкозы Д-формы, дипольный момент которой равен 14.1 Д (именно в Д-форме глюкоза содержится во всех живых организмах). Электрическое поле в липидах мембраны ориентирует молекулы Д-глюкозы таким образом, что для
них вход в мембрану со стороны плазмы и их прохождение через липиды в цитоплазму облегчены по сравнению с выходом из эритроцита. В организме асимметрия проницаемости цитомембран реализуется, по-видимому, во всех клетках. В эритроцитах данный эффект асимметрии удалось обнаружить для глюкозы при оксигенации крови, когда напряженность поля в мембране возрастает в результате десорбции адсорбированного на мембране гемоглобина [1-3]. Из-за усиления поля в липидах увеличивается разность в проницаемостях мембраны в направлениях "извне в клетку" и "из клетки наружу". Поэтому в плазме оксигенированной крови равновесная концентрация глюкозы устанавливается на новом более низком уровне, что и наблюдалось в экспериментах.
Таблица 2
Результаты измерений четырех образцов плазмы крови с помощью оптического метода
№ Характеристика образца (пгл), ммоль/л Ап = (по) - (поху),
образца А = 0.02 ммоль/л ммоль/л
1 Плазма из отцентрифугированной пробы венозной крови (п0) 5.43
2 Плазма из отцентрифугированной пробы оксигенированной крови (поху) 4.69 0.74
3 Плазма из отстоянной пробы венозной крови (п0) 4.78
4 Плазма из отстоянной пробы оксигенированной крови (поху) 4.24 0.54
зЗаключение. В настоящей работе представлены данные о перераспределении глюкозы между плазмой крови и цитоплазмой эритроцитов после насыщения проб донорской крови кислородом. Обнаружен эффект уменьшения концентрации глюкозы в плазме после оксигенации проб, и дано его объяснение. Этот эффект был впервые зарегистрирован с помощью портативных глюкометров и не зависящего от присутствия кислорода оптического метода, основанного на голографических сенсорах. Очевидна биологическая целесообразность данного эффекта, поскольку он способствует интенсификации энергетического метаболизма всех клеток, в том числе и эритроцитов, за счет увеличения в их цитоплазме концентрации глюкозы по сравнению с окружающей средой.
ЛИТЕРАТУРА
[1] М. В. Фок, А. Р. Зарицкий, Авторегуляция, как основа гомеостаза клеток (М., Космосинформ, 1997).
[2] М. В. Фок, А. Р. Зарицкий, Г. А. Зарицкая, Е. В. Переведенцева, Авторегуляция неспецифической проницаемости мембраны эритроцита (М., Наука, 1999), 77 с.
[3] М. В. Фок, Некоторые аспект,ы биохимической физики, важные для медицины (М., Физматлит, 2007).
[4] А. В. Крайский, В. А. Постников, Т. Т. Султанов, А. В. Хамидулин, Квантовая электроника 40(2), 178 (2010).
[5] В. А. Постников, В. Е. Тихонов, А. В. Крайский и др., Известия ВУЗ'ов ФИЗИКА 58(11/3), 58 (2015).
[6] Ю. А. Редькин, В. В. Богомолов, А. В. Древаль, Consilium medicum 13(12), 54 (2011).
[7] Z. Tang, R. F. Louie, J. H. Lee, et al., Critical Care Medicine 29(5), 1062 (2001).
[8] B. H. Ginsberg, Diabetes Technology Society 3(4), 903 (2009).
Поступила в редакцию 15 июня 2016 г.
