CC BY
26
АктуальН проблеми сучасно! медицины
ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА МЕДИЦИНА ТА Б1ОЛОГ1Я
УДК 577.112:616.831.4:[616.831-008.64:546.21]]-092.9 Абрамов А.В., Шаменко В.А., Колесник Ю.М.
ЭКСПРЕССИЯ БЕЛКА C-FOS В ГИПОТАЛАМУСЕ КРЫС ПРИ МНОГОДНЕВНОМ ДЕЙСТВИИ ПРЕРЫВИСТОЙ ГИПОКСИЧЕСКОЙ ГИПОКСИИ
Запорожский государственный медицинский университет
В работе исследованы особенности экспрессии белка c-Fos - маркера активации гена раннего ответа c-fos в нейросекреторных ядрах гипоталамуса в условиях адаптации организма к гипоксической гипоксии. Установлено, что 15-дневный цикл адаптации к прерывистой гипоксии (6000м) приводит к разнонаправленным изменениям в крупноклеточных нейронах паравентрикулярного (злкПВя) и супраопти-ческих (СОЯ) ядер. В ПВЯ увеличивается экспрессия белка c-Fos на 80% и площадь иммунореактивно-сти к белку на 42%. А в СОЯ эти показатели снижаются на 56% и 25%, соответственно. В мелкоклеточных нейронах ПВЯ (ммПВЯ) также увеличивается экспрессия белка c-Fos на 37%. Через 10 дней после окончания гипоксических тренировок показатели экспрессии белка c-Fos практически не изменяются в злкПВЯ, восстанавливаются до исходных показателей в ммПВЯ и частично в СОЯ. Полученные результаты свидетельствуют об устойчивом включении генов раннего ответа c-fos в нейроэн-докринный ответ ПВЯ в механизмы адаптации к гипоксической гипоксии и торможении функциональной активности нейросекреторных нейронов СОЯ.
Ключевые слова: прерывистая гипоксия, гипоталамус, белок c-Fos
Работа выполнена в соответствии с тематикой научно-исследовательских работ №0116U005352 и №0117U002579.
Несмотря на то, что нервная система млекопитающих представлена высокоспециализированными клетками, её реакция на стрессовые и повреждающие факторы характеризуется высокой нейрональ-ной пластичностью, как в эмбриогенезе, так и на протяжении всей жизни. Проявлением пластичности нервной ткани является способность нейронов как к кратковременной, так и к долговременной фено-типической трансформации под влиянием разнообразных стимулов. В основе нейрональной пластичности лежит механизм управляемой регуляции активности генов, среди которых выделяют гены немедленного ответа (immediate-early genes, IEGs), такие как c-fos и c-jun, так и транскрипционные факторы долговременной нейрональной пластичности, такие как CREB (cAMP responsive element binding protein) и CREM (cAMP-responsive element modulator) [1,2]. Еще в начале 90-х годов 20-го века было доказано, что белок c-Fos является маркером функциональной активности нейронов [3], а уровень его экспрессии в нейросекреторных нейронах сопряжен с повышением секреции вазопрессина, окситоци-на, кортикотропин-рилизинг гормона, дофамина и ряда других нейропептидов [4], определяющих эффективность нейроэндокринного ответа на действие факторов окружающей среды. При этом белок c-Fos включает каскад активации внутриклеточных и внеклеточных молекулярных мессенджеров, обеспечивающих нейрональную пластичность, необходимую для обучения, формирования памяти и когнитивных функций [1,5].
Цель исследования
Установить особенности экспрессии белка c-Fos в нейросекреторных ядрах гипоталамуса в условиях адаптации организма к прерывистому действию гипоксической гипоксии.
Материал и методы исследований
Исследование проведено на 48 половозрелых самцах крыс линии Вистар массой 220-250г, которые были разделены на 3 группы по 16 животных в каждой: контрольная, с 15-дневными гипоксиче-скими тренировками, с ГТ и 10-дневным постгипоксическим периодом. Прерывистую гипоксию моделировали ежедневным 6-часовым пребыванием крыс в вентилируемой барокамере (объем 1,0м ) с постепенным повышением высоты с 1000м до 6000м с 1-го по 6-й дни эксперимента (по 1000м в день), и последующим пребыванием на высоте 6000м (рО2=9,8%) до 15-го дня исследований.
Мозг экспериментальных животных быстро извлекали после одномоментной декапитации под тио-пенталовым наркозом (50 мг/кг) через 24 часа после окончания эксперимента. Для определения белка c-Fos мозг фиксировали в жидкости Буэна (20 часов) и после стандартной гистологической обработки мозг заливали в парапласт (MkCormick, США). Объектом изучения были медиальное мелкокле-
Том 17, Випуск 4 (60) частина 2?
В1СНИК ВДНЗУ «Украхнська медична стоматологгчна академя»
точное (ммПВЯ) и заднелатеральное крупноклеточное (злкПВЯ) субъядра паравентрикулярного ядра гипоталамуса, а также супраоптическое ядро гипоталамуса (СОЯ) [6,7].
Для иммунофлюоресцентного выявления белка c-Fos серийные фронтальные срезы гипоталамуса толщиной 14 мкм депарафинировали и демаскировали в цитратном РТ-буфере (рН=6,0) в РТ-модуле (Thermo Scientific, США), инкубировали (24 часа, Т=+4оС) с мышиными моноклональными антителами (IgG) к c-Fos (Santa Cruz Biotecnology, США) (разведение 1:100), затем с козьими антителами к IgG мыши, коъюгированными с FITC (Santa Cruz Biotecnology, США) (разведение 1:64, 45 мин., Т=+36оС), и заключали в смесь глицерин/фосфатний буфер (9:1). Изучение иммунофлюоресцентной реакции проводили на микроскопе AxioImager-M2 (Carl Zeiss, Германия), оснащённом камерой AxioCam-HRm (Carl Zeiss, Германия), с применением высокоэмиссионного светофильтра 38НЕ (лвх=470/40 нм, лвт=525/50 нм) (Carl Zeiss, Германия). Количественный анализ иммунофлюоресцентной реакции проводили с помощью системы цифрового анализа изображения AxioVision-4.8.2 (Carl Zeiss, Германия): определяли относительную площадь материала, иммунореактивного к c-Fos, по отношению к площади структуры гипоталамуса (%), концентрацию белка c-Fos в нейронах (усл. ед. иммунофлюоресцен-ции - Еиф) и его содержание в области субъядер ПВЯ и СОЯ (мЕиф/мм2).
Статистический анализ экспериментальных данных проводили пакетом программ для статистического анализа EXCEL 2003 (Microsoft Corp.) с интегрированной программной надстройкой AtteStat [8]. Для оценки достоверности различий в группах применяли t-критерий Стьюдента.
Результаты и их обсуждение
Гипоксические тренировки (ГТ) приводили повышению площади иммунореактивности в заднелате-ральном крупноклеточном субъядре паравентрикулярного ядра гипоталамуса (злкПВЯ) на 41,4 % (p<0,01), концентрации белка c-Fos в нейронах на 31,4 % (p<0,01) и содержания c-Fos в злкПВЯ на 79,6 % (p<0,005) (табл. 1). Через 10 дней после окончания гТ показатели иммунореактивности к белку c-Fos оставались на высоком уровне и статистически не отличались от тех величин, которые определялись на момент окончания ГТ. Известно, что злкПВЯ составляют крупноклеточные нейроны, синтезирующие вазопрессин, а основные пути аксонального транспорта этого нейропептида направлены не только в нейрогипофиз, но и в аденогипофиз [6]. Это позволяет нейронам злкПВЯ участвовать в формировании нейроэндокринного ответа на гипоксический стресс [9]. Сохранение высоких показателей иммунореактивности к белку c-Fos в области злкПВЯ, равно как и повышенный уровень синтеза белков семейства HIF [10] к моменту окончания ГТ и в постгипоксический период подтверждает участие вазопрессинергических механизмов в формировании адаптации к гипоксии.
Табл. 1.
Показатели экспрессии белка c-Fos в заднелатеральном крупноклеточном субъядре паравентрикулярного ядра гипоталамуса (M±m)
Параметры Контроль Гипоксические тренировки Постгипоксический период, 10 дней
Относительная площадь материала, иммунореактивного к c-Fos, % 3,36±0,34 4,75±0,34 * 4,63±0,47 *
Концентрация c-Fos в нейронах, Еиф 0,359±0,025 0,471±0,025 * 0,420±0,022 *
Относительное содержание c-Fos в структуре, мЕиф/мм 12,71 ±2,01 22,83±2,74 * 19,97±2,08 *
Примечание: во всех таблицах указана достоверность отличий р<0,05 по сравнению с контролем (*) и периодом гипоксических тренировок (#).
Другим, не менее важным источником синтеза вазопрессина в гипоталамусе, являются крупноклеточные нейроны супраоптического ядра гипоталамуса (СОЯ), нейрональные проекции которого направляются исключительно в нейрогипофиз [7]. Воздействие ГТ на нейроны СОЯ, в отличие от злкПВЯ, приводило к депрессии синтеза белка c-Fos (табл. 2), что проявлялось сокращением площади иммунореактивности к c-Fos на 35,3 % ф<0,02), уменьшением концентрации белка c-Fos в нейронах на 31,5 % ф<0,001) и его содержания в структуре на 56,0 % ф<0,001). Подобная депрессия показателей синтеза белка c-Fos как маркера активации генов раннего ответа свидетельствует о том, что вазопрессинергические механизмы сОя, вероятно, не участвуют в механизмах нейроэндокринной адаптации организма к гипоксии. Ранее было показано, что используемый режим ГТ приводит к умеренным дистрофическим изменениям в нейронах СОЯ [11], что полностью согласуется с выявленной в настоящем исследовании депрессией синтеза белка c-Fos. Характерно, что в постгипоксический период наблюдается частичное восстановление функциональной активности нейронов СОЯ и за счет нарастания площади иммунореактивности к c-Fos в нейронах содержание белка в структуре достоверно увеличивается (на 33,4 %, p<0,002), хотя и остается на 41,1 % ниже ф<0,005), чем у контрольных животных.
Табл. 2.
Показатели экспрессии белка c-Fos в супраоптическом ядре гипоталамуса (M±m)
Параметры Контроль Гипоксические тренировки Постгипоксический период, 10 дней
Относительная площадь материала, иммунореактивного к c-Fos, % 4,67±0,55 3,02±0,28 * 3,91±0,41
Концентрация c-Fos в нейронах, Еиф 0,562±0,044 0,380±0,016 * 0,387±0,019 *
АктуальН проблеми сучасно!' медицины
Относительное содержание c-Fos в структуре, мЕиф/мм2 27,93±3,17 12,31 ±1,21 * 16,43±1,20 *#
Табл. 3.
Показатели экспрессии белка c-Fos в медиальном мелкоклеточном субъядре паравентрикулярного ядра гипоталамуса (M±m)
Параметры Контроль Гипоксические тренировки Постгипоксический период, 10 дней
Относительная площадь материала, имму-нореактивного к c-Fos, % 4,14±0,32 4,63±0,24 3,92±0,26
Концентрация c-Fos в нейронах, Еиф 0,421±0,038 0,533±0,027 * 0,449±0,022 #
Относительное содержание c-Fos в структуре, мЕиф/мм2 18,33±1,87 25,13±1,09 * 18,85±2,05 #
Важной структурой гипоталамуса, участвующей в формировании нейроэндокринного ответа на стресс любого генеза, является медиальное мелкоклеточное субъядро паравентрикулярного ядра гипоталамуса (ммПВЯ), нейроны которого синтезируют кортикотропин-рилизинг гормон и вазопрессин [6,12]. ГТ приводили к повышению концентрации белка c-Fos в ммПВЯ на 26,5 % (p<0,02) и увеличению его содержания в структуре на 37,1 % (p<0,001) без изменения площади иммунореактивности (табл. 3). В постгипоксический период показатели экспрессии белка c-Fos в ммПВЯ снижались и восстанавливались до уровня контрольных животных.
Полученные данные свидетельствуют о различной степени вовлечения нейросекреторных образований гипоталамуса в процесс нейроэндокринного обеспечения адаптации организма к гипоксиче-ской гипоксии. Очевидно, что важное значение в данном процессе имеют нейроны паравентрикулярного ядра гипоталамуса. При этом реакция крупноклеточных нейронов злкПВЯ характеризуется более интенсивной экспрессией белка c-Fos, а данный эффект сохраняется продолжительное время и в постгипоксический период, в отличие от мелкоклеточных нейронов ммПВЯ. Следует полагать, что подобное различие обусловлено тем, что нейроны злкПВЯ синтезируют вазопрессин, а нейроны ммПВЯ - главным образом кортикотропин-рилизинг гормон [6,12]. При этом последний является более специфичным активатором гипофизарно-адренокортикальной системы, а вазопрессин выступает в роли ко-активатора и оказывает пермиссивный эффект. В то же время, для вазопрессина характерны более разнообразные нейроэндокринные эффекты, что, возможно, и лежит в основе сохранения высокой нейросекреторной активности крупноклеточных нейронов ПВЯ в постгипоксический период. В противоположность этому, крупноклеточные вазопрессинергические нейроны супраоптического ядра в ответ на действие гипоксической гипоксии отвечают глубокой депрессией синтеза белка c-Fos в сочетании с признаками умеренной морфофункциональной дегенерации [11]. Хорошо изучена роль супраоптического ядра в регуляции водно-осмотического баланса в организме. Однако характер ней-роэндокринного ответа данной структуры гипоталамуса свидетельствует о том, что в механизмах реализации нейроэндокринной адаптации к гипоксической гипоксии роль вазопрессина как антидиуретического гормона не является приоритетной.
Выводы
1. Прерывистая гипоксия вызывает повышение иммунореактивности в крупноклеточных нейронах паравентрикулярного ядра гипоталамуса с увеличением экспрессии белка c-Fos, высокие значения которого сохраняются в 10-дневный постгипоксический период.
2. Мелкоклеточные нейроны паравентрикулярного ядра гипоталамуса отвечают повышением экспрессии белка c-Fos только в период гипоксических воздействий.
3. Гипоксическая гипоксия приводит к депрессии синтеза c-Fos в крупноклеточных нейронах супра-оптического ядра гипоталамуса, уровень которого полностью не восстанавливается в 10-дневный по-стгипоксический период.
Литература
1. Loebrich S. The function of activity-regulated genes in the nervous system / S. Loebrich, E. Nedivi // Physiol. Rev.- 2009.- V. 89, № 4.- P. 10791103.
2. Perez-Cadahia B. Activation and function of immediate-early genes in the nervous system / B. Perez-Cadahia, B. Drobic, J.R. Davie // Biochem. Cell Biol. - 2011. - V. 89. - Р. 61-73.
3. Bullitt E. Expression of c-fos-like protein as a marker for neuronal activity following noxious stimulation in the rat / E. Bullitt // J. Comp. Neurology. -1990. - V. 296. - P. 517-530.
4. Hoffman G.E. c-Fos and related immediate early gene products as markers of activity in neuroendocrine systems / G.E. Hoffman, M.S. Smith, J.G. Verbalis // Front. Neuroendocrinology. - 1993. - V.14, No3. - P.173-213.
5. Healy S. Immediate early response genes and cell transformation / S. Healy, P. Khan, J.R. Davie // Pharmacology Therapeutics. - 2013. - V. 137. - P. 64-77.
6. Swanson L.W. Hypothalamic integration: organization of the paraventricular and supraoptic nuclei / L.W. Swanson, P.E. Sawchenko // Ann. Rev. Neurosci. - 1983. - V. 6. - P. 269-324.
7. Silverman A.J. Magnocellular neurosecretory system / A.J. Silverman, E.A. Zimmerman // Ann. Rev. Neurosci. - 1983. - V. 6. - P. 357-380.
8. Гайдышев И.П. Решение научных и инженерных задач средствами Excel, VBA и C/C++. / И.П. Гайдышев - СПб: БХВ-Петербург, 2004. - 504 с.
9. Абрамов А.В. Влияние интервальных гипоксических тренировок на функциональное состояние пептидергических нейронов паравентрикулярного ядра гипоталамуса и нейронов ствола мозга крыс / А.В. Абрамов // Рос. физиол. журн. им. И.М.Сеченова. - 1998. - Т.84, №3. -С.173-181.
Том 17, Випуск 4 (60) частина 2
В1СНИК ВДНЗУ «Украгнська медична стоматол.ог%чна академя»
10. Абрамов А.В. Особенности экспрессии HIF-16 И HIF-Зб в гипоталамусе у крыс линии Вистар под влиянием прерывистой гипобарической гипоксии / А.В. Абрамов, В.А. Шаменко // Пологолiя. - 2017. - №2 (40). - С.156-162.
11. Шаменко В.А. Морфогистохимическая характеристика нейронов супраоптического ядра гипоталамуса крыс при действии прерывистой гипоксии / В.А. Шаменко // Ежемес. науч. ж. научн. Фонда «Биолог». - 2014. - № 4. - С. 29-32.
12. Kolesnik Yu.M. Effect of intermittent hypoxia trainings on the functional state of corticotropin releasing hormone- and в-endorphin-synthesizing neurons of the rat paraventricular nucleus of hypothalamus / Yu.M. Kolesnik, E.V. Kadzharyan, A.V. Abramov // International J. Physiology and Pathophysiology. - 2014. - V.5, №3. - Р. 1-7.
Реферат
ЕКСПРЕС1Я Б1ЛКА C-FOS В ППОТАЛАМУС1 ЩУР1В ПРИ БАГАТОДЕНН1Й Д1Т ПЕРЕРИВЧАСТОТ ППОКСИЧНОТ ППОКСИ
Абрамов А.В., Шаменко В.О., Колесник Ю.М.
Ключов1 слова: переривчаста ппокая, плоталамус, б1лок c-Fos
В роботi дослiдженi особливостi експреси бiлка c-Fos - маркера активаци гена ранньоТ вiдповiдi c-fos в нейросекреторних ядрах ппоталамуса в умовах адаптаци органiзму до ппоксичноТ ппокси. Вста-новлено, що 15-денний цикл адаптацiТ до переривчастоТ ппокси (6000м) призводить до рiзноспрямо-ваних змш в крупноклiтинних нейронах паравентрикулярного (злкПВЯ) i супраоптичних (СОЯ) ядер. У ПВЯ збтьшуеться експресiя бтка c-Fos на 80 % i площа iмунореактивностi до бiлка на 42 %. А в СОЯ ц показники знижуються на 56 % i 25 %, вщповщно. У дрiбноклiтинних нейронах ПВЯ (ммПВЯ) також збiльшуeться експресiя бiлка cFos на 37 %. Через 10 дшв пiсля закiнчення гiпоксичних тренувань показники експреси бтка c-Fos практично не змшюються в злкПВЯ, вщновлюються до вихщних показни-мв в ммПВЯ i частково в СОЯ. Отриман результати свiдчать про стшке включення генiв ранньоТ вщ-повiдi c-fos в нейроендокринну вщповщь ПВЯ в механiзми адаптацiТ до ппоксичноТ ппокси i гальмуван-н функцюнальноТ' активностi нейросекреторних нейронiв СОЯ.
Summary
C-FOS PROTEIN EXPRESSION IN HYPOTHALAMUS OF RATS DURING LONG-TERM INTERMITTENT HYPOXIC HYPOXIA
Abramov A.V., Shamenko V.A., Kolesnik Yu.M.
Key words: intermittent hypoxia, hypothalamus, c-Fos protein
The features of expression of c-Fos protein known as a marker of immediate-early response gene c-fos activation in neurosecretory nuclei of the hypothalamus in conditions of organism adaptation to hypoxic hypoxia were studied in the work. It has been revealed that a 15-day cycle of intermittent hypoxia adaptation (6000 m) leads to multidirectional changes in large-cell neurons of paraventricular (PVN) and supraoptic (SON) nuclei. c-Fos protein expression is increased by 80% and the area of immunoreactivity to the protein by 42% in PVN, whereas these indicators are reduced by 56% and 25%, respectively, in SON. c-Fos protein expression is also increased by 37% in small-cell neurons of PVN. In 10 days after the end of the hypoxic exposure, c-Fos protein expression indices are not almost changed in large-cell neurons of PVN and restore to the initial values in small-cell neurons of PVN and partially in SON. The findings demonstrate the sustainable immediate-early response gene c-fos initiation in the neuroendocrine response of PVN to the mechanisms of hypoxic hypoxia adaptation and SON neurosecretory neurons functional activity inhibition.
УДК 616.37-018.1:616.379-008.64]-092.9 Абрамова Т.В., Колесник Ю.М., Иваненко Т.В.
ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ р-КЛЕТОК ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ У КРЫС СО СПОНТАННОЙ ГИПЕРТЕНЗИЕЙ ^^ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ДИАБЕТЕ
Запорожский государственный медицинский университет
В работе исследованы параметры распределения панкреатических островков и р-клеток в поджелудочной железе у гипертензивных крыс линии SHR в условиях развития стрептозотоцинового диабета. С помощью количественного иммунофлюоресцентного метода в железе выявляли инсулин, анализировали площадь панкреатических островков, количество в них р-клеток, концентрацию в клетках иммунореактивного инсулина, удельные показатели распределения островков, р-клеток и инсулина на единицу площади железы. Установлено, что у крыс линии SHR наблюдается доминирование панкреатических островков площадью меньше 1500 мкм2 и исчезновение островков площадью больше 7500 мкм2, снижение удельного количества р-клеток (12,4% от показателя нормотензивных крыс линии Ш^аг) и содержания инсулина (в 3 раза по сравнению с крысами линии Wistaг). Развитие диабета усиливает гибель р-клеток, при этом их численность снижается в 2 раза, а содержание инсулина в железе в 1,5 раза. Таким образом, индукция сахарного диабета у крыс с наследственной артериальной гипертензией усиливает ремоделирование инсулярного аппарата, что приводит к снижению синтеза инсулина в поджелудочной железе.
Ключевые слова: р-клетки, инсулин, артериальная гипертензия, диабет
Работа выполнена в соответствии с тематикой научно-исследовательских работ №0114Ш00966 и №011би005352.
