CC BY
34
УДК: (612.017.1:615.371):616.72-002
Ю.А. Кожевников, И. В. Савкин, Д.М. Самарин, Г.В. Селедцова, В.И. Селедцов, Н.Г. Колосов
ЭФФЕКТИВНОСТЬ КЛЕТОЧНОЙ ТРАНСПЛАНТАЦИИ ПРИ ЛЕЧЕНИИ ПЕЧЕНОЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН, Новосибирск
ГОУ ВПО Новосибирский государственный медицинский университет Росздрава
I ---------------------------------------------------------------------------------
Экспериментально показано, что трансплантация сингенных клеток костного мозга (ККМ), так же, как и аллогенных клеток фетальной печени (КФП), способствует функциональному печеночному восстановлению как при острой печеночной недостаточности (ОГ1Н), так и при циррозе печени (ЦП). Согласно биохимическим и патоморфологическим данным, внутривенный путь трансплантации клеток наиболее эффективен при ОПН. при ЦП — внутрипече-ночный. Внутршгортальное введение клеток оказалось малоэффективным как при ОПН, так и при ЦП. Полученные данные могут стать экспериментальной основой для внедрения клеточных технологий в практику лечения тяжелых заболеваний печени.
Ключевые слова: стволовые клетки, цирроз печени, острая печеночная недостаточность
Острая печеночная недостаточность (ОПН) и цирроз печени (ЦП) — тяжелые заболевания с неблагоприятным прогнозом течения. Стандартное лечение этих заболеваний во многих случаях является малоэффективным. Поэтому летальность при возникновении тяжелых форм печеночной недостаточности достигает 70-90% [1,2]. Одна из причин низкой эффективности лечения тяжелых заболеваний печени заключается в отсутствии препаратов, способных стимулировать полноценное восстановление печеночной ткани. Одним из действенных методов стимуляции регенерации печени является трансплантация низкодифференцированных (стволовых) клеток [3-5]. В силу своей технической доступности клеточная трансплантация может стать преимущественной альтернативой органной трансплантации. Тем не менее невыясненными остаются тип стволовых клеток и их способность длительно выживать в условиях несовместимого по антигенам гистосовместимости микроокружения в процессе функционального восстановления поврежденной печени. Не установлены пути введения клеток, оптимальные для лечения печеночной недостаточности. Нерешенные вопросы теоретического и прикладного характера предопределили содержание настоящего исследования.
Методика
Исследование выполнено на линейных мышах С57В1/6 и ВАЬВ/с с массой тела 20-22 г. Возраст животных был не моложе 3 месяцев. В общей сложности в экспериментах было использовано
221 животное. Эксперименты на животных проводились в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экпериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977г.№755).
ОПН развивалась на 5-е сутки после однократного внутрибрюшинного введения 40 мкл масляного раствора четыреххлористого углерода. ЦП развивался на 60-е сутки после начала введения масляного раствора четыреххлористого углерода, который инъецировался в дозе 30 мкл 1 раз в неделю. Развитие ОПН и ЦП подтверждалось биохимическими и морфологическими критериями.
Клеточный трансплантат содержал либо 5х 10' сингенных (C57BL/6) клеток костного мозга (ККМ), полученных от взрослых животных, либо 5х107 аллогенных (BALB/c) клеток фетальной печени (КФП). Клетки трансплантировали под эфирным наркозом внутривенно (в орбитальный синус), внутрипеченочно (в 3 точки) или внутри-портально (в воротную вену ).
Каждая экспериментальная группа состояла из 10 мышей, тогда как контрольная группа включала в себя 15 животных. Контрольным мышам вводили по 0,3 мл среды RPMI-1640 (Sigma, USA). Забор крови для оценки биохимических показателей проводили через 6 недель после клеточной трансплантации. Биохимические показатели (АЛТ, ACT, тимоловая проба, лактатдегидроге-наза, общий белок, альбумин, общий холестерин) определяли с использованием рутинных лабораторных методов.
Для анализа морфологических изменении печеночной ткани выполняли аутопсию печени, а также учитывали ее весовые показатели. Окраску гистологических препаратов проводили гематоксилин-эозином и по Ван-Гизону. Выраженность иатоморфологическнх изменений в печени определяли с помощью индекса гистологической активности (ИГА), известного как «индекс Knodelk
Статистическую значимость различий определяли после проверки нормальности распределения данных тестами Колмогорова — Смирнова. Все измеряемые параметры распределялись в соответствии с нормальным законом распределения* поэтому для оценки достоверности различий использовали t-критерий Стыодента. Представленные данные отражают результаты не менее 2 однотипных экспериментов.
Результаты и обсуждение
Значимым критерием эффективности методов коррекции ОНИ является снпжсчЛю летальности. Наибольшая летальность была выявлена is контрольной группе, где она составила 40%. Летальность в группе с внутрппортальным введением КФП составила 30%, в группах с внут-рнпортальным и внутрипечепочным введением ККМ 20%, а в группах с внутривенным введением клеток - 10%.
Исходно, в результате развития ОНИ все 8 исследованных параметров (АЛТ, ACT, тимоловая проба, лактатдегидрогепаза, общий белок, альбумин, общий холестерин, вес печени) были за пределами нормы. Эти сдвиги были устойчивыми и сохранялись у контрольных животных с ОГ1Н в течение всего периода наблюдения (6 недель). В то же время статистически значимые изменения н сторону нормализации исследуемых параметров были отмечены у экспериментальных животных, получавших лечение в виде трансплантации Стволовых клеток различного происхождения (Рис. 1). Исходя из количества статистически значимо корригированных параметров, наиболее выраженный эффект клеточной трансплантации
Щ Клетки костного мозга
Внутривенный Внутрипортальный Внутрипеченочный Путь клеточной трансплантации Рис. 1. Эффективность клеточной трансплантации при острой печеночной недостаточности
имел место при внутривенном введении ККМ (8 параметров) и при внутривенном введении КФП (7 параметров). Наименее эффективным оказался внутрипортальный путь введения клеток. Промежуточное положение заняла внутри-печеночная трансплантация ККМ (3 параметра). Более значимым при этом пути введения оказалось влияние трансплантированных в печень КФП, которое затронуло 6 параметров.
Как следует из таблицы 1. наименьший уровень ИГА был отмечен при внутривенном и при внутрипеченочном введении КФП. Близкий к этому результат был достигнут при внутривенном введении ККМ.
Таким образом, в модели ОПН наиболее эффективное функциональное и морфологическое восстановленне печени было достигнуто при внутривенном введении сингенных ККМ или ал-логеииых КФП.
Исходно в результате развития ЦП все 8 исследованных параметров (АЛТ, ACT, тимоловая проба, лактатдегидрогепаза. общий белок, альбумин, общий холестерин, вес печени) претерпели статистически значимые патологические изменения. В контрольно»! группе эти изменения сохранялись на протяжении всего периода наблюдения (6 недель) (Рис. 2). Как и в случае с ОПН, трансплантированные клетки обладали способностью существенно
Таблица 1
Патоморфологические изменения печени при острой печеночной недостаточности
Патоморфолошческне изменения Введение клеток 1 (сходное значение Контрольное значение
Внутривенное Впутрниортальнос Внутринсченочнос
ККМ КФП ККМ КФП ККМ КФП
Псрнпортальные некрозы (включая мосгоиндные) 5 5 8 8 6 5 10 9
Влутрилольковые некрозы, дистрофия гаитоиитов 2 1 3 3 2 2 i •1
Воспалительный инфильтрат 2 2 2 2 3 2 4 2
Индекс гистологической активное! II (ИГЛ) 9 8 13 13 11 9 18 15
Примечание. ККМ метки костного моми, КФП - метки фетальной печеночной ткани БЮЛЛЕТЕНЬ СО РАМН, №2 (124), 2007 г.
| Клетки костного мозга ПКлетки фетальной печени
Внутривенный Внутрипортальный Внутрипеченочный Путь клеточной трансплантации
Рис. 2. Эффективность клеточной трансплантации при циррозе печени
корригировать измененные в результате развития болезни биохимические параметры крови. Исходя из количества параметров, подвергшихся статистически значимой коррекции, наиболее выраженный эффект клеточной трансплантации был достигнут при внутрипеченочном введении ККМ (7 параметров) или КФП (7 параметров). Несколько меньшее влияние было отмечено при внутривенном введении ККМ (5 параметров) или КФП (6 параметров). Так же, как и при ОПН, наименее эффективным оказался внутрипортальный путь введения клеток. Результаты биохимических исследований соответствовали данным гистологических исследований. Наиболее низкий уровень ИГЛ был отмечен при внутрипеченочном введении клеток (Таблица 2).
В целом, результаты нашего исследования согласуются с опубликованными экспериментальными данными [6,7,9,10], свидетельствующими о способности пизкоднфференцированных (стволовых) клеток активно включаться в процессы репарации печеночной ткани. Подтверждением этому также являются наши собственные клинические наблюдения эффективного применения трансплантации КФП влечении цирроза печени |4].
В свете представленных данных можно заключить, что внутривенная трансплантация стволо-
вых клеток — это наиболее подходящий способ лечения ОПН,тогдакаквнутрштеченочнуютранс-плантацию наиболее предпочтительно использовать при ЦП. Интересно, что не только КФП, пои ККМ были эффективно задействованы в процессе функционального восстановления поврежденной печени. Воздействие ККМ на восстановление функций печени может быть связано не только с реализацией их собственного пролиферативного п дифференцировочного потенциала, но также с их стимулирующим влиянием на функциональную активность зрелых гепатоцитов. Ранее такое системное влияние было экспериментально продемонстрировано и показано, что оно может опосредоваться интерлейкином-6 [6].
Важное значение в лечебном действии трансплантированных низкодифференцированиых клеток может иметь их способность реверсировать развитие соединительной ткани. Ранее такая способность была продемонстрирована экспериментально (7, 101 н подтверждена клиническими наблюдениями [9]. Антисклеротический эффект трансплантированных клеток может являться важным условием для формирования ниш. необходимых для роста функционально полноценной печеночной ткани.
Остается не совсем ясным — почему внутрипортальный путь введения стволовых клеток малоэффективен в купировании функциональных печеночных расстройств. Возможно, при попадании в портальный кровоток большинство трансплантированных клеток не находят благоприятных для реализации своего пролиферативного п дифференцировочного потенциала ниш.
В заключение следует заметить, что результаты представленной работы поддерживают точку зрения о перспективности использования клеточных технологий в медицинской практике. Эти результаты могут стать экспериментальной основой для оптимизации новых трансплантационных подходов в лечении тяжелых печеночных расстройств.
EFFI IN Т1
ine:
Yu. А G.V.
1г and I the t! as \v< prom с hem nous treat effect plant the li perin tech i
Л
1.
Блюг
2.
реши ле.ип - М. 3.
проб, кин, С. 32
Таблица 2
Патоморфологические изменения печени при циррозе печени
I ^геоморфологические изменения Введение клеток Исходное значение Контрольное значение
Внутривенное Внутри мор гал ьнос Внутрниеченочиос
ККМ КФП ККМ КФП ККМ КФП
Псринортальные некрозы (включая мостонидные) 7 7 8 8 6 5 8 10
Внутридальковыс некрозы, дистрофия гепатоцитов. 2 2 4 4 2 1 4 4
Восналнтельный инф|i.iьтрат 2 2 3 3 2 2 1 4
Фиброз 2 2 3 3 2 2 4 4
Индекс гистологической активности (ИГЛ) 13 13 18 18 12 10 20 22
Примечание. ККМ клетки костного мозга, КФП — клетки фетальной печеночной ткани
способ э транспользо-►ГГ, но и гроцес-«жден-вление элько с ивного акже с гональ-е такое ю про-т опос-
транс-
ЙННЫХ
рсиро-; такая спери-
1СКИМИ
ффект яяться , необ-[енной
1утри-ок ма-льных опада-гранс-
фИЯТ-
юго и
езуль-
ивают
вания
ктике.
льной
ггаци-
иных
тща 2
яьное
ние
EFFICIENCY OF CELL TRANSPLANTATION IN TREATING LIVER FAILURE IN EXPERIMENT
Yu. A. Kozhevnikov, I.V. Savkin, D.M. Samarin,
G.V. Seledcova, V.I. Seledcov, N.G. Kolosov
In murine model of both acute liver failure (ALF) and cirrotic liver (CL), it was demonstrated that the transplantation of syngeneic bone marrow cells, as well as allogeneic fetal liver cells may markedly promote functional liver restoration. According biochemical and pathomorphological data, the intravenous pathway of cell grafting was most efficient in treating ALP, whereas the intrahepatic one was most effective in treating CL. The intraportal cell transplantation was found to be least effective in treating the liver disorders. These results can be used as an experimental basis for clinical application of cell-based technologies in treating severe hepatic disorders.
m
Литература
1. Блюгер А.Ф. Практическая гепатология./ А.Ф. Блюгер, И.Н. Новицкий. — Рига, 1984. — С. 452.
2. Дифференциальная диагностика и лечение внутренних болезней: Руководство для врачей. Т. 2. Болезни органов пищеварения / Под ред. А.И. Хазанова.
- М., 2003. - С. 281-306.
3. Козлов В.А. Стволовые клетки: действительность, проблемы, перспективы / В.А. Козлов, В.А. Труфа-кин, Р.С. Карпов // Вестник РАМН. — 2004. — №9. — С. 32-40.
4. Лечение больных циррозами печени путем трансплантации стволовых клеток / Н.Г. Колосов, А.Я. Величко, О.В. Повещенко, Л.Р. Сиянова // Вопросы реконструктивной и пластической хирургии: Тез. докл. научно-практической конференции. — Томск, 2004.
- С. 52-53.
5. Курбатова Г.Р. Трансплантация фетальных тканей при лечении хронического гепатита и цирроза печени / Г.Р. Курбатова //Вестник новых медицинских технологий. — 2002. — Т. 9. — № 4. — С. 39-41.
6. Availability of bone marrow stromal cells in three-dimensional coculture with hepatocytes and transplantation into liver-damaged mice / M. Takeda, M. Yamamoto, K. Isoda //J. Biosci. Bioeng. — 2005. — Vol. 100. — №1. -P. 77-81.
7. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells protect against experimental liver fibrosis in rats / D.C. Zhao, J.X. Lei, R. Chen et al. // World J. Gastroenterol. — 2005.
- Vol. 11. - №22. - P. 3431-3440.
8. Cryopreserved fetal liver cell transplants support the chronic failing liver in rats with CCl4-induced cirrhosis / O.V. Ochenashko, N.A. Volkova, S.P. Mazur, et al. // Cell Transplant. — 2006. — Vol. 15. — №1. — P. 23-33.
9. Muretto, P. Reversibility of cirrhosis in patients cured of thalassemia by bone marrow transplantation / P. Muretto, E. Angelucci, G. Lucarelli // Ann. Intern. Med.
- 2002. - Vol. 136. - №9. - P. 667-672.
10. Transplantation of bone marrow7 cells reduces CCl4-induced liver fibrosis in mice / I. Sakaida, S. Terai, N. Yamamoto et al. // Hepatology. — 2004. — Vol. 40.
- №6. — P. 1304-1311.
