CC BY
24
УДК 616-006.6-085.277.3.033
ЭФФЕКТИВНОСТЬ КОНЪЮГИРОВАННОЙ С ДНК ФОРМЫ ДОКСОРУБИЦИНА ПРИ КАРЦИНОМЕ РС-1 У КРЫС
Н.А. пятаев1, Г.Г. Мельцаев2, п.и. скопин1, С.А. Щукин2, о.В. Минаева1, Е.Ю. коровина1
EFFICIENCY OF THE CONJUGATE DOXORUBICIN-DNA IN CARCINOME РС-1 IN RATS
N.A. Pyataev1, G.G. Me^ev2, P.I. Skopin1, S.A. Shchoukin2,O.V. Minaeva1, E.J. Korovina1
1 ГОУ ВПО «Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарева», Саранск
2 ГУЗ «Республиканский онкологический диспансер Республики Мордовия», Саранск
Реферат. Цель работы — изучить характер тканевого распределения доксорубицина при его введении в форме конъюгата с нативной ДНК и исследовать эффективность комплекса ДНК-доксорубицин у крыс с перевитой холангиоцеллюлярной карциномой РС-1. Выполнены эксперименты на крысах с перевитой холангиоцеллюлярной карциномой РС-1. Животные были разделены на 6 групп. В контрольной группе животные лечения не получали. В 1-й опытной группе вводили доксорубицин в дозе 1 мг/кг внутрибрюшинно, во 2-й, 3-й и 4-й опытных группах — конъюгат доксорубицина с ДНК (препарат деринат ЗАО «Техномедсервис», Россия) в дозах 1, 2 и 4 мг/кг соответственно, в 5-й опытной группе — только деринат. Исследовали характер тканевого распределения доксорубицина после инъекции и ряд показателей, характеризующих эффективность и токсичность химиотерапии: индекс массы опухоли; индекс торможения роста опухоли; летальность в процессе лечения; число лейкоцитов и тромбоцитов периферической крови, частоту токсической энтеропатии и миокардиодистрофии. Установлено, что введение доксорубицина в форме конъюгата с нативной ДНК изменяет характер распределения препарата. Регистрируется преимущественное накопление доксорубицина в тканях с высокой митотической активностью (опухолевой и лимфоидной ткани) на фоне снижения плазменной концентрации и концентрации в паренхиматозных органах. Показано, что конъюгированная с ДНК форма доксорубицина обладает несколько меньшей антибластомной активностью, но в эквивалентных по противоопухолевому эффекту дозах реже вызывает миокардиострофию и энтеропатию по сравнению с изолированным препаратом.
Ключевые слова: комплекс ДНК-доксорубицин, химиотерапия, кардиотоксичность, распределение, деринат.
Resume. The purpose of the work is the investigation of tissue distribution of the doxorubicin-DNA conjugate and efficiency of this drug form at treatment of cholangiocellular carcinoma PC-1 in rats. Materials and methods. Experiments were carried out on rats with transplantated cholangiocellular carcinoma PC-1. Animals were divided on 6 groups. In the control group, animals were not treated. In the first experimental group, 1 mg/kg of doxorubicin was injected intraperitoneally. In the 2, 3 et 4 experimental group, doxorubicin-DNA («Derinat», Tehnomedservis, Russia) conjugate to quantity 1, 2 and 4 mg/kg of doxorubicin. In the last group we have injected the «Derinat» only. We have studied the tissue distribution of the doxorubicin and several parameters of chemotherapy efficiency. The following parameters were analyzed: lethality, the tumor mass index, the number of leucocytes in blood, the rate of gastrointestinal tract ulcers. Results. We have found that injection of doxorubicin in the conjugated form changes the tissue distribution of the drug. The doxorubicin is accumulated in tissues with high mitotic activity (tumor and lymphoid tissues). At same time the concentration of drug in blood and parenchymatous organs was decreased. We have shown that DNA-conjugated form of doxorubicin has smaller antineoplastic activity than pure doxorubicin. We have found that the side effects rate of the DNA-doxorubicin conjugate is much lower than for pure drug. Key words: DNA-doxorubicin complex, chemotherapy, cardiotoxicity, distribution, Derinat.
Введение
Проблема избирательности противоопухолевой химиотерапии является одной из наиболее актуальных в современной онкофармакологии. Одним из принципиальных путей ее решения является на-
правленный транспорт химиопрепаратов с помощью специфических векторов, обладающих тропностью к опухолевым клеткам. В качестве последних используются разнообразные химические соединения, каким-либо образом избирательно поглощающиеся опухолевыми клетками [1, 2, 3]. Наше внимание
привлек препарат нативной ДНК — деринат (ЗАО «Техномедсервис», Россия). Главной особенностью метаболизма и кинетики препарата, позволяющей использовать его в качестве вектора для доставки химиопрепаратов к опухолевым клеткам, является выявленный факт избирательного накопления экзогенной ДНК в опухолевой ткани [4]. В исследованиях, проводимых с использованием меченного НЗ-тимидином дерината, было установлено, что концентрация радионуклида в опухоли и лимфоузлах после внутрибрюшинного введения препарата была в 5—7 раз выше, чем в плазме и ткани паренхиматозных органов [3, 4]. Авторами данных работ высказывается мнение, что фрагменты молекулы ДНК, имеющие размер 50—120 нм, поглощаются клетками путем рецепторопосредованного эндоцитоза. Кроме того, в литературе имеются сведения о создании конъюгатов ряда противоопухолевых химиопрепаратов с ДНК in vitro [5—9]. В качестве таких препаратов были использованы доксорубицин и карминомицин. В работах Ю.П. Вайнберга и Д.Ю. Мельникова [5, 10] показано, что при экстракорпоральном взаимодействии дерината с доксорубицином и карминомицином в среде, содержащей альбумин, образуются устойчивые к диссоциации в водной среде комплексы, причем связь химиопрепаратов с молекулой ДНК носит некова-лентный характер. Данные исследования послужили основанием для разработки методики лечения рака молочной железы, желудка и толстого кишечника [11]. Однако следует отметить, что до настоящего времени не проводилось исследований кинетики и распределения, не установлена эффективная терапевтическая доза химиопрепаратов при их введении в форме конъюгатов с ДНК. Данные обстоятельства и послужили основанием для проведения настоящего исследования.
Цель работы — изучить характер тканевого распределения доксорубицина при его введении в форме конъюгата с нативной ДНК и исследовать эффективность комплекса ДНК-доксорубицин у крыс с перевитой холангиоцеллюлярной карциномой РС-1.
Материалы и методы
Выполнены эксперименты на 72 лабораторных крысах линии Vistar. Животным по достижении массы 80—100 г под кожу передней брюшной стенки перевивали штамм холангиоцеллюлярной карциномы РС-1. Животные были разделены на 6 групп, по 12 особей в каждой. В контрольной группе животные
лечения не получали. В опытных группах на 7-й день после перевивки начинали лечение. В 1-й опытной группе вводили доксорубицин («Teva», Израиль) в дозе
1 мг/кг внутрибрюшинно; во 2, 3 и 4-й опытных группах — конъюгат доксорубицина с деринатом из расчета соответственно 1, 2 и 4 мг/кг конъюгированного доксорубицина, в 6-й — деринат (ЗАО «Техномедсервис», Россия) в дозе 7,5 мг/кг (доза, соответствующая дозе дерината во 2—4-й опытных группах). Инъекции производились 1 раз в 3 дня. На 21-е сут после начала лечения животных забивали. Забой производили через 30 мин после инъекции препаратов. В 1-й и 2-й опытных группах исследовали характер тканевого распределения доксорубицина.
Приготовление конъюгата дерината с доксорубицином осуществляли по методике Д.Ю. Мельникова [10] в собственной модификации. В стерильных условиях смешивали 2 мл водного раствора доксо-рубицина (12 мг/мл) и 1 мл 10% человеческого сывороточного альбумина. Инкубировали 30 мин при 4оС и непрерывном шейкировании, затем добавляли
2 мл 1,5% дерината, продолжали инкубацию в тех же условиях в течение 60 мин. Свободный доксорубицин удаляли диализом ацетатным буфером с рН 4,5. Для определения количества конъюгированного доксо-рубицина последний экстрагировали изопропанолом при 42оС в течение 60 мин, после чего раствор нагревали до 60оС, затем центрифугировали при 10000 g в течение 30 мин, надосадок отбирали и определяли в нем концентрацию препарата. Степень конъюгации доксорубицина составляла 60—170%.
В эксперименте определение концентрации доксорубицина производили в плазме крови, опухолевой ткани, в тканях печени, почек, легких, в лимфоузлах, кишечной стенке и в мышечной ткани. Для исследований использовали высокоэффективную жидкостную хроматографию (хроматограф «Милихром 5-3», Россия), анализ выполняли по методике [12]. Параметры хроматографирования: детектор ультрафиолетовый, Л=254 нм, колонка КАХ-5, сорбент — нуклеосил С18, подвижная фаза — ацетонитрил + фосфатный буфер с рН 4,5 (v:v=70:30).
Во всех группах определяли показатели, характеризующие эффективность химиотерапии: индекс массы опухоли (отношение массы опухоли к массе тела животного); индекс торможения роста опухоли (ИТРО), рассчитываемый по формуле: ИТРО=(Мк — Мо)/Мк*100, где Мк и Мо — средняя масса опухоли соответственно в контрольной и опытных группах. Для оценки токсичности исследовали летальность
в процессе лечения, определяли число лейкоцитов и тромбоцитов периферической крови, проводили морфологическое исследование желудка, кишечника, печени, почек, легких и миокарда.
Статистическую обработку данных осуществляли с использованием t-критерия Стьюдента и критерия Х-квадрат. Критический уровень значимости различий принимался равным 5% (р<0,05).
Результаты и их обсуждение
Тканевые концентрации определяли в 1-й и во 2-й опытных группах, где вводимые дозы доксорубицина были эквивалентны. Результаты определения представлены на рис. 1.
В 1-й опытной группе характер распределения препарата был относительно равномерным. В ткани опухоли концентрация препарата была равна (0,290±0,023) мкг/г, что составило 75% от плазменной концентрации. Наиболее высокие концентрации реги-
стрировались в хорошо васкуляризованных тканях — в легких, печени, почках и миокарде [(0,572±0,051, 0,842±0,031 и 0,647±0,029) мкг/г соответственно]. Примечательно, что не было выявлено повышения концентрации доксорубицина в тканях с высокой митотической активностью клеток — лимфоузлах и селезенке. Концентрации исследуемой субстанции в этих тканях составила 0,421 мкг/г и 0,582 мкг/г соответственно.
Во 2-й опытной группе регистрировалось преимущественное накопление препарата в быстрорастущих и регенерирующих тканях, причем в большей степени — в лимфоидной и опухолевой ткани и в меньшей — в кишечной стенке. В опухоли концентрация превышала плазменную в 5,5 раза и достигала 0,959 мкг/г. В лимфоидной ткани содержание доксорубицина составляло (0,815±0,021) мкг/г, в ткани селезенки — (0,727±0,040) мкг/г. При этом плазменная концентрация и концентрация доксорубицина в паренхиматозных органах была в среднем в 2—2,5 раза
1,2
1-я опытная группа («чистый доксорубицин)
2-я опытная группа (конъюгат доксорубицин-деринат
□ Плазма
□ Лимфоузел
Опухоль Селезенка
□ Печень
□ Миокард
Почка ■ Кишечник
Легкое
Рис. 1. Тканевое распределение доксорубицина в исследуемых группах. Для всех исследованных тканей различия между группами достоверны
0
ниже, чем в 1-й опытной группе. Разница концентраций в миокарде между 1-й и 2-й опытными группами составила почти 300% (0,594±0,021 и 0,188±0,011 соответственно).
Таким образом, полученные результаты позволяют заключить, что введение доксорубицина в виде конъюгата с ДНК меняет характер распределения препарата. Тканевое распределение препарата в данном случае практически полностью соответствует распределению меченых нуклеотидов, полученных Г.Г. Русиновой и соавт. [4] при введении экзогенной ДНК. Это свидетельствует о достаточно прочной связи доксорубицина с ДНК и отсутствии значимой диссоциации комплекса доксорубицин-ДНК до момента поглощения клетками. Учитывая, что условия экстракции вещества из тканей in vitro значительно отличаются от таковых in vivo, закономерно возникает вопрос, происходит ли расщепление комплекса доксорубицин-ДНК после поступления в клетку, и сохраняется ли антибластомная эффективность доксорубицина после конъюгации с ДНК? Этот вопрос стал предметом второй части нашего исследования, в которой была изучена антибластомная активность и токсичность доксорубицина и его конъюгатов с ДНК.
Результаты исследования антибластомной активности приведены в табл. 1.
Таблица 1. Противоопухолевая активность различных схем терапии
Значения показателей
Группы сравнения в группах
ИМО ИТРО
Контрольная 44,1±3,12 —
1-я опытная («чистый» доксорубицин) 18,5±1,41 66,4±4,8
2-я опытная (конъюгат 32,1±2,21-2 30,4±1,92
доксорубицин-деринат, 1 мг/кг)
3-я опытная (конъюгат доксорубицин-деринат, 2 мг/кг) 20,2±2,71 69,2±3,4
4-я опытная (конъюгат 7,8±0,812 432,7±22,12
доксорубицин-деринат, 4 мг/кг)
5-я опытная (деринат) 48,1±3,72 -5,8±0,62
примечание. ИМО — индекс массы опухоли, ИТРО — индекс торможения роста опухоли; Достоверное (р<0,05) отличие показателя от аналогичного в контрольной группе; Достоверное (р<0,05) отличие показателя от аналогичного во 2-й опытной группе.
Исследуемый штамм карциномы РС-1 проявил достаточную чувствительность к доксорубицину: в 1-й опытной группе («чистый» доксорубицин в дозе 1 мг/кг) индекс торможения роста опухоли со-
ставил 66,4%. Активность конъюгированной формы препарата была несколько меньшей и возрастала с увеличением дозы. Во 2-й опытной группе (конъю-гированный доксорубицин в дозе 1 мг/ кг) ИТРО был равен 30,4%, что на 54% меньше показателя 1-й опытной группы. Противоопухолевый эффект, эквивалентный эффекту «чистого» препарата, достигался при использовании дозы конъюгата 2 мг/кг (3-я опытная группа). ИТРО в данной группе был равен 69,2% и достоверно не отличался от такового в 1-й опытной группе. Конъюгированный доксорубицин в дозе 4 мг/кг (4-я опытная группа) имел максимально выраженный эффект (ИТРО=432%), который, однако, в 100% случаев сопровождался тяжелыми токсическими реакциями. Деринат в виде монотерапии (5-я опытная группа) не оказывал влияния на опухолевый рост. На рис. 2 приведены фотографии средних размеров опухолей для каждой из исследованных групп.
Анализ побочных и токсических эффектов химиотерапии показал, что встречаемость и выраженность осложнений при ее проведении различалась в сравниваемых группах (табл. 2).
При введении «чистого» доксорубицина у всех животных регистрировалась лейкопения [(9,4±0,8)х109/л против (18,9±1,6) х109/л в контроле, р<0,05], язвенные поражения кишечника встречались в 42% наблюдений, у 4 (33%) животных имелись морфологические признаки токсической миокардиодистрофии. Всего в процессе лечения пало 2 (16,7%) животных. Причиной их гибели стал язвенно-некротический энтероколит. Во 2-й опытной группе частота побочных эффектов химиотерапии была значительно меньшей. Летальных исходов в данной группе не регистрировалось, количество лейкоцитов в периферической крови достоверно не отличалось от такового в контроле, морфологических изменений со стороны внутренних органов не наблюдалось. В 3-й опытной группе отмечался 1 летальный исход, у выживших животных преобладали токсические эффекты со стороны кроветворной системы — лейкопения, тромбоцитопения и анемия, однако их выраженность была меньшей, чем при использовании «чистого» доксорубицина. Частота язвенного поражения кишечника и миокардиодистрофии составляла 16%, что почти в 2 раза меньше, чем в 1-й опытной группе. В 4-й опытной группе частота и выраженность токсических эффектов химиотерапии была наибольшей. Летальность в процессе терапии составила 58%. При вскрытии у 4 павших животных обнаружен язвенно-некротический энтероколит,
Рис. 2. Фотографии опухолей средних размеров в группах:
1 — контрольная; 2 — 2-я опытная (конъюгат деринат-доксорубицин 1 мг/кг); 3 — 1-я опытная (доксорубицин 1 мг/кг) и 3-я опытная (конъюгат деринат-доксорубицин 2 мг/кг); 4 — (конъюгат деринат-доксорубицин 4 мг/кг); 5 — только деринат
Таблица 2. Побочные эффекты различных схем терапии
Значения показателей в группах
Группы сравнения Летальность, абс. (%) Лейкоциты, х09/л(М±т) Тромбоциты, х109/л(М±т) Язвенный энтероколит, абс. (%) Токсическая миокардио-дистрофия, абс. (%) Токсическая дистрофия печени, абс. (%)
Контрольная 0 18,9±1,62 318±192 0 0 0
1-я опытная («чистый» доксорубицин) 2 (16,7)1 9,4±0,81 116±111 5 (41,7)1 4 (33,3)1 1 (8,3)1
2-я опытная (конъюгат
доксорубицин-деринат, 0 15,3±1,12 231±1412 0 0 0
1 мг/кг)
3-я опытная (конъюгат
доксорубицин-деринат, 1 (8,3) 11,5±0,91 152±161 2 (16,7)12 2 (16,7)12 0
2 мг/кг)
4-я опытная (конъюгат
доксорубицин-деринат, 7 (58,3)1 2,7±0,112 40,4±2,212 12 (100)12 12 (100)12 12 (100)12
4 мг/кг)
5-я опытная (деринат) 0 17,1±1,82 326±152 0 0 0
Примечание. Достоверное (р<0,05) отличие показателя от аналогичного в контрольной группе; Достоверное (р<0,05) отличие показателя от аналогичного во 2-й опытной группе.
у 3 — выраженные дистрофические изменения во всех внутренних органах (печени, почках, миокарде). У выживших отмечалась тяжелая миелосупрессия (число лейкоцитов — 2,7±0,1 х109/л, тромбоцитов — 40,4 х109/л), в 100% случаев обнаруживались язвы
кишечника и регистрировались морфологические проявления гепатопатии и миокардиодистрофии.
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что эффективные дозы доксорубицина при введении в виде конъюгата отличаются
от таковых при использовании изолированной субстанции. Эквивалентная по противоопухолевой активности доза конъюгированного доксорубицина была примерно в 2 раза выше дозы чистого препарата. Наиболее вероятным объяснением данного факта является неполная диссоциация комплекса доксорубицин-ДНК в клетке. Вместе с тем конъюги-рованная форма доксорубицина в эффективной дозе вызывала достоверно меньше побочных эффектов. При этом токсичность препарата была пропорциональна степени накопления в тех или иных тканях. Так, у конъюгата, который слабо аккумулируется в миокарде и паренхиматозных органах, значительно уменьшались ульцерогенный и кардиотоксический эффекты. Степень миелосупрессии, особенно в отношении тромбоцитарного ростка, также была выражена в меньшей степени. Проведенные исследования продемонстрировали возможность повышения избирательности действия доксорубицина при введении в виде конъюгата с гетерологичной ДНК и показали перспективность проведения исследований в этом направлении.
Выводы
1. У крыс с перевитой карциномой РС-1 введение доксорубицина в форме конъюгата с нативной ДНК изменяет характер распределения препарата. Регистрируется преимущественное накопление доксорубицина в тканях с высокой митотической активностью (опухолевой и лимфоидной ткани) на фоне снижения плазменной концентрации и концентрации в паренхиматозных органах.
2. Конъюгированная с ДНК форма доксорубици-на обладает меньшей антибластомной активностью по сравнению с изолированным препаратом, но оказывает меньшее токсическое воздействие на желудочно-кишечный тракт и миокард. Эквивалентная по противоопухолевой активности доза конъюги-рованного доксорубицина в два раза выше, чем доза «чистого» препарата.
Литература
1. северин, Е.с. Исследование эффективности различных белковых векторов в рецепторопосредованном транспорте биологически активных веществ в клетки / Е.С. Северин [и др.] // Информационный бюллетень РФФИ. — 1995. — Т. 3, № 4. — С.303.
2. Baurain, R. Plasma levels of doxorubicin after IV bolus injection and infusion of the doxorubicin-DNA complex in rabbits and man. Comparison with free doxorubicin / R. Baurain, D. Deprez-De Campeneere, A. Zenebergh, A. Trouet // Cancer Chemother Pharmacol. — 1982. — Vol. 9, № 2. — P.93—96.
3. Deprez-De Campeneere, D. Comparative study in mice of the toxicity, pharmacology, and therapeutic activity of daunorubicin-DNA and doxorubicin-DNA complexes / D. Deprez-De Campeneere, R. Baurain, M. Huybrechts, A. Trouet // Cancer Chemother Pharmacol. — 1979. — Vol. 2, № 1. — P.25—30.
4. русинова, Г.Г. Особенности усвоения экзогенной ДНК и ее низкомолекулярных предшественников в организме животных / Г.Г. Русинова // Биохимия. — 1971. — Т. 36, № 5. — С.88—89.
5. Вайнберг, Ю.п. Физико-химические и биологические свойства комплекса ДНК с карминомицином / Ю.П. Вайнберг // Медицина. — 1980. — № 9. — С.18—22.
6. Вайнберг, Ю.п. Активность лекарственных средств, полученных на основе нативной ДНК в отношении РНК- и ДНК-содержащих вирусов / Ю.П. Вайнберг, Д.Н. Носик, Э.Н. Каплина [и др.] // Медицина. — 1995. — № 6. — С.3—5.
7. Brown, I. The comparative toxicity and therapeutic efficacy of adriamycin and the adriamycin-DNA complex in the chemotherapy of C3H mice with transplanted mammary adenocarcinoma / I. Brown, H.W. Ward // Cancer Lett. — 1977. — Vol. 2, № 4—5. — P.227—232.
8. Hall, S.W. Doxorubicin-DNA complex: a phase I clinical trial / S.W. Hall, R.S. Benjamin, M.A. Burgess [et al.] // Cancer Treat. Rep. — 1982. — Vol. 66, № 12. — P.2033—2037.
9. Severin, S.E. Antitumor activity of conjugates of the oncofetal protein, alpha-fetoprotein and phthalocyanines in vitro / S.E. Severin [et al.] // Biochemistry and Molecular Biology International. — 1997. — Vol. 43, № 4. —P.873—881.
10. Мельников, Д.Ю. Применение иммуноконъюгатов в химиотерапии онкологических больных / Д.Ю. Мельников // Медицинская картотека. — 1999. — №7/8. — С.28—32.
11. Патент России № 20049721993, 1994.
12. European pharmacopoeia 5.0. — 2005. — P.1481—1482.
