CC BY
38
В. Тронько Н.Д., Орленко В.Л. По материалам 42 конгресса европейской асоциации по изучению диабета// Здоров’я України. - 2006. - №21. - С. 210-241.
9. Этические вопросы использования животных в учебной работе и научных исслндованиях / Тез. докл. Белорусско-британского симпозиума (16-18 окт., Минск, 1997) / Под ред. С.ДДенисова.- Минск, 1998.- 140 с.
10. Bober E, Buyukgebiz A. Hypoglycemia and its effects on the brain in children with type 1 diabetes mellitus// Pediatr. Endocrinol. Rev. - 2005. - Vol.2, №3. - P.378-382
11. Zimmet P., Alberti K.G., Shaw J. Global and societal implications of the diabetic epidemic// Nature. -2001. - Vol.414. - P. 7В2-7В7.
ОСОБЕННОСТИ СТРОЕНИЯ ПАНКРЕАТИЧЕСКИХ ОСТРОВКОВ НА РАЗНЫХ ЭТАПАХ ОНТОГЕНЕЗА Миськив В.А., Левицкий В.А.
В течение жизни определяются структурные изменения в эндокринной части поджелудочной железы, которые проявляются увеличением средних размеров островков к максимальными значениями в 12 месяцев постнатального онтогенеза. У крыс 24 месячного возраста средние размеры островков уменьшаются на 15 процентов. Общее количество клеток увеличивается с возрастом, который наблюдается также для отдельных типов клеток в составе островков. Максимальное количество капилляров определяется в 12 месячном возрасте, а диаметр обменного звена гемомикроциркуляторного русла является максимальным в 6 месячных крыс.
Ключевые слова: панкреатические
островки, крысы, онтогенез.
FEATURES OF PANCREATIC ISLANDS STRUCTURE ON THE DIFFERENT STAGES OF ONTOGENESIS Mis'kiv V.A., Levitskyi V.A.
During life structural changes are determined in endocrine part of pancreas, which show up the increase of middle sizes of islands to to by maximal values in 12 months of postnatal ontogenesis. For rats 24 monthly ages the middle sizes of islands diminish on 15 percents. The general amount of cells is increased with age which is observed also for the separate types of cells in composition of islands. Maximal amount of capillaries is determined the in a 12 monthly age, and a diameter of exchange part of haemomicrivascular rate is maximal in 6 monthly rats.
Keywords: pancreatic islands, rats,
ontogenesis.
УДК 611.77:615.012.6
ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНЕ ДОСЛІДЖЕННЯ ЕФЕКТИВНОСТІ ЗАСТОСУВАННЯ ПРОТИГІПОКСИЧНОЇ СУМІШІ ДЛЯ ЗАХИСТУ ЕКСПЛАНТАТІВ ШКІРИ
Застосування суміші (0,25% розчину липину, 0,005% розчину аскорбінової кислоти, 0,0025% розчину ізоптину і 0,125% розчину унітіолу) проти гіпоксії покращує морфофункціональні властивості експлантатів шкіри щурів за умови інкубації in vitro і може бути рекомендоване для захисту шкіри від гіпоксій пошкодженій в екстремальних ситуаціях.
Ключові слова: експлантати шкіри, суміш протигіпоксії.
Робота є ініціативною.
Трансплантація шкіри активно застосовується для заміщення відповідних дефектів шкіри, які виникають внаслідок механічних, термічних або хімічних ушкоджень на виробництві та в побуті [б]. Окрім запобігання реакції відторгнення і продовження терміну функціонування трансплантата шкіри в організмі реципієнта з дермальними дефектами важливою проблемою залишається також оптимізація умов зберігання шкіри з моменту її отримання до моменту пересадки [В]. Відомо, що гіпоксія в умовах in vitro може призвести до активізації пероксидного окислення ліпідів, пошкодження клітинних мембран і, навіть, некрозу експлантата [7]. В зв’язку з цим, проводиться пошук нових протиокисних сумішей з використанням систем моделювання ліпідних процесів у шкірі [9]. Однак, незважаючи на численні дослідження, питання залишається відкритим.
Метою роботи було вивчення основних морфофункціональних характеристик експлантатів шкіри щурів в умовах in vitro та розробка способу їх захисту від метаболічних наслідків гіпоксичної ішемії.
Матеріал і методи дослідження. Шматочки шкіри отримували від статевозрілих щурів масою тіла 120-150 г в асептичних умовах під ефірним наркозом. Для цього у тварин в міжлопатковому проміжку ретельно вистригали шерсть і відповідну ділянку шкіри обробляли дезинфікуючим розчином, після чого вирізали фрагмент шкіри з підшкірною клітковиною і розрізали на однакові шматочки розмірами 1,Ох 1,0 см. Кожний шматочок шкіри переносили в окремий культуральний флакончик з 2 мл 0,9%-го розчину хлориду натрію або з 2 мл протигіпоксичної суміші та інкубували при температурі 4оС.
Протигіпоксичну суміш, яка містила 0,25% розчину ліпіна (природнього фосфати-дилхоліна, має мембранопротекторний ефект), 0,005% розчину аскорбінової кислоти (для переведення жиророзчинних пероксидів у водну фазу та усунення їх пошкоджуючої дії на мембрани клітин), 0,0025% розчину ізоптина (блокатора трансмембранного потоку іонів кальцію) і 0,125% розчину унітіола (донатора БИ-груп) готували безпосередньо перед застосуванням шляхом додавання у флакон з ліпіном 0,9%-го розчину хлориду натрію і наступного струшування флакону протягом 2-3-х хвилин до утворення однорідної емульсії білуватого кольору, в яку потім приливали відповідні об’єми розчинів аскорбінової кислоти, ізоптина та унітіола.
Через 1, 3, 6, 12, 18 і 24 години інкубації вилучали експлантат. Гістологічні дослідження проводили на парафінових зрізах шматочків шкіри, забарвлених гематоксиліном-еозином. Загальну антиоксидантну характеристику шматочків шкіри визначали за вмістом продуктів пероксидного окислення ліпідів (зокрема, малонового діальдегіда) по реакції з 2-тіобарбітуровою кислотою [4], а кількість білка - біохімічним методом [3]. Всі маніпуляції з тваринами проводились відповідно до положень “Європейської конвенції захисту тварин...” (Страсбург, 1985) і національними нормами з біоетики (Київ, 2001). Отриманні дані обробляли методами варіаційної статистики із застосуванням критерію ї Стьюдента.
Результати дослідження та їх обговорення. Встановлено, що рівень продуктів пероксидного окислення ліпідів у шматочках шкіри щурів не залежить від температури розчину для інкубації: при температурі 0,9%-го розчину хлориду натрію 4 °С рівень малонового діальдегіда в експлантатах шкіри становить 0,807±0,088 нмоль/мг білка (п=5), при температурі 20 °С - 0,853±0,118 нмоль/мг білка (п=5) і при температурі 36 °С - 0,876±0,157 нмоль/мг білка (п=5). В динаміці інкубації шматочків шкіри в 0,9%-му розчині хлориду натрію при температурі 4 оС рівень малонового діальдегіда дещо зростає, однак ці зміни не є вірогідними (табл.). Інкубація шматочків шкіри щурів в протигіпоксичній суміші призводить (незважаючи на певні коливання) до вірогідного зниження рівня малонового діальдегіда на 42,9% через 1 годину інкубації та 24,8% через 24 години інкубації.
Таблиця
Концентрація малонового діальдегіда в експлантатах шкіри щурів (М + т)
Час інкубації Концентрація малонового діальдегіда, нмоль/мг білка Ефективність впливу суміші, %
0,9%-ний розчин №СІ протигіпоксична суміш
1 година 0,777+0,027 (N=4) 0,444+0,047 (N=5)* 42,9
3 години 0,866+0,052 (N=5) 0,600+0,046 (N=5)** 30,7
6 годин 0,876+0,034 (N=5) 0,583+0,070 (N=5)** 33,4
12 годин 0,896+0,074 (N=5) 0,500+0,019 (N=5)* 44,2
18 годин 0,807+0,088 (N=5) 0,762+0,119 (N=5) 5,6
24 години 0,876+0,039 (N=5) 0,659+0,046 (N=5)** 24,8
Примітка. * - р < 0,001 і ** - р < 0,01 у порівнянні з показниками відповідної групи з 0,9%-ним розчином хлориду натрію.
За даними дослідження шкіри лопатково-поперекової області контрольної групи щурів епідерміс складається з 2 рядів клітин мальпігієвого шару, 2-3 рядів кератиноцитів зернистого шару та рогового шару і має відносно рівну межу з підлягаючою сполучною тканиною дерми. Базальні клітини утворюють досить однорідний ряд, мають базофільну цитоплазму і кулясте ядро з численними глибками хроматину та з ядерцем червоного кольору. В першому ряду клітин зернистого шару з мілкими глибками кератогіаліну чітко вирізняються овальні світлі ядра, в наступних рядах крупні глибки кератогіаліну маскують ядра, а в останньому ряді вони утворюють суцільний шар. У сосочковому шарі дерми присутня невелика кількість клітинних елементів. Волокна міжклітинної субстанції розташовані компактно. В капілярах підсосочкового шару містяться клітини крові. Ядра ендотеліальних клітин світлі з рівною поверхнею. Колагенові волокна сітчастого шару дерми прилягають між собою. За даними субмікроскопічного дослідження фрагментів шкіри при
інкубації у 0,9%-му розчині хлориду натрію спостерігалось - через 1 годину - зменшення висоти епідермального шару за рахунок сплощення епітеліальних клітин. Ядра більшості епітеліоцитів базального ряду були гіперхромні, еліпсоподібної форми, розташовані вздовж базальної мембрани. У дермальному шарі ядра ендотеліальних клітин капілярів ущільнені та інтенсивно забарвлені; через 3 години: цитоплазма багатьох кератиноцитів вакуолізована, ядра клітин ущільнені, подекуди спостерігалась аномальна конденсація хроматину. Судини підсосочкової області заповнені клітинами; через 6 годин: у сосочковому шарі з’являлись ознаки набряку, що проявлялось в розгалуженні волокон сполучної тканини та інфільтрації клітинними елементами. Просвіт більшості капілярів звужений; через 12 годин: помітно розгалуження волокон сполучної тканини у сітчастому шарі дерми. У зовнішній епітеліальній піхві волосяних фолікулів спостерігався каріопікноз, а у сполучнотканинній сумці навколо них відмічалось набрякання волокон; через 18 годин: епідерміс складався з клітин з видовженими гіперхромними та пікнотизованими ядрами. Сосочковий шар дерми в багатьох місцях виглядав зруйнованим. В сітчастому шарі спостерігалось мукоїдне набухання окремих волокон сполучної тканини. Ядра ендотеліальних клітин ущільнені; через 24 години: епідерміс представлений сплощеними клітинами. Шар ущільненого кератогіаліну відсутній.
За даними субмікроскопічного дослідження фрагментів шкіри при інкубації у протигіпоксичній суміші спостерігалось - через 1-3 години: епідерміс складався з декількох шарів клітин кубічної та циліндричної форми, ядра яких нормохромні, мають овальну форму і розташовані перпендикулярно до базальної мембрани. В базальному ряду зустрічаються кератиноцити, що знаходяться в мітотичному та передмітотичному стані. В дермальному шарі присутні фібробласти з великими світлими ядрами, що свідчить про їх синтезуючу активність. Ядра ендотеліальних клітини в більшості нормохромні; через 6 годин: епідерміс мав досить одноріний базальний шар клітин з округлими, іноді видовженими чи неправильної форми ядрами, що містили глибчастий хроматин. У деяких кератиноцитах спостерігалось перинуклеарне просвітлення цитоплазми; через 12 годин: епідерміс не зазнавав подальших змін. У сосочковому шарі дерми місцями спостерігався набряк; через 18 годин: епідерміс складався з активних клітин ростового шару, дещо потоншувався зернистий шар кератиноцитів, зерна кератогіаліну досить мілкі, роговий шар подекуди відлущувався. В епітеліальних клітинах епідермісу та його похідних зустрічалась вакуольна дистрофія, а частина ядер деградувала; через 24 години: епідерміс достатньо добре зберігався. Базальній ряд епітеліоцитів мав чітку межу з дермою, світлобазофільну цитоплазму та світлі ядра з глибками гетерохроматину. Зрідка спостерігалась гіпертрофія ядер. В сполучній тканині дермального шару зустрічалась певна кількість клітин лімфоїдного ряду за межами судинної стінки, проте капіляри значною мірою збережені. В дермі зустрічалось багато активних фібробластів. В цілому, в обох групах експлантатів шкіри спостерігались явища деструкції епітелію і сполучної тканини, ознаками якої була збільшена кількість клітин з пікнотичними ядрами, набрякання клітин і вакуолізація цитоплазми, а також розшарування і мукоїдне набухання сполучнотканинних волокон дерми. Однак в першій групі ці явища виражені більшою мірою, тоді як в другій групі вони мають мозаїчний характер. В експлантатах, що інкубувались в протигіпоксичній суміші, відмічається збереження значної частини життєздатного епідермісу та судин дерми. Таким чином, протигіпоксична суміш чинить захисну дію на клітинні мембрани, зокрема, сприяє збереженню капілярів дерми та білоксинтезуючої функції епітеліальних клітин.
Відомо, що ліпін має протигіпоксичну дію, сприяє підвищенню швидкості транспорту кисню через біологічні мембрани, нормалізує процеси тканинного дихання, а також інгібує процеси пероксидного окислення ліпідів у крові і тканинах, підтримує активність антиоксидантних систем організму та виявляє мембранопротекторний ефект. Аскорбінова кислота має сильно виражені відновлювальні властивості, приймає участь у регулюванні окисно-відновних процесів і регенерації тканин. Ізоптин блокує трансмембранний потік іонів кальцію в клітини, безпосередньо зменшує потреби тканин в кисні за рахунок впливу на енергетично затратні процеси метаболізму в клітинах. Унітіол є антидотом та донатором SH-груп, чинить регулюючу дію на мікроциркуляцію крові на рівні капілярів, проявляє антиоксидантну дію та стимулює систему антиоксидантного захисту організму.
Перспективність застосування суміші ліпіна, аскорбінової кислоти, ізоптина та унітіола показана при мікрохірургічній пересадці надчеревних м’язевих фрагментів кролів: після попереднього введення цієї суміші в артеріальне русло відмічено пригнічення процесів
пероксидного окислення ліпідів, підвищення антиоксидантного захисту тканини фрагменту, стабілізацію клітинних і субклітинних мембран із збереженням цілісності ендотелія судин [1,2]. Зниження ефективності дії протигіпоксичної суміші пов’язане з метаболічними перетвореннями її компонентів. Так, термін зберігання приготовленої емульсії ліпіна у сте-рильному 0,9%-ному розчині хлорида натрія не повинен перевищувати 6 годин при температурі від 2 до 6 °С. Відомо, що в попередньо дегідратованому при 240 °С протягом 2 годин хлористому натрії фрагменти шкіри людини розмірами 10x10x6 мм можуть зберігатися при кімнатній температурі протягом 1-6-и місяців, а через 3-4 тижні після трансплантації мишам попередньо обезсолені та повторно гідратовані фрагменти шкіри зберігають нормальну морфологічну структуру [6,8].
Застосування протигіпоксичної суміші (0,25% розчину ліпіна, 0,005% розчину аскорбінової кислоти, 0,0025% розчину ізоптина та 0,125% розчину унітіола) покращує морфофунк-ціональні властивості експлантатів шкіри щурів за умов інкубації in vitro та може бути рекомендоване для захисту шкіри від гіпоксичних уражень в екстремальних ситуаціях.
Перспективи подальших розробок в даному напрямку. Отримані результати експериментальних досліджень дозволяють рекомендувати проведення подальших морфофункціональних досліджень на трансплантатах шкіри щурів.
1. Галич С. П. Применение антиоксидантной защиты тканей при свободной микрохирургической пересадке сложно-составных лоскутов / С. П. Галич // Клін. хірургія. - 1999. - № 7. - С. 46-48.
2. Экспериментальное изучение возможности фармакологической защиты тканей мышечного лоскута от ишемического и реперфузионного повреждения при осуществлении его свободной пересадки / С.
П. Галич, Н. Ф. Дрюк, Л. А. Стеченко [и др]. // Клін. хірургія. - 1999. - № 1. - С. 35-38.
3. Bradford М. М. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding / М. M. Bradford //Anal. Biochem. - 1976. - V. 72, N 1-2. - P. 248-254.
4. Brogan W. C. Factors affecting lipid peroxidation in guinea pig adrenal microsomes / W. C. Brogan, Ph.
R. Miles, H. D. Colby // Biochim. Biophys. Acta. - 1981. - V. 663, N 1. - P. 230-238.
5. Clinical results of an autologous engineered skin / S. Llames, E. Garcia, V. Garcia [et al.] // Cell Tissue Bank. - 2006. - V. 7, N 1. - P. 47-53.
6. Human keratinocyte stem cells survive for months in sodium chloride and can be successfully transplanted / W.
L. Olszewski, M. Moscicka, D. Zolich [at al] // Transplant. Proc. - 2005. - V. 37, N 1. - P. 525-526.
7. Hwang E. S. Biomarkers for oxidative stress status of DNA, lipids, and proteins in vitro and in vivo cancer research / E. S. Hwang, G. H. Kim //Toxicology. - 2007. - V. 229, N 1-2. - P. 1-10.
8. Olszewski W. L. Human skin preserved in anhydric sodium chloride for months can be successfully transplanted / W. L. Olszewski, M. Moscicka, D. Zolich // Ann. Transplant. - 2004. - V. 9, N 4. - P. 37-39.
9. Trommer H. Screening for new antioxidative compounds for topical administration using skin lipid model systems / H. Trommer, R. H. H. Neubert // J. Pharm. Pharmaceut. Sci. - 2005. - V. В, N 3. - P. 494-506.
у///л4фераг¥///////////////////////////////////////////////л
Э КСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТИВ- EXPERIMENTAL RESEARCH ON EFFICIENCY НОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ ПРОТИВОГИПОКСИЧЕСКОЙ OF ANTIHYPOXIC MIXTURES APPLICATION СМЕСИ ДЛЯ ЗАЩИТЫ ЭКСПЛАНТАТОВ КОЖИ FOR PROTECTION OF SKIN EXPLANTS
Пастер И.П., Балла И.А., Шуба И.Н. Pasteur I.P., Balla I.A., Shuba I.M.
Применение противогипоксической смеси (0,25% The morphofunctional properties of rats skin раствора липина, 0,005% раствора аскорби-новой кислоты, explants were improved by using antihypoxic mixtures 0,0025% раствора изоптина и 0,125% раствора унитиола) (0,25% lipin solution, 0,005% ascorbic acid solution, улучшает морфофунк-циональные свойства эксплантатов 0,0025% isoptin solution and 0,125% unitiol solution) кожи крыс при условии инкубации in vitro и может быть under incubation condition in vitro and can be рекомендовано для защиты кожи от гипоксических recommended for skin protection from hypoxic injures повреждений в экстремальных ситуациях. in the extremal situations.
Ключевые слова: эксплантаты кожи, Keywords: skin explants, antihypoxic
противогипоксическая смесь. mixtures.
