CC BY
18
И.И. Ким, О.В. Повещенко, В.И. Коненков, Е.А. Покушалов*, А.Б. Романов*, Н.А. Бондаренко, А.Ф. Повещенко, Д.С. Сергеевичев*, А.М. Караськов*
Эффективность мобилизации 0034+ прогениторных клеток препаратом G-CSF в зависимости от ишемического анамнеза и возраста больных с хронической сердечной недостаточностью
Научно-исследовательский
институт клинической
и экспериментальной
лимфологии СО РАМН,
Новосибирск, 630060,
ул. Тимакова, 2,
* ФГБУ «ННИИПК
им. акад. Е.Н. Мешалкина»
Минздравсоцразвития
России, 630055,
Новосибирск,
ул. Речкуновская, 15,
УДК 612.42:612.017.1 ВАК 14.01.05
© И.И. Ким, О.В. Повещенко, В.И. Коненков, Е.А. Покушалов, А.Б. Романов, Н.А. Бондаренко, А.Ф. Повещенко, Д.С. Сергеевичев, А.М. Караськов, 2012
Показано, что введение препарата G-CSF (Granulocyte Colony Stimulating Factor, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор) пациентам с хронической сердечной недостаточностью оказывает гемостимулирующее воздействие, увеличивая количество лейкоцитов и нейтрофилов в периферической крови. G-CSF приводит к мобилизации прогениторных клеток из костного мозга в периферическую кровь. На количество CD34+-клеток после мобилизации влияют их базальное содержание, количество инфарктов и длительность после последнего перенесенного инфаркта. Ключевые слова: прогениторные клетки; ишемическая болезнь сердца; G-CSF-мобилизация.
Ведущая роль в структуре смертности от сердечно-сосудистых заболеваний принадлежит ишемической болезни сердца (ИБС) - 35% [1]. Несмотря на эффективность современных методов лечения, по-прежнему существует необходимость в разработке принципиально новых подходов к лечению ИБС и инфаркта миокарда (ИМ) как одной из наиболее грозных ее форм. В связи с этим в последние два десятилетия развивается новый подход восстановительной терапии ИБС - клеточная терапия стволовыми/прогениторными клетками (ПК) [6]. Ранее было показано, что трансплантация клеток костного мозга (КМ) улучшает перфузию миокарда и систолическую функцию у пациентов с ИБС, но инвазивность забора КМ ограничивает его клиническое применение [3, 9, 14, 15, 17]. Мобилизация ПК из костного мозга в периферическое русло путем применения препарата грану-лоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF) является альтернативой забору клеток КМ и менее инвазивным подходом, который используется в экспериментальных работах и клинических исследованиях [9].
В гематологической практике действие G-CSF как мобилизующего агента стволовых клеток в периферическую кровь хорошо изучено, при этом CD34+ используется как маркер эффективности мобили-
зации. Также большинство работ по трансплантации ПК пациентам с ИМ для оценки эффективности мобилизации используют маркер CD34+. Ранее была показана безопасность и эффективность введения G-CSF как у здоровых доноров, так и пациентов с ИБС [9]. Цель исследования - определение влияния возраста, длительности заболевания и количества перенесенных ИМ на эффект мобилизации G-CSF у больных ИБС.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
В исследование включены 38 больных (89% из них мужчины) ИБС с III-IV функциональным классом хронической сердечной недостаточности (ХСН) (NYHA). Средний возраст пациентов 57,0±7,7 лет. Длительность ИБС составила 8,04±5,84 лет, количество ИМ - 1,5±0,8. Письменное информированное согласие получено от всех пациентов. Протокол исследования одобрен локальными этическими комитетами, утвержден учеными советами обоих учреждений-соисполнителей. Пациенты находились на лечении в ННИИПК им. акад. Е.Н. Мешалкина.
Введение рекомбинантного человеческого G-CSF (грасальва - «TEVA Pharmaceutical Industries Ltd», Израиль) осуществлялось путем подкожных инъекций в дозе 3,35,0 мкг/кг веса в течение 5 суток. До моби-
Динамика количества лейкоцитов и нейтрофилов в процессе мобилизации G-CSF.
30 20 10 0
2
Сутки Лейкоциты
4 5
Нейтрофилы
3
лизации (0 сутки) и после окончания инъекций G-CSF на 6-е сутки забиралась кровь из локтевой вены. Выделение фракции мононуклеарных клеток осуществлялось на градиенте плотности фиколла-верографина (р = 1,078 г/л). Фенотипирование мононуклеарных клеток проводили с помощью проточного цитометра FACS CantoII («Becton Dickinson», США) в программе FACS Diva («Becton Dickinson», США). Для поверхностного маркирования использовали моноклональные антитела к CD34+, CD45, меченные флюоресцеином изотиоциана-том (FITC), фикоэритрином (PE), в количестве, рекомендуемом производителем («Becton Dickinson», США).
Статистическая обработка полученных результатов проводилась методами описательной и непараметрической статистики с использованием программы Statistica 6.0. Для описательной статистики использовались медиана, 25 и 75 квартили. Для оценки достоверности различий использовался непараметрический критерий Манна - Уитни, степень взаимозависимости исследуемых параметров оценивалась с помощью показателя ранговой корреляции Спирмена.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Биологические эффекты G-CSF опосредуются его взаимодействием с рецептором, который экспрессируется на клеточной поверхности нейтрофилов, индуцируя их экспансию в КМ, синтез протеаз, что приводит к деградации и инактивации адгезии и хемотаксиса между гемо-поэтическими стволовыми клетками и КМ и выходу ПК в периферическое русло крови. Показано, что введение G-CSF здоровым донорам приводит к эффективной экспансии нейтрофилов и увеличению количества лейкоцитов в периферической крови [2]. В проводимом нами исследовании введение G-CSF пациентам с тяжелой ХСН также приводит к лейкоцитозу и гранулоцитозу. Количество лейкоцитов в периферической крови возрастает в 4,9 раз с 6,39±1,2 х 109/л до 31,25±6,0 х 109/л к 5-м суткам (рисунок). Повышение количества лейкоцитов сопровождается повышением процентного и абсолютного числа нейтрофилов в 6,8 раз (рисунок). Повышение
количества нейтрофилов прямо коррелирует с повышением количества лейкоцитов (ге = 0,987, р = 0,004).
Для оценки эффекта мобилизации ПК в периферическое русло использовался маркер гемопоэтических стволовых клеток СD34+. Подсчет CD34+-клеток проводился в мононуклеарной фракции клеток путем ограничения событий с учетом экспрессии панлейкоцитарного маркера CD45. Показано, что у пациентов с ХСН базаль-ное количество циркулирующих CD34+-клеток составляет 0,01% (медиана). После введения G-CSF на 6-е сутки число CD34+ возрастает до 0,42% (медиана) (табл. 1). Кратность увеличения количества CD34+-клеток в среднем составляет 20,7±16,8 раз. Причем у тех пациентов (11 %), у которых изначально до мобилизации был высокий уровень CD34+-клеток (выше 0,2%), прирост CD34+-кле-ток был незначительным (2,7±1,1 раз). Эти данные согласуются с данными литературы как по количеству, так и приросту CD34+-клеток у больных с сердечно-сосудистой патологией [10]. У здоровых же людей количество CD34+-клеток после мобилизации достигает более высоких значений (до 1 %) [7]. Вместе с тем нами не было выявлено достоверных связей между увеличением числа лейкоцитов и нейтрофилов и количеством CD34+-клеток.
Известно, что с возрастом и при различных хронических, в том числе сердечно-сосудистых, заболеваниях уменьшается как количество, так функциональные свойства ПК [4, 8]. Включенные в наше исследование пациенты не только принадлежат к старшей возрастной группе и имеют длительный ишемический анамнез, но и перенесли от 1 до 5 инфарктов, характеризуются тяжелой прогрессирующей СН. Мы провели анализ связи количества CD34+-клеток как в нестимулированных условиях, так и при воздействии G-CSF после мобилизации с возрастом пациентов. Показано, что отсутствуют достоверные взаимосвязи между этими показателями (табл. 2). В то же время имеются достоверная обратная корреляционная связь между количеством CD34+-клеток после мобилизации G-CSF и количеством перенесенных ИМ и достоверная положительная корреляционная связь с длительностью от последнего инфаркта до момента введе-
Патология кровообращения и кардиохирургия 1. 2012
77
Таблица 1 Экспрессия маркера, Кол-во СD34+-клеток Кратность
Количество
CD34+-клеток до и после мобилизации G-CSF
% позитивных клеток 0 сутки 6-е сутки увеличения
0,42 (0,25-0,64)
СD34+ 0,01 (0,01-0,067) 22,5 (4,96-340,1)
р = 0,0001*
Таблица 2
Корреляция содержания СD34+-клеток, *р - достоверность различий по Спирмену
Показатели
Кол-во СD34+-клеток 0 сутки
6-е сутки
Возраст ГБ = 0,28 р = 0,10 ГБ = 0,13 р = 0,44
Кол-во инфарктов ГБ = -0,19 р = 0,25 ГБ = -0,46 р = 0,05*
Длительность от последнего инфаркта до введения клеток ГБ = 0,26 Р = 0,12 гб = 0,53 р = 0,001*
Таблица 3 Показатели Кол-во СD34+-клеток
Количество
СD34+-клеток до и после мобилизации, * р = 0,001 достоверность различий между подгруппами
0 сутки 6-е сутки
Возраст, лет 48,5 (45-49) 0,03 (0,02-0,05) 0,66 (0,28-1,03)
58 (55-64) 0,01 (0,01-0,07) 0,42 (0,22-0,56)
1 0,03 (0,01-0,08) 0,66 (0,27-1,03)
Кол-во инфарктов
2 (2-3) 0,01 (0,01-0,02) 0,42 (0,11-0,56)
Длительность от послед-
2 (1-3,5) 0,01 (0,01-0,55) 0,36 (0,21-0,55)*
него инфаркта до вве-
Н 12 (11-13) 0,03 (0,01-0,07) 1,04 (0,55-1,51)
дения клеток, лет
ния клеток. Таким образом, у пациентов с одним инфарктом в анамнезе количество прогениторных CD34+-клеток после введения G-CSF было максимальным, что позволяет прогнозировать лучший эффект мобилизации у таких больных с хронической ишемией миокарда.
Выявив определенные закономерности зависимости клинических показателей и количества СD34+-кле-ток, в последующем мы разделили пациентов на подгруппы в зависимости от возраста (старше и младше 50 лет), количества инфарктов (больше и равно 1) и длительности от последнего инфаркта (больше и меньше 10 лет). При разделении пациентов на подгруппы в зависимости от возраста была выявлена тенденция к увеличению как базального количества СD34+-клеток, так и их количества после мобилизации с уменьшением возраста пациентов, т. е. чем моложе пациенты, тем, вероятно, больше выход клеток предшественников в периферическую кровь, тем эффективнее мобилизация. Аналогичную тенденцию показало влияние количества инфарктов (табл. 3). В то же время было показано, что чем больше прошло времени от последнего инфаркта, тем больше СD34+-клеток как до введения G-CSF (тенденция), так и после мобилизации на 6-е сутки (р = 0,001). Этот эффект подтвердила и положительная корреляционная связь между длительностью от последнего инфаркта более 10 лет и количеством СD34+-клеток после мобилизации на 6-е сутки (гб = 0,77, р = 0,015) (табл. 3).
ОБСУЖДЕНИЕ
В многочисленных экспериментальных и клинических исследованиях было показано, что трансплантация мобилизированных G-CSF стволовых/прогенитор-ных клеток улучшает функцию сердца как при острой, так и при хронической СН [3, 16, 18]. Исследования эффективности мобилизации G-CSF у здоровых доноров показали, что количество CD34+-клеток после мобилизации достигает более высоких значений (до 1%) [7], чем у больных с сердечно-сосудистой патологией [10]. При этом было обнаружено, что на эффективность мобилизации действуют базальное содержание CD34+-кле-ток и возраст донора, но не оказывают значительного влияния ни пол, ни вес донора, ни доза препарата [5].
В нашем исследовании мы изучали воздействие на мобилизацию стволовых/прогениторных клеток таких факторов, как базальное содержание CD34+-клеток, возраст, количество ИМ и длительность заболевания у пациентов с тяжелой ишемической болезнью сердца, у которых прямая реваскуляризация миокарда неэффективна, с Ш-1У ФК ХСН. Показано, что у здоровых доноров высокое базальное содержание СD34+-клеток и молодой возраст являются хорошими прогностическими признаками эффективности мобилизации. При этом чем больше базальный уровень СD34+-клеток и чем моложе доноры, тем эффективнее мобилизация [5, 13].
В нашем исследовании мы также показали в общей группе пациентов связь между базальным уровнем СD34+-кле-ток и их количеством после мобилизации. Вместе с этим при разделении пациентов на подгруппы в зависимости от базального уровня СD34+-клеток больше и меньше
0.2. было показано, что кратность увеличения клеток, т. е. эффективность мобилизации, больше у тех пациентов, у которых базальный уровень был меньше 0,2%. Это может быть связано с истощением пула стволовых/ прогениторный клеток в КМ и избыточным спонтанным их выходом в периферическое русло до мобилизации в интактных условиях. В то же время нами не выявлено достоверных связей количества мобилизованных СD34+-клеток с возрастом пациентов ни в общей группе, ни в подгруппах старше и младше 50 лет. Хотя была обнаружена тенденция к увеличению как базального количества СD34+-клеток, так и их количества после мобилизации с уменьшением возраста пациентов (младше 50 лет).
Изучение влияния количества перенесенных ИМ на эффект мобилизации показало достоверную обратную корреляционную связь. Кроме того, также в подгруппах пациентов была выявлена тенденция к увеличению как базального количества СD34+-клеток, так и их количества после мобилизации с уменьшением количества инфарктов (<1). Ранее зарубежными учеными было показано, что при ИМ происходит спонтанная мобилизация клеток КМ, в частности СD34+-клеток [11, 12]. Вследствие этого можно предположить, что с каждым последующим ИМ происходит истощение пула стволовых/прогени-торный клеток в КМ и уменьшение мобилизации в периферический кровоток. Вместе с этим нами была выявлена достоверная положительная корреляционная связь между длительностью от последнего ИМ и количеством СD34+-клеток после мобилизации G-CSF. Таким образом, чем больше времени прошло от последнего инфаркта, тем больше СD34+-клеток мобилизуются в периферическое русло, что, вероятно, связано с восстановлением пула стволовых/прогениторных клеток в костном мозге.
В результате нашего исследования было показано, что более молодой возраст пациента, меньшее количество ИМ, большая длительность после последнего перенесенного ИМ и базальный уровень СD34+-клеток могут служить хорошими прогностическими факторами эффективной мобилизации стволовых/прогениторных клеток в периферическое русло при ишемической болезни сердца III-IV ФК ХСН (NYHA). Несмотря на меньшую эффективность мобилизации ПК у больных ИБС по сравнению со здоровыми донорами, количество выделяемых СD34+-кле-ток видится достаточным для дальнейшего интрамио-кардиального введения и репарации сердечной ткани у больных с хронической сердечной недостаточностью.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Воробьев А.И. // Современные мед. технологии. 2010. С. 32-37.
2. Anderlini P., Champlin R. // Blood. 2008. V. 111. P. 1767-1772.
3. Assmus B. et al. // Circulation. 2002. V. 106. P. 3009-3017.
4. Capobianco S. et al. // World J. Cardiol. 2010. V. 26. P. 411-420.
5. De la Rubia J. et al. // Heamatologica 2004. V. 89. P. 1530-1532.
6. Herrmann J. et al. // Ann. Thorac. Surg. 2009. V. 88. P. 1714-1722.
7. Erbs S., Linke A., Adams V. et al. // Circ. Res. 2005. V. 97. P. 756-762.
8. Gascon P., Fuhr U. et al. // Ann. Onc. 2010. V. 21. P. 1419-1429.
9. Hyun-Jae Kang et al. // Lancet. 2004. V. 363, Issue 9411. P. 751-756.
10. Imamura R. et al. // J. Immunology. 2005. V. 175. P. 2647-2654.
11. Kondo T., Shintani S. et al. // Heart Asia. 2010. V. 2. P. 20-23.
12. Leone A. et al. // Eur. Heart J. 2005. V. 26. P. 1196-1204.
13. Mogili S., Chen R., Beccker M. et al. // Blood. 2010. Р. 116.
14. Perin E. et al. // Circulation. 2003. V. 107. P. 2294-2302.
15. Strauer B. et al. // Circulation. 2002. V. 106. P. 1913-1918.
16. Suzuki S. et al. // Circulation. 2004. V. 110. P. 1387-1391.
17. Tse H., Kwong Y., Chan J. et al. // Lancet. 2003. V. 361. P. 47-49.
18. Wojakowski W. et al. // Eur. Heart J. 2006. V. 27. P. 283-289.
Ким Ирина Иннокентьевна - научный сотрудник лаборатории лимфотропной терапии и лимфодиагностики НИИ клинической и экспериментальной лимфологии СО РАМН (Новосибирск).
Повещенко Ольга Владимировна - кандидат медицинских наук, заведующая лабораторией лимфотропной терапии и лимфодиагностики НИИ клинической и экспериментальной лимфологии СО РАМН (Новосибирск).
Коненков Владимир Иосифович - доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН, директор НИИ клинической и экспериментальной лимфологии СО РАМН (Новосибирск).
Покушалов Евгений Анатольевич - доктор медицинских наук, заместитель директора по научно-экспериментальной работе, руководитель центра хирургической аритмологии ФГБУ «ННИИПК им. акад. Е.Н. Мешалкина» Минздравсоцразвития России (Новосибирск).
Романов Александр Борисович - кандидат медицинских наук, хирург кардиохирургического отделения нарушений ритма сердца ФГБУ «ННИИПК им. акад. Е.Н. Мешалкина» Минздравсоцразвития России (Новосибирск).
Бондаренко Наталья Анатольевна - аспирант лаборатории лимфотропной терапии и лимфодиагностики НИИ клинической и экспериментальной лимфологии СО РАМН (Новосибирск).
Повещенко Александр Федорович - доктор медицинских наук, заведующий лабораторией физиологии протективной системы НИИ клинической и экспериментальной лимфологии СО РАМН (Новосибирск).
Сергеевичев Давид Сергеевич - кандидат биологических наук, заведующий лабораторией экспериментальной хирургии и морфологии ФГБУ «ННИИПК им. акад. Е.Н. Мешалкина» Минздравсоцразвития России (Новосибирск).
Караськов Александр Михайлович - доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН, Заслуженный деятель науки РФ, директор ФГБУ «ННИИПК им. акад. Е.Н. Мешалкина» Минздравсоцразвития России (Новосибирск).
