CC BY
0
Онкоиммунология
© Коллектив авторов, 2024
Васильева Т.В.1, Иванов C.B.2, Ушакова Е.И.1, Аль Худур С.А.1, Лебедева Е.С.1, Пичугин A.B.1, Атауллаханов Р.И.1
Экспериментальная модель взаимодействия лигандов с рецепторами иммунных контрольных точек на примере PD1 и PD-L1
1 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Государственный научный центр «Институт иммунологии» Федерального медико-биологического агентства, 115522, г. Москва, Российская Федерация
2 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова» Российской академии наук, Министерство науки и высшего образования Российской Федерации, 117997, г. Москва, Российская Федерация
Резюме
Введение. Блокада рецепторов иммунных контрольных точек (immune checkpoint blockade, ICB) - это одно из эффективных направлений современной иммунотерапии пациентов со злокачественными новообразованиями. Клиницисты используют блокирующие антитела к рецепторным белкам PD1, PD-L1, LAG3, экспонированным на различных типах клеток, включая Т-, НК-, B-клетки, а также миелоидные клетки микроокружения и непосредственно злокачественные клетки опухоли. Широкий опыт применения ICB показал значительные различия в клинической эффективности различных препаратов и их комбинаций. Стала очевидной актуальная задача разработки широкого спектра новых препаратов для ICB. В свою очередь, для разработки новых чекпойнт-блокато-ров требуются удобные и эффективные экспериментальные модели, с помощью которых можно было бы проводить скрининг существующих и вновь разработанных лекарственных веществ.
Цель. Данная работа посвящена разработке и детальному изучению двух экспериментальных моделей для обнаружения и характеристики новых чекпойнт-блокаторов.
Материал и методы. Для анализа блокады сигнальной оси PD1 ^ PD-L1 использованы трансдуцированные клетки линии HEK293-PD1, устойчиво экспрессирующие на своей поверхности рецепторный белок PD1. Одна из двух разработанных экспериментальных моделей исследует ингибирование взаимодействия растворимого реком-бинантного белка PD-L1-Fc, меченого биотином, с клетками линии HEK293-PD1. Во второй экспериментальной модели мы анализируем ингибирование взаимодействия меченого флуорохромом антитела к PD1 с клетками HEK293-PD1. Связывание меченых лигандов с клетками исследовали методом проточной цитофлуориметрии. Об инги-бировании связывания судили по изменению интенсивности флуоресценции меченых клеток.
Результаты. В разработанных экспериментальных моделях исследованы блокирующие свойства терапевтических антител к PD1 и PD-L1, а также растворимых рекомби-нантных белков PD-L1-Fc и PD1-Fc. Показана высокая чувствительность предложенных экспериментальных моделей, позволяющая не только установить наличие блокирующих свойств любого вещества на взаимодействие PD-L1 с PD1, но и определить удельную активность блокаторов PD-L1 и PD1 с полумаксимальной константой ингибирования (K50) в области наномолярных концентраций исследуемого вещества. Авторы считают, что предложенный подход можно использовать для создания экспериментальных моделей с любыми клеточными рецепторами в качестве молекулярных мишеней ингибирования.
Ключевые слова: PD1-no3HTHBHafl клеточная линия; растворимые PD1 и PD-L1; антитело; ингибирование; цитометрия
Статья получена 28.04.2024. Принята в печать 14.06.2024.
Для цитирования: Васильева Т.В., Иванов C.B., Ушакова Е.И., Аль Худур С. А., Лебедева Е.С., Пичугин A.B., Атауллаханов Р.И. Экспериментальная модель взаимодействия лигандов с рецепторами иммунных контрольных точек на примере PD1 и PD-L1. Иммунология. 2024; 45 (4): 473-485. DOI: https://doi.org/10.33029/1816-2134-2024-45-4-473-485
Для корреспонденции
Атауллаханов Равшан Иноятович -доктор медицинских наук, профессор, руководитель отдела иммунной биотехнологии, заведующий лабораторией активации иммунитета ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-4767-6409
Финансирование. Исследование выполнено в рамках государственного задания 2024—2025 гг., соглашение № 388-03-224-156 от 19.02.2024 г. с Федеральным медико-биологическим агентством. Публикация результатов исследования в открытой печати разрешена.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Вклад авторов. Идея исследования - Атауллаханов Р.И.; дизайн экспериментов - Атауллаханов Р.И., Пичу-гин A.B.; получение линии клеток HEK293-PD1 и рекомбинантных белков PD1-Fc и PD-L1-Fc - Иванов C.B.; проведение экспериментов в культурах клеток - Васильева Т.В.; цитометрия клеток - Васильева Т.В., Пичугин A.B.; статистическая обработка результатов - Васильева Т.В.; анализ результатов - Атауллаханов Р.И., Пичугин A.B., Лебедева Е.С., Васильева Т.В.; концепция статьи - Атауллаханов Р.И.; написание статьи - Атауллаханов Р.И., Лебедева Е.С., Васильева Т.В.; техническое оформление статьи - Ушакова Е.И., Аль Худур С. А.
Vasileva T.V.1, Ivanov S.V.2, Ushakova E.I.1, Al Khudhur S.A.1, Lebedeva E.S.1, Pichugin A.V.1, Ataullakhanov R.I.1
Experimental model of ligands to immune checkpoint receptor interaction on the example of PD1 and PD-L1
1 National Research Center - Institute of Immunology of the Federal Medical-Biological Agency, 115522, Moscow, Russian Federation
2 M.M. Shemyakin and Yu.A. Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry of the Russian Academy of Sciences, Ministry of Science and Higher Education of the Russian Federation, 117997, Moscow, Russian Federation
Abstract
Introduction. Blockade of immune checkpoint receptors (immune checkpoint blockade, ICB) is one of the effective approaches of modern immunotherapy for patients with malignant neoplasms. Clinicians use blocking antibodies to the PD1, PD-L1 and LAG3 receptor proteins exposed on various types of cells, including T-, NK-, B-cells, as well as myeloid cells of the tumor microenvironment and malignant cells. Extensive experience with ICB has shown significant differences in the clinical effectiveness of different checkpoint blocking drugs and their combinations. The need of development of a wide range of new drugs for ICB has become obvious. In turn, the development of new checkpoint blockers requires convenient and efficient experimental models suitable for the screening of existing and newly developed drugs.
Aim. This paper is devoted to the development and detailed study of two experimental models for the detection and characterization of new checkpoint blockers.
Material and methods. To analyze the blockade of the PD1 ^ PD-L1 signaling axis, transduced HEK293-PD1 cells that stably express the PD1 receptor protein on their surface were used. One of two experimental models developed examines the inhibition of the interaction of soluble recombinant biotin-labeled PD-L1-Fc protein with HEK293-PD1 cells. In a second experimental model, we analyze the inhibition of interaction of a fluorochrome-labeled anti-PD1 antibody with HEK293-PD1 cells. The labeled ligands to cell binding was studied by flow cytometry. Inhibition of binding was assessed according to changes in the fluorescence intensity of labeled cells.
Results. In the developed experimental models, the blocking properties of therapeutic antibodies to PD1 and PD-L1, as well as soluble recombinant PD-L1-Fc and PD1-Fc proteins were studied. The proposed experimental models shown to be highly sensitive, detecting not only the blocking properties of any substance with respect to the PD-L1-to-PD1 interaction, but also determining the specific activity of PD-L1 and PD1 blockers with half-maximal inhibition constant (K50) in the range of nanomolar concentrations of the test substance. It is claimed that the proposed approach can be used to create experimental models with any cellular receptors as molecular targets of inhibition.
Keywords: PD1-positive cell line; soluble PD1 and PD-L1; antibody; inhibition; cytometry
Received 28.04.2024. Accepted 14.06.2024.
For citation: Vasileva T.V., Ivanov S.V., Ushakova E.I., Al Khudhur S.A., Lebedeva E.S., Pichugin A.V., Ataullakhanov R.I. Experimental model of ligands to immune checkpoint receptor interaction on the example of PD1 and PD-L1. Immunologiya. 2024; 45 (4): 473-85. DOI: https://doi.org/10.33029/1816-2134-2024-45-4-473-485 (in Russian)
For correspondence
Ravshan I. Ataullakhanov -MD, PhD, Professor, Head of the Immune Biotechnology Dept., Head of the Immunity Activation Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-4767-6409
Funding. The study was supported by State assignment for 2024-2025 (agreement No. 388-03-224-156 from 19.02.2024 with Federal Medical-Biological Agency). Open publication of the research results is allowed.
Conflict of interests. The authors declare no conflict of interests.
Authors' contribution. The idea of the study - Ataullakhanov R.I.; design of experiments - Ataullakhanov R.I., Pichugin A.V.; obtaining the HEK293-PD1 cell line and recombinant proteins PD1-Fc and PD-L1-Fc - Ivanov S.V.; conducting experiments in cell cultures - Vasilyeva T.V.; cell cytometry - Vasilyeva T.V., Pichugin A.V.; statistical processing of results - Vasilyeva T.V.; analysis of results - Ataullakhanov R.I., Pichugin A.V., Lebedeva E.S., Vasilyeva T.V.; concept of the article - Ataullakhanov R.I.; writing the article - Ataullakhanov R.I., Lebedeva E.S., Vasilyeva T.V.; technical design of the article - Ushakova E.I., Al Khudur S.A.
Введение
PD1 (от англ. programmed cell death 1, известен также как CD279) - белок-рецептор на поверхности Т- и В-клеток. Связывание лигандов с PD1 ингибирует активность лимфоидных клеток и может индуцировать их апоптоз. PD1 и его лиганды регулируют иммунные реакции и по этой причине PD1 относится к иммунным контрольным точкам [1-3].
PD-L1 (от англ. programmed cell death-ligand 1, известен также как CD274) - мембранный белок, лиганд рецептора PD1, экспонируется на поверхности активированных макрофагов и дендритных клеток, активированных Т- и В-клеток, а также на клетках многих других тканей. Взаимодействие PD-L1 с рецептором PD1 индуцирует в PD1-пoлoжитeльныx клетках ингибирующий сигнал, что подавляет функционирование и размножение активированных Т- и В-клеток, а также может вызвать их апоптоз [4-6].
Белок PD-L1 на клетках злокачественных опухолей через воздействие на рецепторы PD1 ингибирует активность противоопухолевых Т-клеток. Блокирование взаимодействия PD-L1 с рецепторами PD1 с помощью антител к одной или сразу к обеим молекулам позволяет отменить иммуносупрессию, активировать противоопухолевые Т-клетки и называется блокадой иммунных контрольных точек (от англ. immune checkpoint blockade). Такая блокада с помощью терапевтических моноклональных антител к PD1 и PD-L1 успешно используется в последнее десятилетие для иммунотерапии пациентов с онкологическими заболеваниями [7-14].
Кроме PD1, на Т-клетках экспонируются и другие ингибирующие рецепторы, в частности CTLA-4, TIM-3, LAG-3, TIGIT и др. Разрабатываются новые лекарственные препараты, нацеленные на блокирование этих рецепторов для уменьшения иммуносупрес-сии у пациентов со злокачественными новообразованиями [9]. Показано, что разные блокаторы указанных чекпойнт-рецепторов проявляют разную эффективность при лечении пациентов с онкологическими заболеваниями. Кроме того, одновременное блокирование двух или более ингибирующих рецепторов позволяет достичь синергического эффекта при лечении [15, 16]. Эти знания побуждают исследователей и фармацевтические компании разрабатывать новые лекарственные препараты для терапевтической блокады ингибирующих рецепторов клеток иммунитета [17]. В этой связи
возникает повышенная потребность в удобных для использования экспериментальных моделях, в которых можно было бы проводить скрининг и изучение новых чекпойнт-блокаторов.
В данной статье мы сообщаем о создании и апробации двух экспериментальных моделей для поиска и детального изучения блокаторов ингибирующих чекпойнт-рецепторов. В обеих моделях мы используем генетически модифицированную линию клеток HEK293 с устойчивой экспрессией PD1-рецепторов на клеточной поверхности (далее HEK293-PD1). Одна модель строится на взаимодействии меченого реком-бинантного растворимого лиганда PD-L1 с клетками HEK293-PD1. В другой модели в качестве основы используется взаимодействие меченых антител к PD1 с теми же клетками HEK293-PD1. В качестве контрольных клеток, лишенных PD1, мы использовали клетки дикого типа HEK293T. В работе описаны результаты количественного исследования пригодности указанных экспериментальных моделей для скрининга новых блокаторов взаимодействия PD1 c PD-L1. Представлены данные о специфичности и чувствительности предложенных экспериментальных моделей. Использованный в работе методический подход на примере блокирования PD1 и PD-L1 показывает, как можно создавать простые и чувствительные экспериментальные модели для других рецепторов иммунных контрольных точек.
Материал и методы
Получение линии клеток HEK293-PD1, экспрес-сирующих PD1 человека. Линию клеток HEK293T трансдуцировали вектором для экспрессии мембранной формы белка PD1 человека по методу Y. Fukumoto и соавт. [18] с некоторыми модификациями. РНК выделяли на колонках с использованием набора RNeasy Mini kit (Qiagen; США) из мононуклеаров крови человека, активированных иономицином и форболовым эфиром. Очищенную РНК использовали для синтеза обратной цепи кДНК при помощи ProtoScript II First Strand cDNA Synthesis Kit (NEB; США). кДНК амплифици-ровали с использованием высокоточной полимеразы Tersus («Евроген», Россия) и праймеров PDCD1 XbaI dir (5'-tataTCTAGACTCCAGGCATGCAGATCCCACAG-3') и PDCD1 BamHI rev (5'-atatGGATCCTTAGATGACG GCCAGGACCCAGAC-3'). Ампликоны элекгрофоре-тически отделяли и очищали при помощи твердофаз-
ной экстракции, клонировали по сайтам рестрикции XbaI - BamHI (ферменты NEB, США) в лентивирусный экспрессионный вектор pLSFFV-PL4-puro (лигаза T4, «Евроген», Россия). Трансфекцию клеток HEK-293T проводили в среде Opti-MEM (Gibco, США). В культуру клеток HEK-293T вносили плазмиду pLSFFV-PDCDl-puro вместе с упаковывающими плазмидами psPAX2 и pMD2.G (Dr. Didier Trono, Addgene_12260, США). На следующий день среду заменяли на бессывороточную DMEM-F12 с добавлением Serum replacement solution и Lipid mixture (Peprotech, США) и 4 мМ кофеина (Sigma Aldrich, США). Через 48 ч обогащенную ленти-вирусом среду собирали, фильтровали и использовали для трансфекции свежих клеток HEK293T в присутствии полибрена (Sigma Aldrich, США). Через 72 ч для селекции трансфецированных клеток в культуральную среду добавляли 1 мкг/мл пуромицина (Sigma Aldrich, США) и продолжали культивировать клетки в течение 10 дней. Трансфецированные HEK293-PD1, экс-прессирующие целевой ген PD1, поддерживали в культуре in vitro регулярными пассажами, как и клетки дикого типа.
Культивирование клеток линий HEK293T
и HEK293-PD1. Клетки HEK293T и HEK293-PD1 культивировали in vitro в полной культуральной среде (ПС), составленной из Advanced RPMI-1640 (Gibco, США) c добавлением 10 % эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone, SV30160.03 Cytiva, GE Healthcare Life Sciences HyClone, США), 1* коктейля заменимых аминокислот, 1 мМ пирувата натрия, 2 мМ L-глутамина и 10 мкг/мл гентамицина (все реактивы ПанЭко, Россия), в чашках Петри, при 37 °C, в увлажненной атмосфере 5 % С02 в воздухе. Клетки пересевали, когда они занимали до 70-80 % поверхности. Для этого клетки снимали с пластика с помощью трипсина-ЭДТА, отмывали в фосфатном буфере с 0,5 % бычьего сывороточного альбумина (PBS-BSA, ПанЭко, Россия), помещали в ПС для нового пассажа, уменьшив концентрацию клеток в 10 раз.
Получение рекомбинантных белков PD1-Fc
и PD-L1-Fc. Для получения белков PD1-Fc и PD-L1-Fc мы объединили последовательность внеклеточной части PD1 человека (Leu25-Gln167) и PD-L1 (Phe19-Thr167) с последовательностью Fc-фрагмента человеческого IgG1 (CH2-CH3^0MeHbi) через глицин-сери-новый линкер (G4S)3. Нативные сигнальные пептиды PD1 и PD-L1 были заменены в составе рекомбинантных белков последовательностью сигнального пептида MGWSLILLFLVAVATRVLS. Синтез кодон-оптимизи-рованных нуклеотидных последовательностей белков PD1-Fc и PD-L1-Fc для экспрессии в клетках CHO заказывали в компании Synbio Technologies (КНР) и клонировали в экспрессионный вектор pCDNA 3.1.
Транзиторную трансфекцию суспензионых клеток CHO-S (Large-scale transient transfection of suspension CHO-S cell) выполняли по методу D.J. Leahy и соавт. [19]. Для трансфекции клеточной линии CHO-S использовали линейный полиэтиленимин 25 кДа (Sigma-Aldrich,
США) в весовом соотношении 3 : 1 к плазмидной ДНК. Затем клетки культивировали в бессывороточной среде HyClone SFM4CHO (Cytiva, США) в течение 5-7 сут при 37 °С и 5 % CO2 и постоянном перемешивании при 130 об/мин на орбитальном шейкере. Процесс останавливали при снижении жизнеспособности клеток до 70-80 %.
Очистку рекомбинантных белков PD1-Fc и PD-L1-Fc проводили методом аффинной хроматографии на протеин А-сефарозе (GE Healthcare, США) в соответствии с рекомендациями производителя. Целевой белок с колонки элюировали 0,1 М глициновым буфером (рН 3,5), полученные фракции нейтрализовали путем добавления 1 М Tris-HCl (pH 8,0) в соотношении 1 : 10 к объему глицинового буфера. Затем белок диализовали против фосфатно-солевого буфера pH 7,2 и концентрировали на центрифужных фильтрах Amicon Ultra - 15 (Merck-Millipore, США).
Методика исследования взаимодействия лиган-дов с PD1 на поверхности клеток. Экспрессию PD1 на поверхности клеток HEK293-PD1 измеряли по интенсивности флуоресценции клеток, окрашенных лиган-дами к PD1. В качестве контроля использовали клетки линии HEK-293T, на которых PD1 отсутствует. Для поверхностного окрашивания пробы инкубировали с флуорохром-конъюгированными лигандами в течение 15 мин в темноте с последующей отмывкой PBS-BSA. Использовали следующие реагенты: антитело к PD1, меченое FITC (anra-PD1-FITC, Cat. 329904, BioLegend, США), антитело к PD1, конъюгированное с биотином (anti-PD1-biotin, Cat. 329934, BioLegend, США), Strept-avidin-FITC (MBS 674975, Biosource, США). Клетки исследовали методом проточной цитофлуориметрии на приборе BD FACS Aria II (Becton-Dickinson, США). Регистрировали флуоресценцию и светорассеяние не менее 30 тыс. клеток в каждом анализируемом образце. Анализ флуоресценции проводили на живых клетках (DAPI-отрицательные). Обработку данных цитоме-трии проводили с помощью программного обеспечения Cytobank Community (Beckman Coulter, США). Статистическую обработку данных проводили в программе Microsoft Excel.
Методика исследования ингибиторов взаимодействия PD-L1 с PD1. Ингибиторы взаимодействия PD-L1 с PD1 исследовали в двух разработанных нами экспериментальных моделях, описанных в разделе «Результаты». В этих моделях растворимый меченый лиганд PD-L1 или меченое антитело к PD1 связываются с PD1 на поверхности клеток HEK293-PD1. Для проверки ингибирующей активности различные концентрации потенциального ингибитора, а также меченый лиганд, специфичный к PD1, добавляли в суспензию клеток HEK293-PD1 или контрольных клеток HEK293T и инкубировали в течение 15-20 мин при температуре 4 °С. После инкубации клетки отмывали центрифугированием в PBS-BSA. Флуоресценцию клеток измеряли методом проточной цитофлуориметрии. По снижению интенсивности флуоресценции в результате предва-
Рис. 1. Связывание антител с РБ1 на клетках ЫЕК293-РБ1
По оси абсцисс — концентрация антитела при окрашивании клеток; по оси ординат — интенсивность флуоресценции клеток (проточная цитофлуориметрия), меченых указанным антителом. Учитывается только флуоресценция живых ОАР1-отрицателъных клеток.
Анти-PDl-FITC
V
HEK293-PD1
С
о s
« S
я а
s s
О <Ц
и а
<ц о
H <и
â Й-
S S
80 000 -г
60 000 --
40 000 --
20 000 --
+
+
+
+
Контроль 0,005 0,0148 0,044 0,133 Концентрация анти-PD1-FITC, мкМ
э
C
ь IT
ть о FI
о и
н и
X ц
и н
о е
н ц
е о
т е
н р
is о
&
10 000 -г
7500 -
5000
2500
Стрептавидин-FITC *
Анти-PDl-biotin
V
HEK293-PD1
Контроль 0,006 0,0187 0,055 0,167 Концентрация анти-PD1-biotin, мкМ
0
0
рительного инкубирования с исследуемым веществом судили об ингибирующей активности этого вещества в отношении взаимодействия лигандов с РБ1 на поверхности клеток ЫЕК293-РБ1.
Результаты
Экспрессия РБ1-рецеиторов на поверхности генетически модифицированных клеток линии НЕК293-РБ1
Для получения клеточной популяции с устойчивой экспрессией РБ1-рецептора на внешней клеточной мембране была получена линия генетически модифицированных клеток ЫЕК293-РБ1. Как это было описано в разделе «Материал и методы», клетки линии ЫЕК293Т трансдуцировали лентивирусным вектором, содержащим экспрессионную кассету с полноразмерным геном мембранной формы белка РБ1 человека. Селекцию клеток-трансдуцентов проводили в присутствии пуромицина, поскольку в экспрессионной кассете присутствовал ген устойчивости к этому антибиотику. В интересах данного исследования было необходимо оценить уровень экспрессии белка РБ1 на поверхности
клеток-трансдуцентов ЫЕК293-РБ1. Экспрессию РБ1-рецепторов на поверхности клеток оценивали методом проточной цитофлуориметрии.
Для детекции молекул РБ1 использовали два различных конъюгата одного и того же моноклональ-ного антитела (1^01, мышь, клон ЕЫ12.2Ы7, Вю1е-gend, США), специфично связывающегося с белком РБ1 человека. Один конъюгат представлял собой антитело к РБ1, ковалентно модифицированное ИТС (анти-РБЬИТС), что позволяло измерять связывание флуоресцентно меченого антитела с клетками ЫЕК293-РБ1, используя прямой метод окрашивания клеток. Во втором конъюгате антитело к РБ1 было ковалентно модифицировано биотином (анти-РВ1-Ью1т), что позволяло оценивать связывание этого конъюгата с клетками ЫЕК293-РБ1, используя «сэндвич-метод», в котором меченое биотином антитело выявлялось на поверхности клеток с помощью второго конъюгата - стрептави-дин-ИТС ^^ауЫт-ИТС).
Результаты взаимодействия двух использованных антительных конъюгатов, специфичных к РБ1 человека, с поверхностью клеток ЫЕК293-РБ1 доказывают экспрессию большого количества молекул РБ1
Стрептавидин-FITC
*
PD-L1-Fc-biotin
HEK293-PD1
2000
1500
HEK293-PD1 О HEK293T
t? 1000
500
s S
0 ^-,-,-.-Г-
Контроль 0,02 0,05 0,14 0,42 1,27 3,80 Концентрация растворимого лиганда PD-L1-Fc-biotin, мкМ
Рис. 2. Связывание растворимого РБ-Ы-Бс-ЬюНи с клетками ЫЕК293-РБ1
По оси абсцисс — концентрация растворимого РО-Ы-Рс-ЫоНп; по оси ординат — интенсивность флуоресценции клеток (проточная цитофлуориметрия), меченых указанной концентрацией растворимого РО-Ы-Рс-ЫоНп с последующим окрашиванием Б1гер1а\пСт-К[ТС. Контрольные клетки НЕК293Т, лишенные РП1, не связывают растворимый лиганд РО-Ы-Рс-ЬюИп.
на поверхности клеток-трансдуцентов HEK293-PD1 (рис. 1). Связывание анти-PDl-FITC и анти-PDl-biotin прямо зависело от концентрации антитела при инкубации с клетками. Интенсивность флуоресценции клеток HEK293-PD1 линейно нарастала в исследованном диапазоне концентраций от 5 до 133 нМ анти-PDl-FITC и от 6 до 167 нМ анти-PDl-biotin. При окрашивании клеток HEK293T с помощью aHra-PD1-FITC и анти-PD1-biotin интенсивность флуоресценции оставалась на уровне фоновой флуоресценции неокрашенных клеток.
В дальнейшей работе мы использовали трансдуци-рованные клетки HEK293-PD1 в качестве линии PD1-позитивных клеток.
Растворимый лиганд PD-L1-Fc связывается с PD1 на поверхности клеток HEK293-PD1
Белок PD-L1 является лигандом рецептора PD1. В организме человека PD-L1 экспонирован на клеточной мембране активированных антиген-презен-тирующих клеток (АПК), активированных лимфоцитов, а также клеток различных тканей без какой-либо дополнительной активации. Естественная роль такой экспрессии PD-L1 состоит в торможении избыточной пролиферации и агрессивного функционирования активированных лимфоцитов при их повторном взаимодействии с АПК. Представленность PD-L1 на поверхности клеток самых разных тканей защищает эти ткани от аутоиммунных реакций.
В условиях in vitro мы смоделировали процесс взаимодействия молекул PD-L1 с клетками, на поверхности которых экспонированы рецепторы PD1. Для этого использовали клетки генетически модифицированной линии HEK293-PD1 и растворимый рекомбинант-ный белок PD-L1-Fc, представляющий собой белок слияния, состоящий из внемембранной части PD-L1 и Fc-фрагмента IgG1 человека. Мы использовали PD-L1-Fc, ковалентно конъюгированный с биотином (далее
РБ-Ы-Рс-Ьюйп). Связавшиеся с клеточной поверхностью молекулы РБ-Ь1-Рс-Ью1т количественно детектировали с помощью 81тер1ау1ёт-Р1ТС. Результаты исследования представлены на рис. 2.
Полученные данные свидетельствуют о том, что рекомбинантный растворимый белок РБ-Ы-Ьс специфически взаимодействует с молекулами РБ1 на поверхности клеток ЫЕК293-РБ1. Количество молекул РБ-Ь1-Рс-Ью1т, связавшихся с поверхностью клеток ЫЕК293-РБ1, прямо зависело от концентрации растворимого лиганда в среде при инкубировании с клетками. Кривая зависимости связывания лиганда РБ-Ы-Рс-Ыо-йп с РБ1-позитивными клетками имела 8-образный вид с областью насыщения. Линейное нарастание количества связавшихся с клеткой молекул лиганда наблюдалось в области концентраций от 0,14 до 1,27 мкМ РБ-Ы-Рс-Ьюйп, область насыщения - выше 1,27 мкМ. Полученные данные позволяют с некоторой погрешностью определить константу полумаксимального связывания в области 0,3 мкМ, что является полезной количественной характеристикой взаимодействия РБ-Ы-Рс-Ьюйп с клетками ЫЕК293-РБ1, экспрессирую-щими на поверхности рецепторные молекулы РБ1. На контрольных клетках ЫЕК293Т, лишенных молекул РБ1, связывания лиганда РБ-Ы-Рс-Ьюйп не происходило (см. рис. 2), что свидетельствует о специфичности связывания РБ-Ь1 -Рс-Ьюйп с молекулами РБ1 на поверхности клеток, экспонирующих РБ1.
Терапевтические антитела к PD1 и к PD-L1 блокируют связывание растворимого лиганда PD-L1-Fc с PD1-peцeптopoм на поверхности клеток HEK293-PD1
Описанная в предшествующем разделе статьи экспериментальная модель специфичного взаимодействия растворимого лиганда РБ-Ь 1 -Рс-Ьюйп с РБ1-рецепторами на поверхности клеток ЫЕК293-РБ1 оказалась удобной для анализа специфической акгивно-
Сгрептавидин-FITC
Р
PD-L1-Fc-biotin
Г
PD1
HEK293-PD1
Стрептавидин-FITC
Анти-PD1-biotin
Г
HEK293-PD1
0 800 -| H
Е
s
| 600
<ц
а
& 400
§ 200 -
а
а S
101 0 101
НЕК-PDl^PD-Ll-Fc-biotin d150
10
10
10
,4
FITC-A
HEK-PDbPD-L1-Fc-biotin d150^dpa PD
-102 0 102
0 0,0014 0,004 0,12 0,037 0,112 0,335 Контроль Концентрация анти-PD!, мкМ
Анти-PD! > 0,012 мкМ
103
FITC-A
104
105
Рис. 3. Ингибирование взаимодействия растворимого РБ-Ы-Рс-ЫоПп с клетками ЫЕК293-РБ1 с помощью терапевтического антитела к РБ1 (пембролизумаб)
По оси абсцисс — концентрация терапевтического антитела; по оси ординат — интенсивность флуоресценции клеток (проточная цитофлуориметрия), меченых растворимым РО-Ы-Ес-ЪШт с последующим окрашиванием 81гер1ау1Лп-МТС. Анализ флуоресценции проводили на всех живых клетках (ПАР1-отрицателъные). Показана стратегия гейтирования и репрезентативные гистограммы флуоресценции клеток в отсутствии ингибиторных антител (контроль) или в присутствии анти-Р01 антитела.
0
сти блокаторов РБ1 и РБ-Ь1. Мы исследовали в этой экспериментальной модели два терапевтических антитела, которые широко используются для блокирования взаимодействия РБ1 с РБ-Ь1 при лечении онкологических и инфекционных заболеваний.
Пембролизумаб - терапевтическое антитело, специфично блокирующее рецепторы РБ1, было использовано для блокирования взаимодействия растворимого РБ-Ы-Рс-Ыойп с РБ1 на поверхности клеток ЫЕК293-РБ1. Представленные на рис. 3 данные показывают, что в созданной нами экспериментальной модели терапевтическое антитело к РБ1 эффективно блокировало вза-
имодействие растворимого РБ-Ь1 с РБ1-позитивными клетками с константой ингибирования в области 4 нМ пембролизумаба. Полное блокирование достигалось при концентрации пембролизумаба в области 40 нМ.
Другое терапевтическое антитело - атезолизумаб -специфично не к рецептору РБ1, а к лиганду РБ-Ь1. Антитело к лиганду РБ-Ы тоже проявляло выраженные свойства блокатора взаимодействия РБ-Ы-Рс-Ьюйп с клетками ЫЕК293-РБ1 в нашей экспериментальной модели (рис. 4). Как было описано в разделе «Материал и методы», растворимый РБ-Ы-Рс-Ьюйп и анти-РБ-Ы инкубировали с клетками ЫЕК293-РБ1, затем отмы-
Стрептавидин-РГГС
*
РВ-Ы-Рс-Ыойп
РБ1
НЕК293-РБ1
Стрептавидин-РГТС
РВ-Ы-Рс-Ыойп
*
"а
Анти-РБ-Ы
РБ1
НЕК293-РБ1
Рис. 4. Ингибирование взаимодействия растворимого РБ-Ы-Рс-Ыойп с клетками НЕК293-РБ1 с помощью терапевтического антитела к РБ-Ь1 (атезолизумаб)
По оси абсцисс — концентрация терапевтического антитела (атезолизумаб); по оси ординат — интенсивность флуоресценции клеток (проточная цитофлуориметрия), меченых растворимым РО-Ы-Рс-ЬШт с последующим окрашиванием Б1гер1ая1сИп-МТС. Анализ флуоресценции проводили на всех живых клетках (рЛРТ-отрицательные). Гейтирование — как показано на рис. 3.
Анти-РБ1-РГТС
V
НЕК293-РБ1
Контроль
Анти-РБ1-РГТС
Хч-
НЕК293-РБ1
0,04 мкМ
Интенсивность флуоресценции FITC
Рис. 5. Ингибирование с помощью растворимого рецептора РБЬБс взаимодействия анти-РБ1-Е1ТС с клетками НЕК293-РБ1
Представлены данные проточной цитофлуориметрии при использовании растворимого РП1-Рс в концентрациях 0,04 или 0,4 мкМ. Гистограммы по результатам проточной цитофлуориметрии: по оси абсцисс — интенсивность флуоресценции клеток НЕК293-Р01, меченых анти-Р01-Р1ТС. Контроль — окрашивание клеток НЕК293-РП1 анти-Р01-Р1ТС в отсутствии растворимого Р&1-¥с.
Анти-PDbFITC
V
HEK293-PD1
Контроль
V
Анти-PDbFITC
PDL1-Fc
HEK293-PD1
0,4 мкМ
Е
Интенсивность флуоресценции ПТС
Рис. 6. Ингибирование с помощью растворимого лиганда РБ-Ы-Бс взаимодействия анти-РБ1-Р1ТС с клетками НЕК293-РБ1
Представлены данные проточной цитофлуориметрии при использовании растворимого РО-Ь1-Рс в концентрациях 0,04 или 0,4 мкМ. Гистограммы по результатам проточной цитофлуориметрии: по оси абсцисс — интенсивность флуоресценции клеток ПЕК293-РП1, меченых анти-Р01-Р1ТС. Контроль — окрашивание клеток ПЕК293-РП1 анти-Р01-Р1ТС в отсутствии растворимого РО-Ь1-Рс.
вали и окрашивали ИТС-меченым стрептавидином. Действие атезолизумаба характеризовалось константой полумаксимального ингибирования в области 0,4 мкМ и полным блокированием взаимодействия РБ-Ы-РБ1 при концентрации > 1,24 мкМ.
Растворимые рекомбинантные белки РБ1 и РБ-Ь1 иигибируют взаимодействие специфических антител с РБ1-рецептором на поверхности клеток ИЕК293-РБ1
Количественный анализ связывания специфических антител с клетками РБ1-позитивной линии тоже может служить удобной экспериментальной моделью для скрининга и изучения активности ингибиторов взаимодействия РБ-Ь1 и РБ1. Мы исследовали инги-бирующую активность растворимых рекомбинантных вариантов белков РБ1-Бс и РБ-Ы-Бс в модели взаимодействия меченых флуорохромом антител к РБ1 с клетками НЕК293-РБ1. Оказалось, что растворимый рецептор и растворимый лиганд способны ингибиро-вать взаимодействие специфического антитела с рецепторами РБ1 на поверхности клеток НЕК293-РБ1 (рис. 5 и 6).
Растворимый рецептор РБ1-Бс эффективно ингиби-рует связывание анти-РБ1-ИТС с клетками НЕК293-РБ1. Так, растворимый РБ1-Бс в концентрации 40 нМ снижал в 2,6 раза, а в концентрации 400 нМ - в 6,8 раз связывание анти-РБ1-ИТС с клетками НЕК293-РБ1 (рис. 5). Это неудивительно, поскольку растворимая форма рецептора может эффективно конкурировать за связывание с лигандом с мембранной формой того же рецептора, экспонированного на поверхности клетки.
В этой же модели взаимодействия меченого антитела с PD1 на поверхности клеток отчетливо выявлялось ингибирующее действие растворимой формы лиганда PD-L1-Fc. Ингибирующее действие растворимого лиганда уступало такому действию растворимого рецептора, но все же было вполне очевидным. Так, в концентрации 40 нМ PD-L1-Fc снижал связывание анти-PDl-FITC с клетками HEK293-PD1 в 1,6 раза, а в концентрации 400 нМ - в 2,55 раза (рис. 6). Наличие ингибирующего действия растворимого лиганда PD-L1-Fc свидетельствует о том, что лиганд и использованное нами антитело (aHTH-PD1-FITC) взаимодействуют с одними и теми же или близко расположенными сайтами молекулы PD1-pe4enTopa. Только в этом случае растворимый лиганд может занимать именно те участки молекулы PD1, с которыми связывается антитело к PD1.
Обсуждение
Адаптивные иммунные реакции основаны на экспоненциальном размножении клонов Т- или В-лим-фоцитов, реагирующих на конкретные антигены. Скорости размножения активированных лимфоцитов таковы, что за 1-ю неделю число реагирующих клеток может увеличиться в 1000 раз, за следующую неделю -еще в 1000 раз и за 3-ю неделю - еще в 1000 раз. Легко представить, что при таком интенсивном размножении реагирующих на антигены лимфоидных клеток в организме может возникнуть опасность, сравнимая с моно- или олигоклональным лимфопролифератив-ным заболеванием. И такой риск сопровождает каж-
дую адаптивную реакцию в ответ на антигены инфекционной или любой другой природы. Очевидно, что должно быть жесткое и эффективное регулирование численности быстро размножающихся клеточных популяций [20-22]. Именно для такого регулирования на всех активированных размножающихся лимфоид-ных клетках экспонируются рецепторы, через которые подается сигнал, ингибирующий активность реагирующих клеток, останавливающий клеточное деление и даже включающий апоптоз размножающихся клеток. Ярким представителем таких ингибирующих рецепторов являются белковые молекулы PD1, которые экспонируются на лимфоидных клетках вскоре после их активации. При достаточно большом количестве PDl-рецепторов лимфоидная клетка не может получать повторное стимулирование, контактируя с АПК, поскольку на поверхности АПК экспонируются белки PD-L1, являющиеся лигандами PD1. При контакте размножающейся Т-клетки с АПК происходит взаимодействие PD1 с PD-L1, что формирует ингибирующий сигнал внутри Т-клетки, который подавляет выработку функциональных цитокинов, останавливает митоти-ческое деление и даже может индуцировать гибель клетки путем апоптоза [3, 5, 10].
Многие злокачественные опухоли используют описанную выше естественную регуляцию адаптивных иммунных реакций для самозащиты от атаки Т-клеток. Для этого клетки опухоли экспонируют на своей поверхности большое количество молекул PD-L1. При контакте с такими защищенными клетками опухоли Т-клетки не способны выполнить свои противоопухолевые функции. Экспрессия молекул PD-L1 - это один из множества эффективных молекулярных механизмов избегания опухолью атаки иммунитета - явления, хорошо известного как tumor immune escape [2, 4, 10].
Блокаторы взаимодействия PD1 с PD-L1 отменяют описанную защиту опухолевых клеток от Т-клеточной атаки. Антитела, блокирующие PD1 или PD-L1, предотвращают ингибирование Т-клеток при их контакте с PD-L1 -позитивными опухолевыми клетками или АПК. Исключается или уменьшается торможение противоопухолевой функции Т-клеток. Это полезное действие антител к PD1 и PD-L1 используется при лечении пациентов со злокачественными опухолями. Антитела к PD1 и PD-L1 представляют собой наиболее успешные варианты терапевтических антител в арсенале блокады иммунных контрольных точек (immune checkpoint blockade) [9].
Наряду с PD1 и PD-L1 на Т-клетках экспонируются и другие ингибиторные рецепторы, такие, как CTLA-4, LAG-3, TIGIT, TIM-3 и др. [17, 23]. Исследователи активно изучают роль этих ингибиторных рецепторов в регуляции противоопухолевого действия Т-клеток. Разрабатываются соответствующие лекарственные препараты для блокирования этих ингибиторных рецепторов. Терапевтические антитела, блокирующие CTLA-4, успешно используются в практике онкологов.
Исследование терапевтических антител, специфичных к PD1 или CTLA-4, показало, что эти два чекпойнт-блокатора имеют разные клеточные мишени. Блокаторы PD1 главным образом действуют на Т-клетки-эффек-торы, а блокаторы CTLA-4 - на Т-клетки-регуляторы. Как следствие, различается терапевтическая эффективность анти-PDl- и aHra-CTLA-4-антител при лечении пациентов со злокачественными новообразованиями.
Так, отдаленные результаты лечения паицентов с меланомой в III и IV стадиях ракового процесса показали, что через 6,5 лет после начала лечения медиана общей выживаемости (median overall survival) составила 36,9 мес в группе пациентов, лечившихся пембролиз-умабом (анти-PDl), против 19,9 мес в группе пациентов, получавшей терапию ипилимумабом (aHTH-CTLA-4).
Значительно более эффективной оказалась комбинация этих препаратов. В группе пациентов, лечившихся комбинацией [пембролизумаб + ипилимумаб] медиана общей выживаемости составила 72,1 мес [16]. Эти клинические результаты убедительно доказывают, что разные блокаторы рецепторов иммунных контрольных точек действуют с различной эффективностью при лечении пациентов со злокачественными опухолями. Комбинации разнонаправленных терапевтических бло-каторов иммунных контрольных точек могут обладать существенными преимуществами по сравнению с одиночными препаратами. Следовательно, в арсенале онколога должно быть множество разных чекпойнт-блока-торов, нацеленных на разные молекулярные мишени и различающихся своими свойствами. Это, в свою очередь, означает, что необходимы удобные экспериментальные модели для разработки новых блокаторов иммунных контрольных точек. Наша работа, описанная в данной статье, как раз и посвящена разработке таких экспериментальных моделей.
Мы разработали и исследовали эффективность двух экспериментальных моделей. В одной из них блокаторы иммунных контрольных точек ингибировали взаимодействие растворимого лиганда PD-L1-Fc-biotin с рецептором PD1 на поверхности генетически модифицированных клеток HEK293-PD1 (см. рис. 2-4). В другой - ингибиторы препятствовали взаимодействию меченого aHra-PD1-anraTefla с PD1-pe4enTopoM на клетках HEK293-PD1 (см. рис. 5 и 6).
Как было описано выше, в организме происходит регуляторное взаимодействие двух типов клеток - PD1-ПОЗИТИВНЫХ T-КЛеТОК С PD-L1-n03HTHBHbIMH АПК или PD1-no3HTHBHbix Т-клеток с PD-L1-no3HTHBHbiMH клетками злокачественной опухоли.
Создать экспериментальную модель двух взаимодействующих типов клеток непросто, еще сложнее учитывать влияние такого взаимодействия на Т-клетки и количественно определять действие чекпойнт-бло-катора на функцию и выживаемость Т-клеток. Вместо модели взаимодействия PD1-позитивных Т-кле-ток с PD-L1-позитивными АПК или опухолевыми клетками мы создали гораздо более простые модели, в которых происходит взаимодействие меченого рас-
творимого лиганда или антитела с PD1-рецепторами на генетически модифицированных клетках линии HEK293-PD1, которые устойчиво экспрессируют PD1 (см. рис. 1), и эти клетки легко поддерживать в культуре in vitro.
Эффективность и специфичность созданных нами моделей доказаны с помощью терапевтических чек-пойнт-блокаторов, являющихся общепринятым «золотым стандартом» для блокады PD1 (пембролизумаб) или PD-L1 (атезолизумаб). Высокая чувствительность нашей экспериментальной модели отчетливо проявляется в том, что полумаксимальная константа ингибиро-вания для обоих антител оказалась в области наномо-лярных концентраций (см. рис. 3 и 4).
Представленные в работе данные позволяют рекомендовать обе предложенные нами экспериментальные модели для скрининга и детального изучения новых веществ, способных блокировать взаимодействие PD-L1 с PD1. Более того, описанный в данной статье путь вполне осуществим с другими ингибиторными рецепторами клеток иммунной системы. Для этого необходимо создать генетически модифицированные
■ Литература
1. Ishida Y., Agata Y., Shibahara K., Honjo T. Induced expression of PD-1, a novel member of the immunoglobulin gene superfamily, upon programmed cell death. EMBO J. 1992; 11 (11): 3887-95. DOI: https://doi. org/10.1002/j.1460-2075.1992.tb05481.x
2. Blank C., Mackensen A. Contribution of the PD-L1/PD-1 pathway to T-cell exhaustion: an update on implications for chronic infections and tumor evasion. Cancer Immunol. Immunother. 2007; 56 (5): 739-45. DOI: https://doi.org/10.1007/s00262-006-0272-1
3. Chen R.Y., Zhu Y., Shen Y.Y., Xu Q.Y., Tang H.Y., Cui N.X., Jiang L., Dai X.M., Chen W.Q., Lin Q., Li X.Z. The role of PD-1 signaling in health and immune-related diseases. Front. Immunol. 2023;14: 1163633. DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2023.1163633
4. Dong H., Strome S.E., Salomao D.R., Tamura H., Hirano F., Flies D.B., Roche P.C., Lu J., Zhu G., Tamada K., Lennon V.A., Celis E., Chen L. Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion. Nat. Med. 2002; 8 (8): 793-800. DOI: https://doi.org/10.1038/nm730
5. Butte M.J., Keir M.E., Phamduy T.B., Sharpe A.H., Freeman G.J. Programmed death-1 ligand 1 interacts specifically with the B7-1 costimu-latory molecule to inhibit T cell responses. Immunity. 2007; 27 (1): 11122. DOI: https://doi.org/10.1016/j.immuni.2007.05.016
6. Zou W., Wolchok J.D., Chen L. PD-L1 (B7-H1) and PD-1 pathway blockade for cancer therapy: Mechanisms, response biomarkers, and combinations. Sci. Transl. Med. 2016; 8: (328): 328rv4. DOI: https://doi. org/10.1126/scitranslmed.aad7118
7. Topalian S.L., Taube J.M., Anders R.A., Pardoll D.M. Mechanism-driven biomarkers to guide immune checkpoint blockade in cancer therapy. Nat. Rev. Cancer. 2016; 16 (5): 275-87. DOI: https://doi.org/10.1038/ nrc.2016.36
8. Huang A.C., Postow M.A., Orlowski R.J., Mick R., Bengsch B., Manne S., Xu W., Harmon S., Giles J.R., Wenz B., Adamow M., Kuk D., Panageas K.S., Carrera C., Wong P., Quagliarello F., Wubbenhorst B., D'Andrea K., Pauken K.E., Herati R.S., Staupe R.P., Schenkel J.M., McGettigan S., Kothari S., George S.M., Vonderheide R.H., Amara-vadi R.K., Karakousis G.C., Schuchter L.M., Xu X., Nathanson K.L., Wolchok J.D., Gangadhar T.C., Wherry E.J. T-cell invigoration to tumour burden ratio associated with anti-PD-1 response. Nature. 2017; 545 (7652): 60-5. DOI: https://doi.org/10.1038/nature22079
9. Sun Q., Hong Z., Zhang C., Wang L., Han Z., Ma D. Immune checkpoint therapy for solid tumours: clinical dilemmas and future trends. Sig-
линии клеток, устойчиво экспрессирующие рецептор, выбранный в качестве молекулярной мишени. В дополнение к таким клеткам необходимы также антитела и/ или растворимая форма лиганда, способного связываться с рецептором, выбранным в качестве молекулярной мишени.
Выводы
1. Представлены две экспериментальные модели для скрининга и изучения блокаторов рецептора РБ1 и лиганда РБ-Ы.
2. Специфичность модели доказана с помощью стандартных терапевтических антител пембролизумаб (анти-РБ1) и атезолизумаб (анти-РБ-Ы)
3. Чувствительность модели по блокирующему действию указанных стандартных антител определена в области наномолярных концентраций блокатора.
4. В предложенной экспериментальной модели показана возможность изучения ингибирующего действия растворимых вариантов белков-лигандов и белков-рецепторов иммунных контрольных точек.
nal Transduct. Target Ther. 2023; 8 (1): 320. DOI: https://doi.org/10.1038/ s41392-023-01522-4
10. Kornepati A.V.R., Vadlamudi R.K., Curiel T.J. Programmed death ligand 1 signals in cancer cells. Nat. Rev. Cancer. 2022; 22 (3): 174-89. DOI: https://doi.org/10.1038/s41568-021-00431-4
11. Гринько E.K., Донецкова А.Д. Основные подходы к применению моноклональных антител в иммунотерапии злокачественных новообразований. Иммунология. 2024; 45 (3): 355-366. DOI: https:// doi.org/10.33029/1816-2134-2024-45-3-355-366
12. Черткова А.И. Кадагидзе З.Г., Заботина Т.Н., Хуламха-нова М.М., Кушлинский Н.Е. CTLA-4, PD-1/PD-L1 негативные регуляторы Т-клеточного иммунитета в терапии рака яичников. Онкогине-кология. 2019; 2: 4-15. eLIBRARY ID: 39113302.
13. Кадагидзе З.Г., Черткова А.И. Новые подходы к повышению эффективности противоопухолевого иммунного ответа. Иммунология. 2015; 36 (1): 66-70. DOI: https://doi.org/10.18027/2224-5057-2015-1-24-30
14. Кушлинский Н.Е., Фридман М.В., Морозов А.А., Черткова А.И., Герштейн Е.С., Кадагидзе З.Г. PD-1-путь: биологическая значимость, клиническое применение и существующие проблемы. Молекулярная медицина, 2019; (1): 40-2. DOI: https://doi. org/10.29296/24999490-2019-01-01
15. Wolchok J.D., Rollin L., Larkin J. Nivolumab and Ipilimumab in Advanced Melanoma. N. Engl. J. Med. 2017; 377 (25): 2503-04. DOI: https://doi.org/10.1056/NEJMc1714339
16. Wolchok J.D., Chiarion-Sileni V., Gonzalez R., Grob J.J., Rut-kowski P., Lao C.D., Cowey C.L., Schadendorf D., Wagstaff J., Dummer R., Ferrucci P.F., Smylie M., Butler M.O., Hill A., Márquez-Rodas I., Haanen J.B.A.G., Guidoboni M., Maio M., Schoffski P., Carlino M.S., Lebbé C., McArthur G., Ascierto P.A., Daniels G.A., Long G.V., Bas T., Ritchings C., Larkin J., Hodi F.S. Long-Term Outcomes With Nivolumab Plus Ipilimumab or Nivolumab Alone Versus Ipilimu-mab in Patients With Advanced Melanoma. J. Clin. Oncol. 2022; 40 (2): 127-37. DOI: https://doi.org/10.1200/JCO.21.02229
17. Borgeaud M., Sandoval J., Obeid M., Banna G., Michielin O., Addeo A., Friedlaender A. Novel targets for immune-checkpoint inhibition in cancer. Cancer Treat. Rev. 2023; 120: 102614. DOI: https://doi. org/10.1016/j.ctrv.2023.102614
18. Fukumoto Y., Obata Y., Ishibashi K., Tamura N., Kikuchi I., Aoyama K., Hattori Y., Tsuda K., Nakayama Y., Yamaguchi N. Cost-effective gene transfection by DNA compaction at pH 4.0 using acidified, long
shelf-life polyethylenimine. Cytotechnology. 2010; 62 (1): 73-82. DOI: https://doi.org/10.1007/s10616-010-9259-z
19. Longo P.A., Kavran J.M., Kim M.S., Leahy D.J. Transient mammalian cell transfection with polyethylenimine (PEI). Methods Enzymol. 2013; 529: 227-40. DOI: https://doi.org/10.1016/B978-0-12-418687-3.00018-5
20. Krammer P.H., Arnold R., Lavrik I.N. Life and death in peripheral T cells. Nat. Rev. Immunol. 2007; 7 (7): 532-42. DOI: https://doi. org/10.1038/nri2115
21. D'Cruz L.M., Rubinstein M.P., Goldrath A.W. Surviving the crash: transitioning from effector to memory CD8+ T cell. Semin. Immunol. 2009; 21 (2): 92-8. DOI: https://doi.org/10.1016/j.smim.2009.02.002
22. McKinstry K.K., Strutt T.M., Swain S.L. Regulation of CD4+ T-cell contraction during pathogen challenge. Immunol/ Rev. 2010; 236: 110-24. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1600-065X.2010.00921.x
23. Qin S., Xu L., Yi M., Yu S., Wu K., Luo S. Novel immune checkpoint targets: moving beyond PD-1 and CTLA-4. Mol. Cancer. 2019; 18 (1): 155. DOI: https://doi.org/10.1186/s12943-019-1091-2
■ References
1. Ishida Y., Agata Y., Shibahara K., Honjo T. Induced expression of PD-1, a novel member of the immunoglobulin gene superfamily, upon programmed cell death. EMBO J. 1992; 11 (11): 3887-95. DOI: https://doi. org/10.1002/j.1460-2075.1992.tb05481.x
2. Blank C., Mackensen A. Contribution of the PD-L1/PD-1 pathway to T-cell exhaustion: an update on implications for chronic infections and tumor evasion. Cancer Immunol Immunother. 2007; 56 (5): 739-45. DOI: https://doi.org/10.1007/s00262-006-0272-1
3. Chen R.Y., Zhu Y., Shen Y.Y., Xu Q.Y., Tang H.Y., Cui N.X., Jiang L., Dai X.M., Chen W.Q., Lin Q., Li X.Z. The role of PD-1 signaling in health and immune-related diseases. Front Immunol. 2023;14: 1163633. DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2023.1163633
4. Dong H., Strome S.E., Salomao D.R., Tamura H., Hirano F., Flies D.B., Roche P.C., Lu J., Zhu G., Tamada K., Lennon V.A., Celis E., Chen L. Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion. Nat Med. 2002; 8 (8): 793-800. DOI: https://doi.org/10.1038/nm730
5. Butte M.J., Keir M.E., Phamduy T.B., Sharpe A.H., Freeman G.J. Programmed death-1 ligand 1 interacts specifically with the B7-1 costimu-latory molecule to inhibit T cell responses. Immunity. 2007; 27 (1): 11122. DOI: https://doi.org/10.1016/j.immuni.2007.05.016
6. Zou W., Wolchok J.D., Chen L. PD-L1 (B7-H1) and PD-1 pathway blockade for cancer therapy: Mechanisms, response biomarkers, and combinations. Sci Transl Med. 2016; 8: (328): 328rv4. DOI: https://doi. org/10.1126/scitranslmed.aad7118
7. Topalian S.L., Taube J.M., Anders R.A., Pardoll D.M. Mechanism-driven biomarkers to guide immune checkpoint blockade in cancer therapy. Nat Rev Cancer. 2016; 16 (5): 275-87. DOI: https://doi.org/10.1038/ nrc.2016.36
8. Huang A.C., Postow M.A., Orlowski R.J., Mick R., Bengsch B., Manne S., Xu W., Harmon S., Giles J.R., Wenz B., Adamow M., Kuk D., Panageas K.S., Carrera C., Wong P., Quagliarello F., Wubbenhorst B., D'Andrea K., Pauken K.E., Herati R.S., Staupe R.P., Schenkel J.M., McGettigan S., Kothari S., George S.M., Vonderheide R.H., Amaravadi R.K., Karakousis G.C., Schuchter L.M., Xu X., Nathanson K.L., Wol-chok J.D., Gangadhar T.C., Wherry E.J. T-cell invigoration to tumour burden ratio associated with anti-PD-1 response. Nature. 2017; 545 (7652): 60-5. DOI: https://doi.org/10.1038/nature22079
9. Sun Q., Hong Z., Zhang C., Wang L., Han Z., Ma D. Immune checkpoint therapy for solid tumours: clinical dilemmas and future trends. Signal Transduct Target Ther. 2023; 8 (1): 320. DOI: https://doi.org/10.1038/ s41392-023-01522-4
10. Kornepati A.V.R., Vadlamudi R.K., Curiel T.J. Programmed death ligand 1 signals in cancer cells. Nat Rev Cancer. 2022; 22 (3): 174-89. DOI: https://doi.org/10.1038/s41568-021-00431-4
11. Grinko E.K., Donetskova A.D. The main approaches for monoclonal antibodies in cancer immunotherapy. Immunologiya. 2024; 45 (3): 355-66. DOI: https://doi.org/10.33029/1816-2134-2024-45-3-355-366 (in Russian)
12. Chertkova A.I., Kadagidze Z.G., Zabotina T.N., Hulamha-nova M.M., Kushlinskiy N.E. CTLA-4, CTLA-4, PD-1/PD-L1 Negative regulators of T-cell immunity in the therapy of ovarian cancer. Oncogyne-cology. 2019; 2: 4-15. eLIBRARY ID: 39113302. (in Russian)
13. Kadagidze Z.G., Chertkova A.I. New approaches to improve efficiency antitumor immune response. Immunologiya. 2015; 36 (1): 66-70. DOI: https://doi.org/10.18027/2224-5057-2015-1-24-30 (in Russian)
14. Kushlinskii N.E., Fridman M.V., Morozov A.A., Chertkova A.I., Gershtein E.S., Kadagidze Z.G. PD-1-path: biological significance, clinical application, and existing problems. Molecular Medicine. 2019; (1): 40-2. DOI: https://doi.org/10.29296/24999490-2019-01-01 (in Russian)
15. Wolchok J.D., Rollin L., Larkin J. Nivolumab and Ipilimumab in Advanced Melanoma. N Engl J Med. 2017; 377 (25): 2503-04. DOI: https://doi.org/10.1056/NEJMc1714339
16. Wolchok J.D., Chiarion-Sileni V., Gonzalez R., Grob J.J., Rutkowski P., Lao C.D., Cowey C.L., Schadendorf D., Wagstaff J., Dummer R., Ferrucci P.F., Smylie M., Butler M.O., Hill A., Márquez-Rodas I., Haanen J.B.A.G., Guidoboni M., Maio M., Schöffski P., Carlino M.S., Lebbé C., McArthur G., Ascierto P.A., Daniels G.A., Long G.V., Bas T., Ritchings C., Larkin J., Hodi F.S. Long-Term Outcomes With Nivolumab Plus Ipilimumab or Nivolumab Alone Versus Ipilimumab in Patients With Advanced Melanoma. J Clin Oncol. 2022; 40 (2): 127-37. DOI: https://doi.org/10.1200/JCO.21.02229
17. Borgeaud M., Sandoval J., Obeid M., Banna G., Michielin O., Addeo A., Friedlaender A. Novel targets for immune-checkpoint inhibition in cancer. Cancer Treat Rev. 2023; 120: 102614. DOI: https://doi. org/10.1016/j.ctrv.2023.102614
18. Fukumoto Y., Obata Y., Ishibashi K., Tamura N., Kikuchi I., Aoyama K., Hattori Y., Tsuda K., Nakayama Y., Yamaguchi N. Cost-effective gene transfection by DNA compaction at pH 4.0 using acidified, long shelf-life polyethylenimine. Cytotechnology. 2010; 62 (1): 73-82. DOI: https://doi.org/10.1007/s10616-010-9259-z
19. Longo P.A., Kavran J.M., Kim M.S., Leahy D.J. Transient mammalian cell transfection with polyethylenimine (PEI). Methods Enzymol. 2013; 529: 227-40. DOI: https://doi.org/10.1016/B978-0-12-418687-3.00018-5
20. Krammer P.H., Arnold R., Lavrik I.N. Life and death in peripheral T cells. Nat Rev Immunol. 2007; 7 (7): 532-42. DOI: https://doi. org/10.1038/nri2115
21. D'Cruz L.M., Rubinstein M.P., Goldrath A.W. Surviving the crash: transitioning from effector to memory CD8+ T cell. Semin Immunol. 2009; 21 (2): 92-8. DOI: https://doi.org/10.1016/j.smim.2009.02.002
22. McKinstry K.K., Strutt T.M., Swain S.L. Regulation of CD4+ T-cell contraction during pathogen challenge. Immunol Rev. 2010; 236: 110-24. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1600-065X.2010.00921.x
23. Qin S., Xu L., Yi M., Yu S., Wu K., Luo S. Novel immune checkpoint targets: moving beyond PD-1 and CTLA-4. Mol Cancer. 2019; 18 (1): 155. DOI: https://doi.org/10.1186/s12943-019-1091-2
Сведения об авторах
Васильева Татьяна Викторовна - лаборант лаб. активации иммунитета отд. иммунной биотехнологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected]
Authors' information
Tatiana V. Vasileva - Graduate Student, Master Degree, Immunity Activation Lab., Immune Biotechnology Dept., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected]
Иванов Сергей Валерьевич - инженер-исследователь группы экспрессии белковых факторов роста и диф-ференцировки ФГБУН ИБХ им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Минобрнауки России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-1802-6351
Ушакова Екатерина Игоревна - мл. науч. сотр. лаб. активации иммунитета отд. иммунной биотехнологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-2143-1021
Аль Худур Сара Абдулхуссейн - аспирант лаб. активации иммунитета отд. иммунной биотехнологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected]
Лебедева Екатерина Семеновна - канд. биол. наук, ст. науч. сотр. лаб. активации иммунитета отд. иммунной биотехнологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-0384-9299
Пичугин Алексей Васильевич - канд. физ.-мат. наук, вед. науч. сотр. лаб. активации иммунитета отд. иммунной биотехнологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0001-5356-3331
Атауллаханов Равшан Иноятович - д-р мед. наук, проф., рук. отд. иммунной биотехнологии, зав. лаб. активации иммунитета ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-4767-6409
Sergey V. Ivanov - Engineer-Researcher of the Protein Growth and Differentiation Factors Expression Group, M.M. Shemyakin and Yu.A. Ovchinnikov IBCH RAS, MSHE of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-1802-6351
Ekaterina I. Ushakova - Junior Researcher of Immunity Activation Lab., Immune Biotechnology Dept., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation
E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-2143-1021
Sarah A. Al Khudhur - PhD Student, Immunity Activation Lab., Immune Biotechnology Dept., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation
E-mail: [email protected]
Ekaterina S. Lebedeva - PhD, Senior Researcher of Immunity Activation Lab., Immune Biotechnology Dept., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation
E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-0384-9299
Alexey V. Pichugin - PhD, Leader Researcher of Immunity Activation Lab., Immune Biotechnology Dept., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0001-5356-3331
Ravshan I. Ataullakhanov - MD, PhD, Prof., Head of Immune Biotechnology Dept., Head of Immunity Activation Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-4767-6409
