CC BY
41
2. Середа В. Г. Методи діагностики та комплексне лікування вертеброгенних попереково-крижових корінцевих больових синдромів у хворих різних вікових груп. Автореф. канд. дис. К., 2006. - 21 с.
3. Мельник Н. О., Мошеченко Є. Л., Пархоменко О. В. Патент на корисну модель № 27769 “Спосіб моделювання корінцево-судинного синдрому поперекового відділу хребта ”. - 2007. - 4 с.
f s S/ffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffff /SSS/YTVWffltySSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSS/
СТРУКТУРНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ НЕЙРОНОВ STRUCTURAL CHANGES OF SPINAL
СПИННОМОЗГОВЫХ УЗЛОВ ПРИ КОРЕШКОВО- NODES’S NEURONS AT RADIX-VASCULAR СОСУДИСТОМ СИНДРОМЕ SYNDROME
Мошеченко Е.Л., Пархоменко О.В. , Мельник Н.О. Moshechenko E., Parkhomenko O., Mel'nik N.
В работе представлена экспериментальная модель ко- In this work to representation expe-
решково-сосудистого синдрома (КСС). Исследовали морфо- rimental model radix-vascular syndrome (RVS). метрические изменения нейронов в составе спинномозго- Investigated of morphological changes of neurons вых узлов (СМУ). Светлые клетки реагируют на поражение as a part of spinal nodes (SK). Light cells react to нерва более продолжительно. Тёмные клетки проявляют ха- nerve defeat more for a long time. Dark cells рактерные патологические изменения, что может свидетель- showed pathological changes that can testify to ствовать о необратимости изменений для данных клеток. irreversibility of this changes for the given cells.
Ключевые слова: корешково-сосудистый Key words: radix-vascular syndrome,
синдром, нейроны спинномозговых узлов. neurons of spinal nodes.
УДК 611.77:615.076.9:616-089.843
ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНЕ ДОСЛІДЖЕННЯ ЕФЕКТИВНОСТІ ЗАСТОСУВАННЯ ПРОТИГІПОКСИЧНОЇ СУМІШІ ДЛЯ ЗАХИСТУ ТРАНСПЛАНТАТІВ ШКІРИ
Заміщення дефектів шкіри, які виникають внаслідок механічних, термічних або хімічних ушкоджень на виробництві та в побуті, є пріоритетною задачею для хірургів з моменту впровадження трансплантації шкіри в 1871 році. Однак шкіра є багатофункціональним органом, який може бути заміщений дермальними трансплантатами або тимчасовими заміниками шкіри тільки до відомого ступеня. На сьогоднішній день існує велика кількість методів виконання подібних операцій з використанням різних типів замінників шкіри, головним чином біологічного походження: алотрансплантатів, ксенотрансплантатів і амніону [14]. В той же час,
продовжуються експериментальні дослідження на тваринах по моделюванню процесів заживлення гострих ран шкіри за допомогою трансплантації повношарових фрагментів [11], вивченню взаємозв’язку між процесами ангіогенезу та реінервації в трансплантатах шкіри [5], вивченню тривалості тканиного ремоделювання живої шкіри [15] тощо.
Однак при пересадці шкіри важливими залишаються проблеми запобігання реакції відторгнення (досягається використанням аутотрансплантата в перші 24 години) та продовження терміну функціонування трансплантата шкіри в організмі реципієнта. Відомо, що гіпоксія в умовах in vivo може призвести до активізації пероксидного окислення ліпідів, пошкодження клітинних мембран і, навіть, некрозу трансплантата [13]. В зв’язку з цим, проводиться пошук нових протиокисних сумішей з використанням систем моделювання ліпідних процесів у шкірі [18]. Однак, незважаючи на численні дослідження, питання залишається відкритим.
Метою роботи було вивчення основних морфофункціональних характеристик трансплантатів шкіри щурів в умовах in vivo та розробка способу їх захисту від метаболічних наслідків гіпоксичної ішемії.
Матеріал і методи дослідження. Дефекти шкіри моделювали у статевозрілих щурів масою тіла 120-150 г в асептичних умовах під ефірним наркозом. Для цього у тварин в міжлопатковому проміжку ретельно вистригали шерсть і відповідну ділянку шкіри обробляли дезинфікуючим розчином, після чого вирізали по два шматочки шкіри з підшкірною клітковиною розмірами 1,0х 1,0 см, а рани закривали асептичними пов’язками. Один
шматочок шкіри переносили в культуральний флакончик з 2 мл 0,9%-го розчину хлориду натрію, а інший - в культуральний флакончик з 2 мл протигіпоксичної суміші та інкубували при температурі 4 оС. Через б, 12, 18 і 24 годин проводили трансплантацію шматочків шкіри на попередні місця таким чином, що у кожного щура-реципієнта був як контрольний, так і дослідний шматочки шкіри.
Протигіпоксичну суміш, яка містила 0,25% розчину ліпіна (природнього фосфатидилхоліна, який виявляє мембранопротекторний ефект), 0,005% розчину аскорбінової кислоти (для переведення жиророзчинних пероксидів у водну фазу та усунення їх пошкоджуючої дії на мембрани клітин), 0,0025% розчину ізоптина (блокатора трансмембранного потоку іонів кальцію) і 0,125% розчину унітіола (донатора SH-груп) готували безпосередньо перед застосуванням шляхом додавання у флакон з ліпіном 0,9%-го розчину хлориду натрію і наступного струшування флакону протягом 2-3-х хвилин до утворення однорідної емульсії білуватого кольору, в яку потім приливали відповідні об’єми розчинів аскорбінової кислоти, ізоптина та унітіола.
Через 24 години після підсадки вилучали трансплантат. Гістологічні дослідження проводили на парафінових зрізах шматочків шкіри, забарвлених гематоксиліном-еозином. Загальну антиоксидантну характеристику шматочків шкіри визначали за вмістом продуктів пероксидного окислення ліпідів (зокрема, малонового діальдегіда) по реакції з 2-тіобарбіту-ровою кислотою [8], а кількість білка - біохімічним методом [7].
Всі маніпуляції з тваринами проводились відповідно до положень “Європейської конвенції захисту тварин, які використовуються з експериментальною та іншою науковою метою” (Страсбург, 1985) і національними нормами з біоетики (I Національний конгрес з біоетики; Київ, 2001). Отримані дан обробляли методами варiацiйної статистики із застосуванням критерю t Стьюдента.
Результати дослідження та їх обговорення. Встановлено, що рівень продуктів пероксидного окислення ліпідів у трансплантатах шкіри щурів вірогідно не залежить від часу попередньої інкубації в 0,9%-му розчині хлориду натрію (табл. 1). Попередня інкубація шматочків шкіри щурів у протигіпоксичній суміші призводить до зниження рівня малонового діальдегіда в трансплантатах, а ефективність дії обернено пропорційна часу попередньої інкубації.
Макроскопічна оцінка стану трансплантатів шкіри щурів за загальноприйнятою в імунологічних дослідженнях на тваринах 7-бальною шкалою (1 бал - “трансплантат відірваний (технічна помилка)”, 2 бали - “трансплантат відторгнений”, 3 бали - “трансплантат некроти-зований”, 4 бали - “трансплантат починає некротизуватися”, 5 балів - “трансплантат набряклий із запаленням”, б балів - “трансплантат на початку запалення”, 7 балів - “інтактний трансплантат”) [2] показує певну залежність приживлюваності від часу попередньої інкубації шматочків шкіри в умовах in vitro та позитивний вплив на цю характеристику протигіпоксичної суміші (табл. 2).
Таблиця 1
Вплив протигіпоксичної суміші на концентрацію малонового діальдегіда в
трансплантатах шкіри щурів (М + т)
Час інкубації Концентрація малонового діальдегіда, нмоль/мг білка Ефективність впливу суміші, %
0,9%-ний розчин NaCI протигіпоксична суміш
б годин 0,610±0,072 (п=3) 0,383±0,022 (п=4)* 37,2
12 годин 0,539±0,045 (п=4) 0,409±0,005 (п=2)* 24,1
18 годин 0,533±0,076 (п=4) 0,435±0,077 (п=3) 18,4
24 години 0,735±0,182 (п=4) 0,670±0,102 (п=3) 8,8
Примітка. * - р < 0,05 у порівнянні з показниками відповідної групи з 0,9%-ним розчином хлориду натрію.
Таблиця 2
Вплив п ротигіпоксичної суміші на макроскопічний стан трансплантату
Час інкубації Макроскопічний стан трансплантату, бали Ефективність
0,9%-ний розчин NaCI протигіпоксична суміш впливу суміші, %
6 годин 3,25±0,75 (п=4) 5,00±1,08 (п=4) 53,8
12 годин 2,50±0,50 (п=4) 3,25±0,75 (п=4) 30,0
18 годин 2,25±0,25 (п=4) 2,75±0,48 (п=4) 22,2
24 години 2,25±0,25 (п=4) 2,50±0,50 (п=4) 11,1
При попередній інкубації шматочків шкіри у 0,9%-му розчині хлориду натрію приживлюється близько 1/3 трансплантатів, а при інкубації в протигіпоксичній суміші - 1/2 трансплантатів, інші ж висихають і утворюють струп (рис. 1).
За даними дослідження шкіри лопатково-поперекової області контрольної групи щурів епідерміс складається з 2 рядів клітин мальпігієвого шару, 2-3 рядів кератиноцитів зернистого шару та рогового шару і має відносно рівну межу з підлягаючою сполучною тканиною дерми. Базальні клітини утворюють досить однорідний ряд, мають базофільну цитоплазму і кулясте ядро з численними глибками хроматину та з ядерцем червоного кольору. В першому ряду клітин зернистого шару з мілкими глибками кератогіаліну чітко вирізняються овальні світлі ядра, в наступних рядах крупні глибки кератогіаліну маскують ядра, а в останньому ряді вони утворюють суцільний шар. У сосочковому шарі дерми присутня невелика кількість клітинних елементів. Волокна міжклітинної субстанції розташовані компактно. В капілярах підсосочкового шару містяться клітини крові. Ядра ендотеліальних клітин світлі з рівною поверхнею. Колагенові волокна сітчастого шару дерми прилягають між собою.
При субмікроскопічному дослідженні трансплантатів шкіри обох груп, які прижилися, спостерігається підсихання країв шматочків шкіри з утворенням окремих некротичних ділянок із злущеним епідермісом та лейкоцитарною інфільтрацією на межі некрозу. У нижніх шарах трансплантату шкіри помітне білкове випотівання, що містить лейкоцити. Однак в обох групах спостерігається деяка відмінність стану епітеліальних клітин епідермісу та його похідних у трансплантатах шкіри щурів.
При попередній інкубації у 0,9%-му розчині хлориду натрію в трансплантатах шкіри спостерігається:
а) інкубація протягом 6 годин: епідерміс складається з одного-двох шарів кератиноцитів видовженої форми (рис. 2а). В клітинах базального шару цитоплазма має зменшений об’єм та вакуолізацію парануклеарної зони, а також базофільні ядер. В ендотеліальних клітинах гемокапілярів дерми ядра дещо гіперхромні та ущільнені. Зустрічаються деградуючі поліморфноядерні лейкоцити;
б) інкубація протягом 12 годин: епітелій переважно сплощений, міжклітинні проміжки збільшені. Ядра клітин базального шару пікнотизовані. Подекуди спостерігається руйнування базальної мембрани та відшарування епідермісу, в якому (а також в сосочковому шарі дерми) відмічається клітинна інфільтрація;
в) інкубація протягом 18 годин: спостерігається розрихлення базального шару кератиноцитів і пікнотизація ядер. В дермі відмічається набряк у перикапілярному просторі та руйнування судинної стінки. Виявляється мукоїдне набухання волокон сполучнотканинної сумки волосяних фолікулів;
г) інкубація протягом 24 годин: базальний шар епідермісу представлений здебільшого деградуючими клітинами (рис. 2б). Спостерігається значне руйнування сосочкової зони та гемокапілярів дерми, а також редукція волосяних фолікулів. Епітеліальні клітин кореневих піхов волосяних фолікулів пікнотизовані.
При попередній інкубації у протигіпоксичній суміші в трансплантатах шкіри спостерігається:
а) інкубація протягом 6 годин: в епідермісі виявляються дуже неоднорідні за станом клітини (рис. 3а). Більшість життєздатних епітеліоцитів базального ряду мають кубічну форму, базофільну цитоплазму та овальні ядра з активними ядерцями, хоч поряд з ними присутня певна кількість клітин з вакуолізованою цитоплазмою та деградуючими ядрами. У зернистому шарі глибки кератогіаліну майже відсутні. Капіляри сосочкової зони наповнені клітинними елементами;
б) інкубація протягом 12 годин: епідерміс (особливо в зонах волосяних воронок) містить значну кількість життєздатних кератиноцитів з світлобазофільною цитоплазмою, світлими овальними та пікнотичними ядрами. Епітелій волосяних фолікулів має у своєму складі світлі та пікнотизовані ядра;
в) інкубація протягом 18 годин: в епідермісі зберігається значна частина життєздатних кератиноцитів та епітелій деяких волосяних фолікулів. Відмічається ледь помітне мукоїдне набухання колагенових волокон та перикапілярний набряк;
г) інкубація протягом 24 годин: в епідермісі присутні фрагменти життєздатного епітелію, клітини якого мають циліндричну форму і великі овальні ядра з подекуди пристінковою конденсацією гетерохроматину (рис. 3б). Епітелій у волосяних воронках збережений. Зернистий шар епідермісу ущільнений, не містить глибок кератогіаліну, однак спостерігається набряк дерми та деяке руйнування її сосочкового шару.
Рис. 1. Макроскопічний контроль трансплантації та приживлення шматочків шкіри.
Рис. 2. Трансплантати шкіри щура після попередньої 1- (а) і 24-годинної (б) інкубації в 0,9%-му розчині хлориду натрію, заб.: гематоксилін-еозин. зб.: об. 40.
Рис. 3. Трансплантати шкіри щура після попередньої 1- (а) і 24-годинної (б) інкубації в протигіпоксичній суміші. Заб.: гематоксилін-еозин. Зб.: об. 40.
Таким чином, в обох групах трансплантатів шкіри щурів, спостерігаються явища дегенерації епідермісу, його похідних і дерми, проте у першій групі такі явища, як пікнотизація ядер епітеліальних клітин та відшарування епідермісу, виражені більшою мірою, тоді як у другій групі ці зміни менш помітні та мають більш мозаїчний характер. В цілому попередня інкубація у протигіпоксичній суміші сприяє кращому збереженню епітеліальних клітин та капілярів трансплантату. Перспективність застосування суміші ліпіна, аскорбінової кислоти, ізоптина та унітіола показана при мікрохірургічній пересадці надчеревних м’язевих фрагментів кролів: після попереднього введення цієї суміші в артеріальне русло відмічено пригнічення процесів пероксидного окислення ліпідів, підвищення антиоксидантного захисту тканини фрагменту, стабілізацію клітинних і субклітинних мембран із збереженням цілісності
ендотелія судин [1,4]. Зниження ефективності дії протигіпоксичної суміші пов’язане з метаболічними перетвореннями її компонентів. Так, термін зберігання приготовленої емульсії ліпіна у стерильному 0,9%-ному розчині хлорида натрія не повинен перевищувати б годин при температурі від 2 до б оС. В той же час встановлено, що оптимальним терміном виконання автодерматопластики є б-8-а доба [З].
Відомо, що культивовані епідерміс і дерма мають значний регенераторний потенціал порівняно з іншими тканинами. В результаті вдосконалення техніки культивування кератино-цитів тепер стало можливим приготувати повноцінний епітелій для закриття поверхні тіла десяти дорослих пацієнтів приблизно через три тижні після взяття 1 см2 шкіри донора, а також зберігати залишок культивованих кератиноцитів шляхом кріоконсервації для двоетапної дерматопластики в іншому місці [б]. Ця процедура дозволяє уникнути частого взяття шкіри від одного і того ж пацієнта і, таким чином, покращити якість його життя та щоденної діяльності. Також показано, що через 3-4 тижні після трансплантації мишам попередньо обезсолених та повторно гідратованих фрагментів шкіри людини розмірами 10x10x6 мм, які зберігалися в попередньо дегідратованому при 240 °С протягом 2 годин хлористому натрії при кімнатній температурі протягом 1-6-и місяців, ці трансплантати зберігають нормальну морфологічну структуру, а також здатність інтенсивно накопичувати бромдеоксиуридин в базальних кератиноцитах [12,1б]. Експресія рбЗ і CD29 (антигени стовбурових і проміжних клітин), PCNA (ядерний антиген проліферуючої клітини) і цитокератин 1б (специфічний для проліферуючих кератиноцитів) свідчать про здатність епідермального базального шару клітин після трансплантації утворювати попередників кератиноцитів. При цьому фібробласти шкіри та деякі великі клітини HLA II показали нормальну структуру, а бактеріальна флора шкіри не зазнавала змін. Вже розроблений метод трансплантації ендотеліальних клітин, який дозволяє васкуляризувати еквіваленти шкіри людини в умовах in vivo, що буде особливо ефективно у пацієнтів з порушеннями ангіогенезу [10]. Також розробляється модель штучної шкіри (дерми і епідермісу) для лікування пацієнтів із тяжкими ушкодженнями епітелія, яку можна буде отримувати в спеціалізованих лабораторіях та розподіляти в різні медичні заклади [9]. Анатомія та фізіологія штучної шкіри поступово покращується і вона все більше стає схожою на природні аутографи шкіри, а самі замінники шкіри можуть стимулювати регенерацію активніше, ніж репарацію [17].
Застосування протигіпоксичної суміші (0,25% розчину ліпіна, 0,005% розчину аскорбінової кислоти, 0,0025% розчину ізоптина та 0,125% розчину унітіола) покращує морфофунк-ціональні властивості трансплантатів шкіри щурів за умов попередньої інкубації in vitro та може бути рекомендоване для захисту шкіри від гіпоксичних уражень в екстремальних ситуаціях.
Перспективи подальших розробок в даному напрямку. Отримані результати експериментальних досліджень дозволяють рекомендувати застосування суміші для захисту шкіри від гіпоксичних уражень.
1. Галич С. П. Применение антиоксидантной защиты тканей при свободной микрохирургической пересадке сложно-составных лоскутов / С. П. Галич // Клш. х1рурпя. - 1999. - № 7. - С. 46-48.
2. Иммунологические методы / [Амброзиус Х., Фибих Х., Вихнер З. и др.]; под ред. Г. Фримеля; пер. с
нем. А. П. Тарасова. - Москва: Медицина, 1987. - 472 с.
3. Кризина П. С. Визначення термінів виконання автодерматопластики / П. С. Кризина // Хірургія України. - 2007. - № 2. - С. 38-40.
4. Экспериментальное изучение возможности фармакологической защиты тканей мышечного лоскута от ишемического и реперфузионного повреждения при осуществлении его свободной пересадки / С. П. Галич, Н. Ф. Дрюк, Л. А. Стеченко [и др]. // Клін. хірургія. - 1999. - № 1. - С. 35-38.
5. Angiogenesis and nerve regeneration in a model of human skin equivalent transplant / A. Ferretti, E.
Boschi, A. Stefani [et al.] // Life Sci. - 2003. - V. 73, N 15. - P. 1985-1994.
6. Application for regenerative medicine of epithelial cell culture-vistas of cultured epithelium / H. Inoue, H. Oshima, K. Matsuzaki, N. Kumagai // Congenit. Anom. (Kyoto). - 2006. - V. 46, N 3. - P. 129-134.
7. Bradford M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding / M. M. Bradford //Anal. Biochem. - 1976. - V. 72, N 1-2. - P. 248-254.
8. Brogan W. C. Factors affecting lipid peroxidation in guinea pig adrenal microsomes / W. C. Brogan, Ph.
R. Miles, H. D. Colby // Biochim. Biophys. Acta. - 1981. - V. 663, N 1. - P. 230-238.
9. Clinical results of an autologous engineered skin / S. Llames, E. Garcia, V. Garcia [et al.] // Cell Tissue Bank. - 2006. - V. 7, N 1. - P. 47-53.
10.Engraftment of a vascularized human skin equivalent / J. S. Schechner, S. K. Crane, F. Wang [et al.] // FASEB J. - 2003. - V. 17, N 15. - P. 2250-2256.
11. Full-thickness human foreskin transplantation onto nude rats as an in vivo model of acute human wound healing / P. B. Petratos, J. Chen, R. A. Soslow [et al.] // Plast. Reconstr. Surg. - 2003. - V. 111, N 6. - P. 1988-1997.
12.Human keratinocyte stem cells survive for months in sodium chloride and can be successfully transplanted / W. L. Olszewski, M. Moscicka, D. Zolich, Z. Machowski // Transplant. Proc. - 2005. - V. 37, N 1. - P. 525-526.
13.Hwang E. S. Biomarkers for oxidative stress status of DNA, lipids, and proteins in vitro and in vivo cancer research / E. S. Hwang, G. H. Kim //Toxicology. - 2007. - V. 229, N 1-2. - P. 1-10.
14.Koller J. Skin grafting options at the Burn and Reconstructive Surgery Department of the Faculty Hospital
in Bratislava / J. Koller, M. Orsag // Acta Chir. Plast. - 2006. - V. 48, N 2. - P. 65-71.
15.Long-term remodeling of a bilayered living human skin equivalent (Apligraf) grafted onto nude mice: immunolocalization of human cells and characterization of extracellular matrix / S. Guerret, E. Govignon, D. J. Hartmann, V. Ronfard // Wound. Repair. Regen. - 2003. - V. 11, N 1. - P. 35-45.
16. Olszewski W. L. Human skin preserved in anhydric sodium chloride for months can be successfully transplanted / W. L. Olszewski, M. Moscicka, D. Zolich //Ann. Transplant. - 2004. - V. 9, N 4. - P. 37-39.
17.Skin tissue engineering / H. Bannasch, M. Fohn, T. Unterberg [et al.] // Clin. Plast. Surg. - 2003. - V. 30, N 4. - P. 573-579.
18. Trammer H. Screening for new antioxidative compounds for topical administration using skin lipid model systems / H. Trommer, R. H. H. Neubert // J. Pharm. Pharmaceut. Sci. - 2005. - V. 8, N 3. - P. 494-506.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ EXPERIMENTAL RESEARCH ON EFFICIENCY
ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ OF ANTIHYPOXIC MIXTURES APPLICATION
ПРОТИВОГИПОКСИЧЕСКОЙ СМЕСИ FOR PROTECTION OF SKIN
ДЛЯ ЗАЩИТЫ ТРАНСПЛАНТАТОВ КОЖИ TRANSPLANTATS
Пастер И.П., Балла И.А., Шуба И.Н. Pasteur I.P., Balla I.A., Shuba I.M.
Применение противогипоксической смеси The morphofunctional characteristics of
(0,25% раствора липина, 0,005% раствора аскорби- rats skin transplantats were improved by using новой кислоты, 0,0025% раствора изоптина и 0,125% antihypoxic mixtures (0,25% lipin solution, раствора унитиола) улучшает морфофункциональные 0,005% ascorbic acid solution, 0,0025% isoptin свойства трансплантатов кожи крыс при условии solution and 0,125% unitiol solution) under предварительной инкубации in vitro и может быть previous incubation condition in vitro and can be рекомендовано для защиты кожи от гипоксических recommended for skin protection from hypoxic поврежений в экстремальных ситуациях. injures in the extremal situations.
Ключевые слова: трансплантаты кожи, Keywords: skin transplantats, antihypoxic
противогипоксическая смесь. mixtures.
УДК: 611.813.1-018.82:57.012.4:616.441 -008.64:57.084:615.357
УЛЬТРАСТРУКТУРНІ ЗМІНИ КЛІТИН ГЛІЇ ГОЛОВНОГО МОЗКУ ТИРЕОЇДЕКТОМОВАНИХ
ЩУРІВ
Формування післяопераційного гіпотиреозу супроводжується розвитком енцефалопатії, що призводить до появи різноманітних когнітивних та неврологічних розладів у хворих, яким проведена тиреоїдектомія [1]. Вагомі зміни виявлені з боку тіл нейронів та їх відростків [2]. Проте, не можна недооцінити реакцію гліальних клітин центральної нервової системи.
Метою роботи було вивчити ультраструктурні зміни в клітинах глії кори великих півкуль головного мозку у щурів в динаміці післяопераційного гіпотиреозу.
