CC BY
37
Патология кровообращения и кардиохирургия (2015) Т. 19, № 1, С. 90-94
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Фундаментальные исследования
Влияние длительной криоконсервации на количество и функциональную активность стволовых/прогениторных клеток, полученных мобилизацией Г-КСФ от больных хронической сердечной недостаточностью
Н.А. Бондаренко1, 2 , А.П. Лыков1, 2, И.И. Ким1, 2, О.В. Повещенко1, 2, А.Ф. Повещенко1, 2, Е.А. Покушалов2, А.Б. Романов2, А.М. Караськов2, В.И. Коненков1, 2
1 ФГБУ «НИИКЭЛ», Новосибирск, Российская Федерация;
2 ФГБУ «ННИИПК им. акад. Е.Н. Мешалкина» Минздрава России, Новосибирск, Российская Федерация
УДК 616.1:616-005.8:616.419:57.042.2. ВАК 14.01.05
Поступила в редколлегию 15 июля 2014 г.
Изучение влияния криоконсервации костно-мозговых стволовых/прогениторных клеток в жидком азоте через 2 и 4 года на их количество и функциональные свойства.
Показано, что длительное криоконсервирование в течение 2 и 4 лет приводит к уменьшению количества и жизнеспособности мононуклеарных клеток, мобилизованных гранулоцитарным колониестимулирующим фактором (Г-КСФ) от пациентов с хронической сердечной недостаточностью. Кроме того, при длительной криоконсервации отмечено снижение содержания количества эндотелиальных прогениторных клеток среди мононуклеарных клеток от пациентов с хронической сердечной недостаточностью.
Результаты Установлено, что криоконсервация в течение 2 и 4 лет приводит к уменьшению пролиферативной актив-
ности мононуклеарных клеток, мобилизованных Г-КСФ, как спонтанной, так и стимулированной митоге-ном и увеличению количества клеток, находящихся в стадии апоптоза. Полученные данные свидетельствуют о негативном влиянии длительного криконсервирования на мононуклеарные клетки, полученные после мобилизации Г-КСФ, и для эффективной клеточной терапии пациентов с хронической сердечной недостаточностью необходимо использовать клетки, находящиеся в криоконсервации не более 2 лет.
Ключевые слова Криоконсервация • Мононуклеарные клетки • Эндотелиальные прогениторные клетки • Хроническая сердечная недостаточность
Материал и методы
Костно-мозговые стволовые/прогениторные клетки (СПК), в том числе и эндотелиальные прогениторные клетки (ЭПК), широко используются для восстановительной терапии у больных с гематологическими заболеваниями, при дегенеративных процессах, включая заболевания сердечно-сосудистой системы [1-3]. Поэтому возникает проблема сохранности СПК для последующего их использования в отдаленном периоде, которая на современном этапе решается путем криоконсервации клеток в жидком азоте [2]. Так как в замораживающую среду входит диметилсульфоксид (ДМСО), который в ходе размораживания способен вызы-
вать повреждения в клетках, то необходимо исследовать жизнеспособность и функциональную активность сохранявшихся в жидком азоте клеток [4-7]. Однако недостаточно исследовано, как влияет длительное замораживание на СПК, полученные после мобилизации их гранулоцитарным колониестимулирующим фактором от больных хронической сердечной недостаточностью (ХСН). Целью нашей работы стало изучение влияния криоконсервации СПК в жидком азоте через 2 и 4 года на их количество и функциональные свойства.
Для корреспонденции: Бондаренко Наталья Анатольевна, Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной лимфологии», 630060, Новосибирск, ул. Тимакова, 2. Email: [email protected]; тел.: +7 (383) 347-60-46
Материал и методы
Действие длительной криоконсервации в жидком азоте на функциональные свойства СПК/ЭПК изучено среди яд-росодержащих клеток от 20 больных ишемической болезнью сердца с ХСН III-IV функционального класса по NYHA в возрасте 37-76 лет, длительностью заболевания 1-22 года и количеством инфарктов миокарда в анамнезе 1-4, с фракцией выброса левого желудочка <35% и давностью перенесенного инфаркта не менее 12 месяцев, находившихся на лечении в ФГБУ «ННИИПК им. акад. Е.Н. Мешалкина» Минздрава России; от больных получено письменное информированное согласие. Протокол исследования одобрен местными этическими комитетами, утвержден учеными советами обоих учреждений соисполнителей. Введение Г-КСФ проводилось с целью мобилизации СПк из костного мозга в периферическую кровь для последующего интрамиокар-диального введения клеток пациентам. Мобилизацию СПК/ ЭПк в периферическую кровь осуществляли введением ре-комбинантного человеческого Г-КСФ (Грасальва, Израиль; 3,3-5,0 мкг/(кг ■ сут) подкожно в течение 5 суток). Процедура аппаратного цитофереза проводилась на сепараторе клеток крови «Haemonetics MCS+» с использованием сета REF 971 E (Haemonetics Corporation, США) на 6-е сутки. В программе PBSC (получение периферических стволовых клеток) устанавливались параметры циркуляции и рециркуляции: recirculation № 2 и recirc ratio - 1:3. Процедуру обогащения СПК/ЭПК из цитоферезного продукта осуществляли центрифугированием на градиенте плотности фиколла-верографи-на (р = 1,078 г/л). Фенотипирование обогащенной СПК/ЭПК фракции мононуклеаров проводили на проточном цитометре «FACSCanto II» (BD, США) с использованием коммерческих моноклональных антител CD34, CD45, CD133 и VEGFR2 (BD, США), меченных флуоресцеином изотиоцианатом - FITC, фикоэритрином - PE, аллофикоцианином - APC. Часть клеток подготавливали для криоконсервации в жидком азоте в среде, содержащей 90% фетальной телячьей сыворотки и 10% ДМСО. Заморозку клеток осуществляли понижением температуры на 1 градус в минуту в холодильнике до -70 °С, далее клетки переносили в сосуд Дьюара с жидким азотом, раз в неделю пополняли уровень жидкого азота. Через 2 и 4 года хранения клетки подвергались размораживанию при 37 °С на водяной бане, после чего дважды отмывались от криокон-сервирующей жидкости забуференным физиологическим раствором при 1 500 об./мин в течение 5 мин. Клетки ресус-пендировали в 1 мл среды RPMI-1640, далее оценивали выход клеток и жизнеспособность (красителем трипановым синим).
Пролиферацию клеток исследовали через 72 ч инкубации в круглодонных 96-луночных планшетах в среде RPMI-1640 с 10% FCS (фетальная телячья сыворотка; Биолот, Россия), дополненной 0,3 мг/мл L-глютамина (Биолот, Санкт-Петер-
бург), 160 мкг/мл гентамицин сульфата (Дальхимфарм, Россия), при 37 °С в С02-инкубаторе. Уровень пролиферативной активности СПК/ЭПК определяли в МТТ-тесте в триплетах (2 х 105 клеток/лунка) в спонтанном и стимулированном тестах в присутствии 15 мкг/мл Конканавалина А (Кон А, Sigma, США) по включению клетками 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолиум бромида (Sigma, США) и преобразования его в формазан митохондриальными дегид-рогеназами на спектрофотометре (Stat Fax 2100, США), которые выражали в условных единицах оптической плотности (ед. опт. пл.).
Клеточный цикл мононуклеарных клеток оценивали методом проточной цитофлюориметрии с помощью окрашивания клеток пропидиум иодидом (BD, США) согласно инструкции производителя. Анализ клеточного цикла проводился по оценке гистограмм ДНК. Относительное содержание клеток с диплоидным (клетки в G0G1 фазах - 2N) и гиперплоидным (клетки в S, M фазах - 2N-4N) набором хромосом определяли в гейте CD34+ клеток. Апоптотические клетки, ДНК которых подвергалась фрагментации, формировали характерный гиподиплоидный пик (клетки в subG0G1 фазах - <2N).
Статистический анализ полученных данных проводили с использованием программы Statistica 6.0 for Windows (StatSoft, США). Полученные сведения проверяли на нормальность распределения согласно критериям Колмогорова -Смирнова, меры центральной тенденции и рассеяния описаны медианой (Me), нижним (LQ) и верхним (HQ) квартилями. Достоверность различий оценивали по критерию Манна - Уитни, различия считали статистически значимым при p <0,05.
Результаты
До процедуры криоконсервации мононуклеарных клеток, полученных в ходе проведения процедуры мобилизации Г-КСФ от больных ХСН, удавалось получить 85 х 106 клеток/ мл ядросодержащих клеток с жизнеспособностью 95,097,0% из цитоферезного продукта. Через 2 года хранения мононуклеарных клеток в жидком азоте отмечено статистически значимое снижение как общего количества ядросодержащих клеток на 34%, что составило 52 х 106 клеток/мл, так и жизнеспособности до 70% по сравнению с исходными уровнями (p <0,05). Через 4 года хранения клеток в жидком азоте отмечается статистически значимое уменьшение общего количества ядросодержащих клеток до 48 х 106 клеток/мл по сравнению с исходным количеством клеток и спустя 2 года хранения в жидком азоте (p <0,05). Кроме этого, статистически значимо снижается и жизнеспособность мононуклеарных клеток - до 60% по сравнению с исходными значениями и спустя 2 года хранения клеток в жидком азоте (p <0,05).
Таблица 1 Динамика изменения абсолютного количества популяций стволовых/прогениторных клеток от больных ХСН при криоконсервации в жидком азоте (Me; Lq-Hq; 106клеток/мл)
Фенотип клеток До криоконсервации 2 года 4 года
CD34+ 1,05 (0,50-2,13) 0,45 (0,23-0,77)* 0,04 (0,01-0,08)*#
CD34+/CXCR4+ 0,64 (0,60-1,22) 0,38 (0,16-0,64)* 0,04 (0,01-0,04)*#
CD34+/133+ 0,16 (0,07-0,42) 0,04 (0,02-0,04)* 0,01 (0,003-0,02)*
CD34+/VEGFR2+ 0,20 (0,16-0,57) 0,11 (0,06-0,2) 0,01 (0,009-0,01)*#
CD34+/31 + 0,07 (0,06-0,20) 0,09 (0,06-0,10) 0,008 (0,007-0,01)*#
* достоверность различия по сравнению со значениями до криоконсервации p <0,05; # через 2 и 4 года криоконсервации p <0,05
Таблица 2 Влияние криоконсервации на фазы клеточного цикла стволовых/прогениторных клеток у больных ХСН (Me; Lq-Hq, %)
Фазы клеточного цикла До криоконсервации Через 4 года
subG0G1 2,50 (1,60-3,61) 24,85 (20,3-39)*
G0G1 89,8 (82,6-92,30) 45,85 (33,9-42,9)*
M + S 8,68 (6,55-15,20) 24,85 (21,50-26,50)*
* p <0,05
Таким образом, нами показано, что длительное хранение мононуклеарных клеток, полученных в ходе мобилизации Г-КСФ от больных с ХСН, в жидком азоте приводит к статистически значимому уменьшению количества жизнеспособных клеток.
Следующим этапом работы стало изучение влияния длительной криоконсервации на субпопуляционный состав СПК/ЭПК от больных с ХСН. Как видно из табл. 1, выявлено статистически значимое снижение количества клеток с фенотипом CD34+ спустя 2 и 4 года хранения в жидком азоте. Также показано статистически значимое снижение ЭПК с фенотипами CD34+/133+, CD34+/31+, CD34+/VEGFR2+ в различные сроки хранения их в жидком азоте. Кроме этого, отмечено статистически значимое снижение количества ЭПК, экспрессирующих на клеточной мембране рецептор CXCR4 к стромальному фактору (SDF-1), который регулирует мобилизацию и миграцию прогениторных клеток в периферическое русло, к месту повреждения эндотелиальной выстилки сосудов или в место ишемии тканей.
Следовательно, длительное хранение клеток в жидком азоте ведет к снижению количества не только СПК, экспрессирующих общий маркер принадлежности к гемопоэтичес-ким и эндотелиальным клеткам CD34, но и ЭПК, находящихся на разных стадиях дифференцировки в эндотелиальном направлении, и ведет к снижению количества ЭПК, обеспечивающих хоуминг данных клеток к месту ишемии тканей или повреждения стенки сосудов.
Кроме жизнеспособности и количества ядросодержащих клеток имеет важное значение сохранение функциональной активности СПК (пролиферация, дифференцировка, миграция и др.) после длительной криоконсервации. Одним из показа-
телей функциональной активности СПК/ЭПК является их нахождение в фазах клеточного цикла, косвенно указывающих на функциональные процессы, происходящие в клетках. Как видно из табл. 2, после размораживания СПК/ЭПК отмечено статистически значимое увеличение пула клеток в фазе апоп-тоза, уменьшение клеток в стадии интерфазы и увеличение количества клеток, находящихся в стадии синтеза и митоза.
Кроме этого, нами показано статистически значимое снижение пролиферативной активности мононуклеарных клеток, обогащенных СПК/ЭПК, после криоконсервации (табл. 3). Так, выявлено статистически значимое снижение спонтанного уровня пролиферации спустя 2 и 4 года крио-консервации мононуклеарных клеток, обогащенных СПК/ ЭПК, в жидком азоте. В ответ на митогенный стимул Конка-навалином А (кон А) мононуклеарные клетки после криокон-сервации также статистически значимо снижали пролифера-тивный ответ по сравнению с исходными значениями.
Таким образом, криоконсервация мононуклеарных клеток, обогащенных СПК/ЭПК после мобилизации Г-КСФ от больных с ХСН, приводит к снижению их пролиферативной активности.
Обсуждение
Многие авторы указывают на возможность длительной сохранности СПК костного мозга и пуповинной крови для последующего терапевтического использования [8—11]. Установлено, что спустя длительные сроки пребывания СПК в криоконсервации при их разморозке и введении в организм больных удается достичь положительного клинического эффекта, восстановления функционирования кроветворения в
Таблица 3 Показатели пролиферативного потенциала стволовых/прогениторных клеток у больных ХСН при криоконсервации (Me; Lq-Hq; ед. опт. пл.)
Пролиферация До криоконсервации Через 2 года Через 4 года
Спонтанная 0,53 (0,43-0,59) 0,39 (0,36-0,46)* 0,29 (0,24-0,36)*
Кон А - стимулированная 0,68 (0,56-0,79) 0,45 (0,40-0,48)* 0,29 (0,28-0,31)*
* достоверность различия по сравнению с исходными значениями p <0,05
силу сохранения достаточного количества функционально активных стволовых гемопоэтических клеток, способных к пролиферации и дифференцировке в различные ростки кроветворения. Однако на выживаемость ядросодержащих клеток при криоконсервации существенное влияние оказывает наличие в консервирующей среде для замораживания сыворотки и ДМСО [12].
Так, нами установлено, что длительная криоконсервация в течение 2 и 4 лет в сыворотке с 10% содержанием ДМСО приводит к снижению количества и жизнеспособности ядросодержащих клеток, полученных в ходе мобилизации Г-КСФ от пациентов с хронической сердечной недостаточностью.
Многие авторы связывают снижение жизнеспособности ядросодержащих клеток с тем, что при выделении мононук-леарных клеток на градиенте плотности фиколла происходит асимметричное распределение липидов в мембране клеток, что способствует увеличению гибели клеток при последующей разморозке [12]. О токсичности ДМСО свидетельствуют исследования авторов, установивших, что при меньшем проценте введения ДМСО в среду для криоконсервации выявляется увеличение выживаемости клеток [13].
Более того, авторы показали, что токсический эффект сыворотки можно избежать используя специальные безсывро-точные среды для криоконсервации стволовых гемопоэтических клеток, что способствует увеличению пролиферации, дифференцировке и жизнеспособности клеток [6].
Кроме снижения выхода и жизнеспособности клеток после длительной криоконсервации ряд авторов также отмечают нарушения в субпопуляционном составе и функциональных свойствах СПК/ЭПК [2, 8 ,9]. Нами установлено снижение количества СПК/ЭПК, экспрессирующих маркер принадлежности к эндотелиальным клеткам CD34, ранних и поздних ЭПК, а также уменьшение количества клеток, экспрессирующих рецептор хоуминга, от пациентов с ХСН после длительной криоконсервации.
Так, в работе авторов показано, что в пуповинной крови спустя 23,5 года хранения в условиях заморозки снижается выход ядросодержащих клеток, экспрессирующих маркер CD34 [8]. L. Huang и соавт. также отмечали снижение количества клеток, экспрессирующих маркер CD34 среди ядросодержащих клеток пуповинной крови спустя 10 лет нахождения клеток в заморозке, что существенно не оказывало
влияния на восстановление количества нейтрофилов и тромбоцитов после пересадки СПК пациентам [9]. Полученные данные подтверждает работа других авторов [2], в которой также показано, что спустя 5-14 лет нахождения клеток в криоконсервации наблюдается снижение количества CD34+ клеток, при этом их было достаточно для пересадки пациентам. Кроме того, выявлено, что криоконсервация пупо-винной крови негативно влияет на получение ЭПК из CD34+ клеток при дальнейшем их культивировании на фибронек-тине in vitro [5]. В то же время из свежевыделенных клеток пуповины удавалось вырастить ЭПК. Исследования показали, что спустя 7 лет хранения в жидком азоте из лейкоцитов периферической крови доноров удавалось выделить меньшее количество жизнеспособных клеток, экспрессирующих маркер CD3 [7].
С другой стороны ряд авторов отмечает отсутствие негативного эффекта длительной криоконсервации стволовых клеток [9-11, 14, 15]. Отмечено, что до 10 лет нахождения СПК в жидком азоте практически не установлено негативного влияния на выход жизнеспособных СПК/ЭПК и мезенхи-мальных стромальных клеток.
После длительной криоконсервации важно не только количество полученных жизнеспособных клеток, в том числе и СПК, но и сохранение их функциональной активности. Нами установлено, что после 2 и 4 лет криоконсервации пролифе-ративная активность мононуклеарных клеток, содержащих СПК/ЭПК, пациентов с ХСН снижается - как спонтанная, так и в ответ на митогенный стимул. А также увеличивается количество клеток в стадии апоптоза и уменьшается - в стадии интерфазы. Действительно, многие данные указывают на то, что криоконсервация индуцирует апоптоз в СПК и нарушает дифференцировку мононуклеарных клеток пуповинной крови в ЭПК [5].
Таким образом, установлено, что длительное криоконсер-вирование мононуклеарных клеток, мобилизованных Г-КСФ от пациентов с ХСН, приводит к уменьшению содержания количества ЭПК, снижению их пролиферативной активности и увеличению количества клеток, находящихся в стадии апоптоза. Из вышесказанного следует, что в целях клеточной терапии пациентов с ХСН необходимо использовать СПК/ ЭПК периферической крови, хранившиеся в жидком азоте не более одного года.
9. Huang L., Song G.Q., Wu Y. et al. Effect of different cryopreservation time on quality of umbilical cord blood cells. Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi. 2013. V. 21. P. 177-180.
10. Jang J., Kim S., Choi J. et al. // Acta Pharmacol. Sin. 2007. V. 28. P. 367-374.
11. Lin R-Z., Dreyzin A., Aamodt K. et al. // Cell Transplant. 2011. V. 20. P. 515-522.
12. Бабийчук Л.А., Михайлова О.А., Зубов П.М. и др. // КТТИ. 2013. Т. 8. № 4. C. 50-54.
13. Naaldijk Y., Staude M., Fedorova V. et al. // BMC Biotechnology. 2012. V.12. http://www.biomedcentral.com/1472-6750/12/49.
14. Vosganian G.S., Waalen J., Kim K. et al. // Cytotherapy. 2012. V. 14. P. 1228-1234.
15. Zhao Z.G., Li W.M., Chen Z.C. et al. // Cancer Invest. 2008. V. 26. P. 391-400.
P. 4773-4777.
Бондаренко Наталья Анатольевна - канд. биол. наук, младший научный сотрудник лаборатории клеточных технологий ФГБУ «НИИКЭЛ», стажер-исследователь лаборатории клеточных технологий центра новых технологий ФГБУ «ННИИПК им. акад. Е.Н. Мешал-кина» Минздрава России (Новосибирск, Российская Федерация).
Лыков Александр Петрович - канд. мед. наук, ведущий научный сотрудник лаборатории клеточных технологий ФГБУ «НИИКЭЛ», младший научный сотрудник лаборатории клеточных технологий центра новых технологий ФГБУ «ННИИПК им. акад. Е.Н. Мешалкина» Минздрава России (Новосибирск, Российская Федерация).
Ким Ирина Иннокентьевна - канд. мед. наук, младший научный сотрудник лаборатории клеточных технологий ФГБУ «НИИКЭЛ», младший научный сотрудник лаборатории клеточных технологий центра новых технологий ФГБУ «ННИИПК им. акад. Е.Н. Мешалкина» Минздрава России (Новосибирск, Российская Федерация).
Повещенко Ольга Владимировна - канд. мед. наук, заведующий лабораторией клеточных технологий ФГБУ «НИИКЭЛ», лабораторией клеточных технологий центра новых технологий ФГБУ «ННИИПК им. акад. Е.Н. Мешалкина» Минздрава России (Новосибирск, Российская Федерация).
Повещенко Александр Федорович - д-р мед. наук, заведующий лабораторией физиологии протективной системы ФГБУ «НИИКЭЛ», старший научный сотрудник лаборатории клеточных технологий центра новых технологий ФГБУ «ННИИПК им. акад. Е.Н. Мешалкина» Минздрава России (Новосибирск, Российская Федерация).
Покушалов Евгений Анатольевич - д-р мед. наук, профессор, заместитель директора по научно-экспериментальной работе, руководитель центра интервенционной кардиологии ФГБУ «ННИИПК им. акад. Е.Н. Мешалкина» Минздрава России (Новосибирск, Российская Федерация). Романов Александр Борисович - д-р мед. наук, ведущий научный сотрудник центра интервенционной кардиологии, врач-сердечно-сосудистый хирург кардиохирургического отделения нарушений ритма сердца ФГБУ «ННИИПК им. акад. Е.Н. Мешалкина» Минздрава России (Новосибирск, Российская Федерация).
Караськов Александр Михайлович - академик РАН, д-р мед. наук, профессор, заслуженный деятель науки Российской Федерации, директор ФГБУ «ННИИПК им. акад. Е.Н. Мешалкина» Минздрава России (Новосибирск, Российская Федерация).
Коненков Владимир Иосифович - академик РАН, д-р мед. наук, профессор, директор ФГБУ «НИИКЭЛ», руководитель центра новых технологий ФГБУ «ННИИПК им. акад. Е.Н. Мешалкина» Минздрава России (Новосибирск, Российская Федерация).
Influence of prolonged cryopreservation on the number and functional activity of stem/progenitor cells derived after G-CSF mobilization from patients with chronic heart failure
NA. Bondarenko 12*, A.P. Lykov 12, I.I. Kim 12 O.V. Poveschenko 12 A.F. Poveschenko 12 EA. Pokushalov 2, A.B. Romanov 2, V.I. Konenkov 12 A.M. Karaskov 2 1 Institute of Clinical and Experimental Lymphology, Novosibirsk, Russian Federation; 2 Academician Ye. Meshalkin Novosibirsk Research Institute of Circulation Pathology, Novosibirsk, Russian Federation
* Corresponding author. Email: [email protected], Tel: +7 (383) 347-60-46
Objectives and Methods. It is shown that long-term cryopreservation for 2 and 4 years leads to a reduction in the number and viability of the mononuclear cells obtained after mobilization granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) from patients with chronic heart failure. In addition, during prolonged cryopreservation decreased amount of content endothelial progenitor cells of the mononuclear cells from patients with chronic heart failure.
Results. It was established that in cryopreservation for 2 and 4 years leads to a decreased proliferative activity of the mononuclear cells mobilized by G-CSF, both spontaneous and mitogen stimulated, increase cell number in the stage of apoptosis. The findings suggest that the negative impact on the long cryopreservation mononuclear cells obtained after G-CSF mobilization and effective cell therapy for heart failure patients need to use cells in the cryopreservation of not more than 2 years. Keywords: cryopreservation; mononuclear cells; endothelial progenitor cells; chronic heart failure.
Circulation Pathology and Cardiac Surgery (2015) 1: 90-94
Список литературы
1. Юхта М.С., Волкова Н.А., Жуликова Е.П. и др. // КТТИ. 2013. Т. 8. № 2. С. 29-34.
2. Spurr E.E., Wiggins N.E., Marsden K.A. et al. // Cryobiology. 2002. V. 44. P. 210-217.
3. Повещенко О.В., Ким И.И., Бондаренко Н.А. и др. // Патология кровообращения и кардиохирургия. 2014. № 1. С. 26-31.
4. Clarke D.M., Yadock D.J., Nicoud I.B. et al. // Cytotherapy. 2009. V. 11. P. 472-479.
5. Lu X., Proctor S.J., Dickinson A.M. // Cell Transplant. 2008. V. 17. P. 1423-1428.
6. Mairhofer M., Schulz J.C., Parth M. et al. // Cell Transplantation. 2013. V. 22. P. 1087-1099.
7. Stroncek D.F., Xing L., Chau Q. et al. // Transfusion. 2011. V. 51. P. 2647-2655.
8. Broxmeyer H.E., Lee M.R., Hangoc G. et al. // Blood. 2011. V. 117.
