CC BY
1510 Quantification of coronary artery calcium using ultrafast computed tomography / A.S. Agatston, W.R. Janowitz, F.J. Hildner et al // J. Am. Coll. Cardiol. - 1990. - V. 15. - P. 827-832.
11 Zung W.W.K., Durham N.C. A self-rating depression scale // Arch. Gen. Psychiatry. - 1965. - V. 12. - P. 63-70.
Рукопись получена: 14 апреля 2016 г. Принята к публикации:22 апреля 2016 г.
УДК 616
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ ОЗОНИРОВАННЫХ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ РАСТВОРОВ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ОТДАЛЕННЫХ ПОСЛЕДСТВИЙ ОСТРЫХ ОТРАВЛЕНИЙ ОКСИДОМ УГЛЕРОДА
© 2016 В.В. Масляков1, В.С. Чирский2, Т.С. Соловьева2, А.В. Савченко2
1 Филиал частного учреждения образовательной организации высшего образования «Медицинский университет «Реавиз» в городе Саратове 2Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова
Острые отравления оксидом углерода являются одной из актуальных проблем токсикологии. Среди причин смертельных исходов от острых отравлений за последние 10 лет отравления оксидом углерода составляют около 25 %, занимая второе место после отравлений алкоголем и его суррогатами. Наравне с гражданским населением существует реальная опасность поражения военнослужащих как в боевой обстановке, так и в повседневной деятельности войск. Во всем мире признано, что в отдаленном периоде у больных, перенесших острое отравление СО, могут развиваться различные стойкие изменения функции нервной системы. Проблема профилактики энцефалопатии в отдаленном периоде после острых отравлений оксидом углерода до конца остается не решенной. Доказанным является тот факт, что настоящим высокоэффективным антидотом против отравлений оксидом углерода является кислород. Продолжается поиск возможности применения для профилактики и лечения острых отравлений оксидом углерода растворов с повышенной концентрацией кислорода при нормальных условиях. В свете этого возникает вопрос об эффективности применения с этой целью растворов другой формы кислорода - озона. В работе проведена экспериментальная оценка перорального применения озонированных физиологических растворов для профилактики нарушений памяти и обучаемости у крыс в отдаленном периоде после острого отравления оксидом углерода. Результаты подкреплены морфологическим исследованием головного мозга крыс.
Ключевые слова: острые отравления, оксид углерода, отдаленные последствия, озонированные растворы, исследования памяти и обучаемости, гиппокамп.
Введение. Острые отравления оксидом углерода (СО) являются одной из актуальных проблем токсикологии. В структуре острых отравлений их доля составляет 5-6 % [22]. Среди причин смертельных исходов от острых отравлений за последние 10 лет отравления оксидом углерода составляют около 25 %, занимая второе место после отравлений алкоголем и его суррогатами [15]. Столь высокая летальность сохраняется, несмотря на совершенствование терапии.
Отравления СО могут случаться в различных токсических ситуациях. Например, источником СО служат выхлопные газы двигателей внутреннего сгорания. Отравления СО проис-
ходят при работе в гаражах, в плохо вентилируемых помещениях. Риск отравлений увеличивается при эксплуатации техники в условиях высокогорья [19].
Наравне с гражданским населением существует реальная опасность поражения военнослужащих как в боевой обстановке, так и в повседневной деятельности войск. При горении зажигательных смесей образуются высокие концентрации оксида углерода. Риск отравления СО велик у летчиков, подводников, артиллеристов, экипажа боевых машин. Имеются данные, что авиационные катастрофы в 19 % случаев происходят из-за отравления пилотов воздушного судна оксидом углерода [8].
Основным механизмом токсического действия СО является гипоксия. Ее развитие приводит к церебральной недостаточности, прогрессирование которой формирует необратимые изменения [22]. Связано это с тем, что потребность нейронов в энергетическом обеспечении выше, чем других клеток организма. Нейроны головного мозга потребляют 350-450 мкл кислорода в минуту. [11]. Во всем мире признано, что в отдаленном периоде у больных, перенесших острое отравление СО, могут развиваться различные стойкие изменения функции нервной системы, астеническое состояние и нарушения сна. Субъективно качество жизни такие пострадавшие оценивают, как «посредственное» [18]. Особенно сильно изменения выражены в подкорковых ядрах, что проявляется в основном их некрозом [4]. А ведь именно базальным ганглиям и гиппокампу принадлежит основная роль в процессах памяти и обучаемости [7].
Очень актуальным остается вопрос о профилактике острых отравлений оксидом углерода, в том числе и развития энцефалопатии в отдаленном периоде. Доказанным является тот факт, что настоящим высокоэффективным антидотом против отравлений оксидом углерода является кислород. Актуальным и мало исследованным вопросом является возможность применения для профилактики острых отравлений оксидом углерода растворов с повышенной концентрацией кислорода при нормальных условиях. В свете этого возникает вопрос об эффективности применения с этой целью растворов другой формы кислорода - озона.
Озонотерапия является лечебным методом, находящим в последние годы все более широкое применение в клинической практике. Озон обладает большим разнообразием лечебных эффектов. Выражено антигипоксическое действие озона, связанное как с непосредственным повышением содержания кислорода в организме, так и с активацией кислородза-висимых реакций в клетке, реализуемых через систему вторичных мессенджеров (циклических мононуклеотидов) [23]. Существует целый ряд нормативно-правовых актов, регулирующих озонотерапию в клинике. Описаны варианты местного и общего применения озона. В основном применяются методы общей озонотерапии: большая аутогемотерапия или внутривенное введение озонрованных физиологических растворов (ОФР) [14, 16]. То есть озоноте-рапия является официально разрешенным методом воздействия на людей с доказанной эффективностью при ряде заболеваний. Несмотря на то что в литературе есть упоминания об антитоксическом действии озоновых растворов, широкого распространения в клинической токсикологии данный метод не имеет Кроме того, в исследованной нами литературе не упоминается возможность применения ОФР при отравлениях СО. В то же время повышение парциального давления кислорода в крови и повышение концентрации оксигемоглобина могло бы стать эффективным механизмом, препятствующим связыванию СО с гемоглобином [12]. Перспективным может быть применение озонированных растворов для профилактики и лечения отдаленных последствий острых отравлений оксидом углерода, в основном энцефалопатии.
Цель исследования. Экспериментальная оценка применения озонированных физиологических растворов для профилактики отдаленных последствий острых тяжелых отравлений оксидом углерода.
Материалы и методы. Работа выполнена на белых беспородных крысах-самках массой 130-140 г. Крысы содержались в стандартных условиях вивария на сбалансированном питании.
Статическую ингаляционную затравку СО проводили в герметичной затравочной камере. Для интоксикации использовали оксид углерода, полученный способом разложения муравьиной кислоты под действием горячей концентрированной серной кислоты. Концентрацию СО в затравочной камере контролировали при помощи газоанализатора ДАХ-М-03-С0-1500 «Россия». Экспозицию проводили в течение 30 минут.
Озонированные физиологические растворы (ОФР) получали при помощи озонатора «Гроза» производства ООО «Дон» (г. Томск) с использованием усовершенствованной нами методики (свидетельство о рационализаторском предложении № 14105/3 выдано Военно-медицинской академией им. С.М. Кирова 29.10.2015 г.). Концентрацию растворенного озона в растворе контролировали методом йодометрического титрования (ГОСТ № 2332 от 26.12.72 г.). ОФР применялись с профилактической целью (600 мкг/100 г внутрижелудочно за 15 мин. до интоксикации оксидом углерода). Исследовали память и обучаемость в отдаленном периоде после острого отравления СО.
Память оценивали в тесте «черно-белая камера». Обучаемость животных оценивали методом условного рефлекса активного избегания плавания (УРАИ) [5]. Через 30 сут после отравления оксидом углерода животные были подвергнуты эвтаназии с помощью медицинского эфира и вскрытию. Головной мозг извлекали для гистологического исследования и фиксировали в 10 % растворе нейтрального формалина, проводили через спирты и заливали в парафин по стандартной методике приготовления гистологических препаратов [13]. Производили ленточные срезы головного мозга. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином. Использованные препараты изучали в светооптическом микроскопе Lomo при 100-, 200-, 400- и 600-кратном увеличении.
Для статистической обработки данных использовалась программа «Exel for Windows», «Statistica 6,0» с расчетом среднего значения, ошибки средней и среднего квадратического отклонения. Оценку различий средних значений данных проводили непараметрическим методом с использованием U-критерия Манна-Уитни. Вероятность p < 0,05 и выше считали достаточной для вывода о статистической значимости различий полученных данных.
Результаты исследования. На первом этапе исследования были отработаны методики приготовления ОФР различных концентраций. Чтобы уменьшить объем одномоментно вводимого раствора, была выбрана концентрация 200 мкг/100 г. Крысам вводился ОФР натощак внутрижелудочно в дозах 100 мкг/100 г, 150 мкг/100 г, 400 мкг/100 г, 600 мкг/100 г соответственно. Указанные дозы были выбраны как наиболее часто, по данным литературы, применяемые в лабораторных условиях и в клинике [1, 2 ,6, 9, 10, 21]. Экспериментальным путем было установлено, что введение ОФР повышает парциальное давление кислорода в крови, насыщение гемоглобина кислородом, доставку и утилизацию кислорода тканями. Все эти эффекты могут «противостоять» воздействию на организм оксида углерода. Максимальный эффект при пероральном введении наблюдается через 15 мин и носит дозозависимый характер. Для дальнейшего исследования применяли введение ОФР при дозе озона 600 мкг/100 г внутрижелудочно за 15 мин до начала интоксикации.
Были взяты 30 беспородных крыс-самок. Крысы были разделены на 3 группы, в каждой по 10 штук. I группа - интактные крысы, II группа - подвергшиеся интоксикации оксидом
углерода (условно названа в данном исследовании контрольной группой), III группа -профилактическое применение ОФР.
Все крысы были использованы в эксперименте с «черно-белой камерой» для оценки памяти в отдаленном периоде после перенесенного острого отравления оксидом углерода. Провели I этап эксперимента - ознакомление и II этап - обучение. Через 24 ч провели воспроизведение полученных навыков. Время ожидания перехода из камеры в камеру максимально составлял 180 секунд. При этом латентный период перехода из камеры камеру достоверно не отличался во всех группах и составлял 179 ± 0,1 секунд.
День проверки выработанных навыков считался нулевым днем. Вслед за тестом с «черно-белой камерой» проводили затравку животных оксидом углерода в дозе 0,8 ЬС50 (для незащищенной группы), летальность составила 10 %. Средний латентный период перехода животных из камеры в камеру представлен в таблице 1.
Таблица 1
Средний латентный период перехода животных в темную камеру в тесте с «черно-белой камерой»
Номер Латентный период (с)
руппы 0 сутки 1 сутки 7 сутки 14 сутки 21 сутки
I (интактные) 180 180* 180* 180* 180*
II (СО) 180 124±45,4 # 91±36,6 # 56±31,4# 35±8,1#
III (ОФР + СО) 179±0,1 179±0,1* 175±0,2* 153±19,1*# 153±21,2*#
Примечание: * - различия с контрольной группой значимы при р < 0,05; # - по сравнению с 0 сутками в своей группе, значимы при при р < 0,05. В каждой группе п = 7.
Перед интоксикацией у животных латентный период во всех группах достоверно не различался (табл. 1). В последующем в I группе у интактных крыс латентный период не менялся, что свидетельствует об отсутствии нарушений памяти, сохранении выработанного навыка. В контрольной (II) группе, начиная с 1-х суток, латентный период перехода из светлой камеры в темную достоверно снизился в 1,5 раза (p < 0,05). Это говорит о развитии нарушений памяти уже с 1-х суток после интоксикации. В дальнейшем нарушения памяти нарастали на 7, 14 и 21 сутки, латентный период уменьшался в 2; 3,2; 5,1 раза соответственно по сравнению с первоначальным (p < 0,05). В III группе на 1 сутки не развивались нарушения памяти, начиная с 7 суток латентный период уменьшился в 1,2 раза (p < 0,05), на 14 день уменьшился в 1,4 раза по сравнению с первоначальным временем (p < 0,05), на 21 день достоверно не выявлены различия по сравнению с 14 днем.
Таким образом, в контрольной группе животных после перенесенного тяжелого острого отравления оксидом углерода, уже начиная с 1 суток развивались нарушения памяти, которые нарастали к 21 дню. В III группе клинические проявления интоксикации и нарушения памяти в отдаленном периоде развивались менее выражено.
Обучаемость животных исследовали методом условного рефлекса активного избегания плавания (УРАИ) [20]. Эксперимент проводили с 7 по 11 сутки после отравления. Временные показатели латентного периода приведены в таблице 2.
Таблица 2
Средний латентный период УРАИ плаванием
Номер Латентный период (с)
группы 7 сут 8 сут 9 сут 10 сут 11 сут
I (интактные) 38,5±8,6* 18,6±3,1*# 7,7±1,8*# 4,6±1,7*# 4,3±1,2*#
II (СО) 59,9±11,1+ 27,8±5,2#+ 21,5±6,8#+ 11,6±5,7#+ 6,6±3,4#+
III (ОФР + СО) 35,7±6,6* 18,4±4,6*# 9,3±2,8*+# 6,2±1,1*+# 4,4±1,1*#
Примечание: * - различия с контрольной группой значимы при p < 0,05; + - по сравнению с интактной группой, значимы при при p < 0,05; # - по сравнению с 7 сутками в своей группе, значимы при при p < 0,05. В каждой группе п = 10.
В группе интактных животных (I) латентный период, начиная с 8 суток, достоверно уменьшался, а именно в 2,1 раза на 8 сутки и в 9 раз на 10 и 11 сутки ф < 0,05) (все сравнения с данными на 7 сутки) (табл. 8). В то же время в контрольной группе сравниваемых животных наблюдались нарушения обучаемости, что выражалось в большем латентном периоде, по сравнению с аналогичными показателями у интактных животных. Так, латентный период во II группе на 7 сутки больше в 1,6 раза ф < 0,05), на 8 сутки больше в 1,5 раза ф < 0,05), на 9 сутки больше в 2,8 раза ф < 0,05), на 10 сутки больше в 2,7 раза ф < 0,05), на 11 сутки больше в 1,5 раза ф < 0,05) (все сравнения с аналогичными сутками в I группе). В IV группе латентный период на 7 и 8 сутки достоверно не отличается от I группы. В то же время на 9 и 10 сутки латентный период был больше, чем в I группе в 1,2 и 1,4 раза соответственно ф < 0,05). По сравнению с контрольной группой животные обучались быстрее.
Таким образом, при тяжелых острых отравлениях оксидом углерода на 7-11 сутки развиваются нарушения обучаемости. Применение ОФР с профилактической целью достоверно уменьшало эти нарушения.
Следующим этапом исследования явилось изучение морфологических изменений в головном мозге крыс после тяжелого острого отравления оксидом углерода и на фоне профилактического применения ОФР. Исследование проводилось на 30 сутки.
По данным литературы, на фоне острых отравлений оксидом углерода, основные изменения ишемического характера наблюдаются в подкорковых ядрах, прежде всего в гиппо-кампе [4]. Ряд авторов указывают, что выраженность этих нарушений наибольшая именно на 30 сутки [17, 24].
Особенно важна зона СА3 гиппокампа, которая является точкой конвергенции потоков информации от всех структур головного мозга, прежде всего коры, лимбической системы, ретикулярной формации. Считается, что наибольшее значение в процессах памяти и обучаемости играет именно СА3 зона гиппокампа. Кроме того, именно в СА3 зоне определяются наибольшие изменения при ишемии [17].
На рисунке 1 представлена СА3 зона гиппокампа интактных крыс при 600-кратном увеличении.
Рис. 1. Гиппокамп интактных крыс, зона СА3 (окраска гемотоксилин-эозином, ув.х600)
Видны крупные нейроны, расположенные рядами, с крупными округлыми ядрами с 1 или несколькими ядрышками. Отмечаются единичные нейроны с интенсивным гиперхрома-тозом ядер. Общее количество нейронов не одинаково у разных животных и составляет 320-380 (в среднем 350).
При исследовании гиппокампа крыс контрольной группы, перенесших тяжелое острое отравление оксидом углерода, отчетливо заметна зональность поражения, при этом наибольшие изменения выявлены в зоне СА3 (рис. 2).
Рис. 2. Гиппокамп крыс в контрольной группе, зона СА3 (окраска гематоксилин-эозином, ув.х600)
Наблюдаются единичные и группы нейронов с выраженным гиперхроматозом ядер и клетками-тенями. То есть клетки находятся на разных стадиях некроза, вокруг отмечается реакция микроглии. Оставшиеся «живые» клетки с неравномерным окрашиванием ядра, зонами просветления, множеством ядрышек. Цитоплазма клеток бледно окрашенная. Некоторые клетки сморщены. Количество клеток в среднем 200. По сравнению с интактной группой количество клеток уменьшилось на 42,9 %. Подобная картина описана в литературе при ишемических повреждениях головного мозга другого генеза (перевязка сонной артерии, ате-росклеротическое поражение) [3, 17].
При исследовании зоны СА3 гиппокампа крыс в группе с профилактическим применением ОФР перед острой интоксикацией СО отмечены значительные отличия от контрольной группы (рис. 3).
Сохраняется рядность расположения нейронов, как в интактной группе, яркость окрашивания цитоплазмы. Ядра клеток крупные, округлые с одним или множеством ядрышек. Отмечаются единичные клетки с гиперхроматозом, клетки-тени, сморщенные клетки. Общее количество клеток в среднем 270. Погибших клеток по сравнению с интактной группой 22,8 %, что меньше, чем в контрольной группе в 1,9 раз.
Рис. 3. Гиппокамп крыс в профилактической группе, зона СА3 (окраска гемотоксилин-эозином, ув.х600)
Выводы. 1. Пероральное введение крысам ОФРг вызывает повышение парциального давления кислорода в артериальной крови, концентрации оксигемоглобина и артериовеноз-ную разницу по кислороду. Эффект от действия ОФР носит дозозависимый характер.
2. Профилактическое применение ОФР в дозе 600 мкг/100 г за 15 мин до интоксикации нивелировало нарушения памяти и обучаемости в отдаленном периоде после тяжелого острого отравления оксидом углерода.
3. На 30 сутки после острого отравления оксидом углерода в зоне СА3 гиппокампа крыс наблюдалась гибель 42,9 % клеток по сравнению с интактными животными. Среди оставшихся нейронов наблюдается множество клеток с гиперхроматозом ядер, клетки-тени, сморщенные клетки.
4. В группах с профилактическим применением ОФР на 30 сутки после интоксикации СО морфологическая картина в СА3 зоне гиппокампа внешне сходна с аналогичной картиной у интактных животных: наблюдались единичные клетки с гиперхроматозом ядер, клетки-тени. Гибель клеток в группах с профилактическим применением ОФР была меньше, чем в контрольной группе в 1,9 раза.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1 Анохин Б.М. Влияние озонированного физиологического раствора на организм здоровых поросят / Б.М. Анохин, В.В. Крайс // Ветеринарная патология. - 2003. - № 3. - С. 107-108.
2 Бабаев Х. Об эффективности использования озонотерапии при лечении гнойных ран мягких тканей / Х. Бабаев, Ш. Орзабаев // Молодой ученый. - 2011. - № 9. - С. 235-241.
3 Балашов А.В. Структурные изменения гиппокампа белых мышей при стрессе и действии производного фосфорилуксусной кислоты: дис. ... кандидата медицинских наук. - Саранск, 2013. - 118 с.
4 Богомолова И.Н. Патоморфологические изменения внутренних органов при острых отравлениях монооксидом углерода // Проблемы экспертизы в медицине. - 2007. - № 1. - С. 26-30.
5 Буреш Я. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения / Я. Буреш, О. Бурешова, Д.П. Хьюстон; пер. с англ. Е.Н. Живописцевой; под. ред. А.С. Батуева. - М.: Высшая школа, 1991. - 400 с.
6 Драч Д.А. Озонотерапия в лечении язвенной болезни: клинико-экспериментальное обоснование: дис. ... канд. мед. наук. - Самара, 2005. - 108 с.
7 Евдокимова О.С. Поведенческие и мнестические функции у крыс при действии озонированного физиологического раствора: автореф. дис. ... канд. биолог. наук. - Нижний Новгород, 2010. - 24 с.
8 Зобнин Ю.В. Отравление монооксидом углерода (угарным газом). - СПб., 2011. - 80 с.
9 Котов С.А. Влияние озона на метаболизм головного мозга при моделировании гипоксии и тревожного состояния у крыс / С.А. Котов, И.В. Мухина, А.Н. Энделева // Medicum.ru. - 2002. - URL: http://www.medicum. nnov.ru.
10 Кошелева И.В. Озонотерапия как метод коррекции микроциркуляторных нарушений кожи у больных экземой / И.В. Кошелева [и др.] // Российский журнал кожных и венерических болезней. - 2003. - № 2. - С. 35-45.
11 Лесиовская Е.Е. Антигипоксанты прямого действия - перспективные нейропротекторы // Terra medica. -2012. - № 4. - С. 49-57.
12 Маркизова Н.Ф. Токсичные компоненты пожаров / Н.Ф. Маркизова [и др.]. - СПб: Фолиант, 2008. - 208 с.
13 Меркулов Г.А. Курс патогистологической техники / Г.А. Меркулов. - Л.: Медгиз, 1961. - 343 с.
14 Методики применения озона в медицине. Методические рекомендации (утв. Минздравом Украины, 2004 г.). - URL: http://www.pdffactory.com.
15 Остапенко Ю.Н. Токсикологическая помощь населению Российской Федерации: состояние и проблемы / Ю.Н. Остапенко [и др.] // Токсикологический вестник. - 2014. - № 3. - С. 2-8.
16 Применение кислородно-озоновой смеси в дерматологии и косметологии. Методические рекомендации № 2003/84 (утв. Минздравом РФ 12.02.2004). - URL:http:// www.consultant.ru
17 Смирнов А.В. Морфологическая характеристика гиппокампа при церебральном атеросклерозе / А.В. Смирнов [и др.] // Современные проблемы науки и образования. - 2012. - № 1. - URL:http://www.science-education.ru/ru/article/view?id=5615
18 Софронов Г.А. Качество жизни лиц, перенесших острые отравления продуктами горения / Г.А. Софронов,
B.С. Черный, М.В. Александров // Вестник Российской Военно-медицинской академии. - 2012. - № 2 (38). -
C. 6-10.
19 Тишкин С.А. Оценка влияния вредных выбросов грузового автотранспорта на экологическую обстановку в районе его действия: автореф. . канд. техн. наук. - Москва, 2012. - 18 с.
20 Толкач П.Г. Оценка нарушений функций центральной нервной системы после тяжелого отравления оксидом углерода / П.Г. Толкач, В.А. Башарин, А.Н. Гребенюк // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2015. - Т. 160, № 10. - С. 464-468.
21 Фисталь Э.Я. Патогенетическое обоснование парентерального применения озона при неотложных состояниях в комбустиологии / Э.Я. Фисталь, В.М. Носенко // Медицина неотложных состояний. - 2007. - № 3. -С. 86-89.
22 Шилов В.В. Фармакологическая коррекция гипоксии у больных с острой церебральной недостаточностью в следствии острых отравлений угарным газом и продуктами горения / В.В. Шилов [и др.] // Медицина труда и промышленная экология. - 2012. - № 6. - С. 22-27.
23 Mete F. Comparison of intraperitoneal and intratesticular ozone therapy for the treatment of testicular ischemia-reperfusion injury in rats / F. Mete [et al.] //Asian J. Androl. - 2016. - № 1. - P. 1-4.
24 Xingxing, Sun. Potential use of the hyperoxygenated solution as a treatment strategy for carbon monoxide poisoning / Sun Xingxing [et al.] // Plosone. - 2013. - № 12 (vol. 8.). - P. 1-9.
Рукопись получена: 18 апреля 2016 г. Принята к публикации: 29 апреля 2016 г.
