CC BY
34
УДК: 616.36-004-06:616.149-008.341.1-089.844
НАШ ОПЫТ ИНТРААРТЕРИАЛЬНОЙ ТРАНСПЛАНТАЦИИ МУЛЬТИПОТЕНТНЫХ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ПРИ ЛЕЧЕНИИ ЦИРРОЗА ПЕЧЕНИ, ОСЛОЖНЕННОГО ПОРТАЛЬНОЙ ГИПЕРТЕНЗИЕЙ
Р.М.АГАЕВ, А.Г.ПОПАНДОПУЛО, Р.Э.ДЖАФАРЛИ
OUR EXPERIENCE OF INTRAARTERIAL TRANSPLANTATION OF MULTYPATENT MESENCHYMAL STEM CELLS AT TREATING OF HEPATOCIRRHOSIS COMPLICATED BY PORTAL HYPERTENSION
R.M.AGAEV, A..G.POPANDOPULO, R.E.DJAFARLI
Азербайджанский медицинский университет, Баку, Азербайджан, Международный центр биотехнологий «Biostem» Института неотложной и восстановительной хирургии им. В.К.Гусака (НАМН), Донецк, Украина
Проанализированы результаты разработанного способа катетеризации общей печеночной артерии, используемого для трансплантации стволовых клеток при цирротическом поражении печени. Предложенный метод позволяет доставлять стволовые клетки в печень интраартериально, более эффективно, чем внутрипортальный способ трансплантации стволовых клеток для стимулирования регенерации пораженной паренхимы печени. Описанная методика после успешного эксперимента была использована при лечении 2 больных с циррозом печени, осложненным портальной гипертензией. Ключевые слова: цирроз печени, портальная гипертензия, стволовые клетки, трансплантация.
The results of worked-out ways of catheterization of general hepatic artery used for transplantation of stem sells at cirothic demage of liver have been analyzed. The offered method allows to deliver stem sells into the liver by intraarterial way more effective than intra-portal type of transplantation of stem sells for stimulating of regeneration of damaged liver parenchyma. A described method after successful experiment has been used at treating 2 patients with hepatocirrhosis complicated by portal hypertension. Key-words: hepatocirrhosis, portal hypertension, stem sells, transplantation.
В последние годы ведется активный поиск эффективных и доступных способов лечения цирроза печени (ЦП) и портальной гипертензии (ПГ), которые являются одной из актуальных проблем абдоминальной хирургии [4,5]. До настоящего времени ведущей в лечении ЦП и ПГ была поддерживающая терапия, направленная на стимуляцию регенерации печени и профилактику осложнений [8]. Однако большинство используемых медикаментозных способов коррекции малоэффективны, болезнь прогрессирует, вероятность возникновения летального исхода возрастает [5].
Известно много способов оперативной коррекции при ЦП в том числе различные виды наложения портокавальных сосудистых анастомозов, вмешательства на варикозно расширенных венах пищевода (ВРВП), с успехом применяются малоинвазивные методы (рентгеноэндоваскулярная хирургия, эндоскопическое склерозирование и лигирование ВРВП) [6]. В настоящее время сравнительно радикальным методом лечения больных с ЦП и ПГ считается пересадка печени [6]. Однако в ближайшие десятилетия рассчитывать на серийную трансплантацию печени при цирротическом ее поражении в востребованных объемах не приходится. Причина а этого дефицита донорских органов высокая стоимость операции, значительный риск развития послеоперационных осложнений со стороны как донора, так и реципиента.
В последние годы ученые сообщает об использовании при лечении ЦП и ПГ различных видов стволовых клеток [4,2]. Экспериментальными и клиническими исследованиями была доказана их эффективность в восстановлении функции печени и активации регенерации паренхимы при различных
ее поражениях [5].
Для трансплантации стволовых клеток при наличии цирроза печени предложен ряд методик [2]. В эксперименте проводилась сравнительная оценка эффективности интраартериальной трансплантации стволовых клеток (при лечении цирроза печени) и других методов введения (внутривенное, вну-трипортальное). Авторы наблюдали значительное усиление регенерации в периваскулярной зоне паренхимы печени при интраартериальном введении полученных стволовых клеток [4,5].
Однако, несмотря на преимущества указанного метода трансплантации, использование его ограничено вследствие развития большого количества осложнений (кровотечение или тромбоз при интра-операционном пункционном введении в общую печеночную артерию), а также отсутствия во многих клиниках оборудования для ангиографии (с целью введения стволовых клеток в общую печеночную артерию эндоваскулярно через бедренную артерию).
Цель. Оценка действия разработанного в эксперименте способа интраартериальной трансплантации стволовых клеток на состояние печеночной гемодинамики, а также предупреждение прогресси-рования цирроза печени.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Нами разработан в эксперименте и внедрен в клинику способ катетеризации печеночной артерии для трансплантации стволовых клеток при лечении больного ЦП и ПГ (клиническое наблюдение).
Катетеризацию собственной печеночной артерии осуществляли под общей анестезией лапаротомией. Производили верхнее срединную минилапаротомию.
На первом этапе выделяли правую желудочно-саль-никовую артерию с последующей ее мобилизацией с лигированием пристеночных сосудов. Рассечением стенки мобилизованной артерии вскрывали просвет сосуда и вводили в нее специальный катетер.
Для катетеризации использовали полихлорвиниловый катетер, применяемый для эпидуральной анестезии (№16-17), преимуществом которого является его длина (1 м) и сравнительно малый наружный диаметр, который составляет 1-1,2 мм.
Катетер из правой желудочно-сальниковой артерии (а. gastrica omentalis dexter) проводили через желудочно-двенадцатиперстную артерию (а. gastroduodenalis) в собственную печеночную артерию (a.hepatica propria). Наличие катетера в собственной печеночной артерии контролировали пальпаторно. Длина введенного катетера 9-11 см. Катетер фиксировали в правой желудочно-сальни-ковой артерии области культи посредством двух узловых лигатур. На последующем этапе операции в круглой связке печени бужированием последней формировали тоннель в продольном направлении, осуществляя реканализацию пупочной вены.
Через сформированный тоннель конец мобилизованной правой желудочно-сальниковой артерии с введенным в нее катетером выводили на переднюю брюшную стенку. Выведенный на переднюю брюшную стенку катетер фиксировали к коже, после чего лапаротомную рану зашивали послойно.
Выведение катетера на переднюю брюшную стенку посредством круглой связки печени имеет ряд преимуществ:
- обеспечивает возможность безопасного удаления катетера (после завершения сеансов трансплантации СК) без повторной операции;
- методика является сравнительно безопасным способом интраартериальной трансплантации предварительно подготовленной культуры аутологиче-ских СК в общую печеночную артерию, риск развития кровотечения при котором минимален;
- возможность повторения сеансов трансплантации СК.
Первую трансплантацию стволовых клеток посредством катетера осуществляли во время операции. Второй и третий сеанс проводили на 8-е сутки после операции, после чего катетер извлекали.
Для трансплантации использовали аутологиче-ские мезенхимальные мультипотентные стромаль-ные клетки (АММСК) (20 - 40 млн в 2,0 - 5 мл), которые предварительно выделяли из пунктата костного мозга пациента [1]. После введения культуры катетер повторно промывали физиологическим раствором.
Культуру АММСК человека предварительно выделяли из костного мозга, полученного при пункции крыла подвздошной кости (за 2 месяца до трансплантации АММСК). Аспират костного мозга разбавляли раствором Хэнкса (Биолот, Россия) в соотношении 1:2/5. В центрифужные пробирки емкостью 50 мл наливали градиент плотности Histopaque 1077 (Sigma, США) из расчёта 1 мл градиента на 1 мл костного мозга. Аккуратно наслаивали разбавленный
костный мозг на градиент. Затем центрифугировали пробирку при комнатной температуре в режиме 1800-2000 об/мин в течение 30-40 мин. Клетки интерфазы, содержащей МСК, собирали в центрифужную пробирку объемом 15 мл с небольшим количеством раствора Хэнкса, взвесь ресуспендировали. Центрифугировали пробирку при 800-1000 об/мин в течение 8-10 мин. Сливали надосадок, ресуспендировали осадок в растворе Хэнкса и дважды повторяли центрифугирование. Затем осадок смешивали с ростовой средой, содержащей DMEM/F12 (Sigma, США), 20% ЭТС (Биолот, Россия) и митогены. После этого взвесь высевали в пластиковые флаконы площадью 75 см2 (Nuclon, США) плотностью 1-2 x 105 /см2 и которые помещали в углекислотный инкубатор на трое суток (370С; 5% СО2). Затем среду меняли, параллельно удаляя не прикрепившиеся (гемопоэтиче-ские) клетки. В последующем замену среды осуществляли каждые 2 дня [1].
Для идентификации и характеристики клеточных линий мезенхимальных стволовых клеток учитывали основные критерии, рекомендованные Международным обществом клеточных технологий (ISCT) в 2006 году, которые использованы в нашей работе [5]. Среди них: а) способность стволовых клеток к адгезии к пластику в стандартных условиях культивирования; б) наличие более чем у 95% клеточных элементов позитивных маркеров СD105 (эндоглин), CD73 (экто-5'-нуклеотидаза) и CD90 (антиген тимо-цитов 1); в) наличие не более чем у 2% клеток негативных маркеров CD45, CD34, CD14 или CD11b, CD79? или CD19, HLA-DR; г) способность клеточной линии к in vitro дифференцировке остеобласты и адипоци-ты. Срок культивации АММСК 42 дня.
Как было отмечено ранее, с целью оценки эффективности использования в клинической практике пациенту с ЦП и ПГ было предложена методика ин-траартериальной трансплантации АММСК. Предварительно пациент был ознакомлен с планируемой методикой трансплантации, возможными побочными эффектами, осложнениями и др. В последующем пациента давал свое согласие в письменной форме.
КЛИНИЧЕСКОЕ НАБЛЮДЕНИЕ
Пациент А.А., 46 лет. Считает себя больным с 8.10.2010. Больной в эти сроки был госпитализирован вследствие развития желудочно-кишечного кровотечения из варикозно-расширенных вен пищевода. Маркеры вирусных гепатитов и цитомегалови-русной инфекции были отрицательными. У больного был диагностирован ЦП с синдромом портальной гипертензии алкогольной этиологии. Интенсивные реанимационные мероприятия оказались эффективными, кровотечение удалось остановить консервативными мероприятиями. Больного выписали с улучшением на амбулаторное лечение.
В 10.09.2011 г. (приблизительно через год) больной был повторно госпитализирован и обследован в том же лечебном учреждении. При эзофагогастроду-оденоскопии выявлено варикозное расширение вен пищевода III ст. 13.09.2011 г. после предварительной подготовки на варикозно расширенные вены нижней трети пищевода и кардиального отдела желудка
были наложены «кольца», после чего больной был выписан домой в удовлетворительном состоянии. В течение 2-х лет с момента первого эпизода желудочно-кишечного кровотечения рецидивов не было. Однако, несмотря на проводимое лечение, у больного сохранялось варикозное расширение вен пищевода II ст. По данным контрольных УЗИ, а также биохимических тестов отмечалось прогрессирование диффузных изменений паренхимы печени.
14.10.2013 г. в лаборатории «BIO STEM» Института неотложной хирургии им. В.К.Гусака АМН Украины г.Донецка был произведен забор костного мозга для выделения аутологичных мезенхимальных мультипотентных стромальных стволовых клеток. 8.12.2013 и 16.12.2013 г. в условиях 1-го хирургического отделения ОДКБ г.Донецка произведена интра-артериальная трансплантация АММСК по вышеуказанной методике.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Для оценки эффективности интраартериальной трансплантации АММСК пациента обследовали до операции и после трансплантации в динамике лечения. Больному проводили клинические анализы крови и мочи, биохимических показателей крови, ультразвуковую и допплерографическую оценку кровотока в сосудах портальной системы. Определяли показатели кровотока по воротной, печеночным, селезеночной венам, а также печеночной и селезеночной артериям. Изучали максимальную, среднюю и минимальную скорости, индекс резистентности в общей печеночной артерии, величину объемного кровотока и ряд других показателей.
В послеоперационном периоде регулярно осма-
тривалась рана пациента, а также область наложенной фистулы на предмет наличия кровотечения. При появлении каких-либо жалоб проводили внеочередные осмотры, а при необходимости и обследование.
Уже в ближайшие недели после операции больной отмечал улучшение общего самочувствия, уменьшение явлений слабости, недомогания. Цвет кожных покровов заметно востанавливался, наблюдалась прибавку массы тела.
После выписки из стационара после интраарте-риальной трансплантации АММСК больного наблюдали в течение года. В течение всего периода наблюдения у больного отмечалась допустимая активность трансаминаз (АЛТ, АСТ). Несмотря на нормальное содержание общего билирубина, долгое время сохранялся сравнительно высокий уровень прямой фракции билирубина (в пределах 1,1 - 5,6 мкмоль/л).
Наличие у больного цирроза печени с синдромом ПГ стало причиной осуществления в динамике наблюдения ультразвукового допплеровского исследования (УЗДИ) в А- и Б-режиме. При сравнении результатов контрольных ультразвуковых исследований у пациента в динамике лечения АММСК отмечены выраженные положительные изменения (рис.1). На изображениях, полученных при ультразвуковом исследовании, можно наблюдать состояние желчного пузыря и паренхимы печени в области ворот непосредственно перед трансплантацией АССК (рис. 1а), а также спустя 1 (рис. 1б), 3 (рис. 1в) и 6 месяцев (рис.1г) после лечения. В сравнении с предшествующим трансплантации исследованием отмечалось частичное уменьшение интенсивности фиброза и в области ворот печени, а также вокруг ложа желчно-
IL Ш т_-г
г
в
Рис 1. Состояние печени при ультразвуковом исследовании в динамике лечения.
^J I
jHÉÊ^I
1
w i I -W I I iVÎH 14 <ni„.i A
HJTF' I .........
<V Ш LT tad« I J-L.I
»J Ü.IJ FT I -t^t
Рис. 2. Допплерографическая оценка показателя кровотока в общей печеночной артерии через месяц после конечного сеанса трансплантации АММСК.
го пузыря. Кроме того, за счет соединительнотканного компонента заметно уменьшилась эхогенность паренхимы печени в указанном сегменте печени. Результаты УЗИ-допплер исследования (рис.2) показали также сужение диаметра мроЛае (на 2 мм в сравнении с нормой, р<0,01). Увеличение диаметра селезеночной вены сохранялись и в эти сроки. Важным диагностическим моментом явилось обнаружение увеличения в ближайшем периоде (через 1 мес.) после трансплантации АММСК увеличение диаметра основного ствола общей печеночной артерии на 2 мм (р<0,001). Это обстоятельство свидетельствует о артериализации и активизации кровообращения в печени, что совпало с литературными данными [7].
Для исследования гемодинамики печени мы с помощью ультразвукового допплеровского исследования также изучали максимальную, среднюю и минимальную линейную скорости кровотока в общей печеночной артерии, индекс резистентности, а также объемного кровотока в последней [3]. Как известно у больных с ЦП с наличием синдрома ПГ наблюдается гепатофугальный тип кровотока по воротной вене [7]. Наше исследование не показало патологического его направления.
До трансплантации АММСК показатель индекса резистентности (ИР) печеночной артерии у больного повышен до 0,76-0,62 (п = 0,58-0,72), что характерно для ЦП и связано с увеличением сопротивления паренхимы органа кровотоку в нем. Через 2 месяца после осуществления интраартериальной трансплантации АММСК ИР печеночной артерии соответствовал норме (0,63-0,68).
Сравнительная оценка показателей линейного и объемного кровотока на различных сосудах до и после трансплантации АММСК показала, что мак-
симальная линейная скорость кровотока (МЛСК) в портальной вене в послеоперационном периоде увеличивалась.
МЛСК до трансплантации АММСК у больного с ЦП и ПГ составила 8,2 см/с, что было ниже среднего показателя нормы (11,4±2,2 см/с) на 28,1% (р<0,001). Через 3 месяца после трансплантации АММСК МЛСК соответствовала нижней границе нормы (9,1-14,6 см/с) 10,8±2,3 см/с.
Таким образом, описанный способ катетеризации общей печеночной артерии является эффективным способом, не требующим использования дорогостоящего оборудования. Способ позволяет осуществлять трасплантацию АММСК неоднократно при минимальном риске развития осложнений (кровотечения, тромбоэмболические осложнения).
Как показали наши исследования, в динамике лечения больного с ЦП и ПГ внутриартериальное введение АММСК сопровождалось усилением регенерации в печеночной паренхиме, что подтверждалось гемодинамическими показателями печеночного кровотока.
Полученные нами данные позволяют рекомендовать использование предложенного способа катетеризации общей печеночной артерии для осуществления интраартериальной трансплантации стволовых клеток при лечении цирроза печени, осложненного портальной гипертензией.
ЛИТЕРАТУРА
1. Абдулкадыров К.М., Романенко Н.А., Старков Н.Н. Получение и клиническое применение периферических гемопоэтических стволовых клеток из пуповин-ной крови. Вопр онкол 2000; 46: 513-520.
2. Ерамищанцев А.К., Сухих Г.Т. Внутриорганная алло-трансплантация стволовых и прогениторных клеток
при лечении больных циррозом печени и портальной гипертензией. Анналы хир гепатол 2007; 12(2): 31-38.
3. Митьков В.В., Митькова М.Д., Федотов И.Г. и соавт. Оценка портального кровотока при циррозе печени. Ультразвук диагностика 2000; 4: 10-16.
4. Пышкин С.А., Димов П.Г., Пирогова И.Ю., Батанов А.Н. Стимуляция регенерации в лечении хронических гепатитов и циррозов печени. Анналы хир гепатол 2004, 9(1):60-69.
5. Степанова Н.С., Титова О.В. Особенности портального кровотока у больных хроническим гепатитом. Вестн Смоленской медицинской академии. Смоленск 2004; 1: 83-86.
6. Сакута Г.А., Кудрявцев Б.Н. Клеточные механизмы
регенерации цирротически измененной печени крыс. Цитология 2005; 47(5): 379-387.
7. Шалимов А.А., Шалимов С.А., Нечитайло М.Е., До-манский Б.В. Хирургия печени и желчевыводящих путей. Киев Здоров'я 1993; 512.
8. Iwao Т., Toyonaga A., Oho К. et al. Value of Doppler ultrasound parameters of portal vein and hepatic artery in the diagnosis of cirrhosis and portal hypertension. Amer J Gastroenterol 1997; 92(6): 1012-1017.
9. Piscaglia P., Gaiani S., Calderoni D. et al. Influence of liver fibrosis on hepatic artery Doppler resistance index in chronic hepatitis of viral origin. Scand J Gastroenterol 2001; 36(6): 647-652.
ПОРТАЛ ГИПЕРТЕНЗИЯ БИЛАН АСОРАТЛАНГАН ЖИГАР ЦИРРОЗИНИ ДАВОЛАШДА МУЛЬТИПОТЕНТ МЕЗЕНХИМАЛ УЗАК ХУЖАЙРАЛАРНИ ИНТРААРТЕРИАЛ ТРАНСПЛАНТАЦИЯСИ
БУЙИЧА БИЗНИНГ ТАЖРИБАМИЗ
Р.М.Агаев, А.Г.Попандопуло, Р.Э.Джафарли Озарбайжон тиббиёт университети, Баку, Озарбайжон, В.К.Гусаков номли Шошилинч ва тикловчи хирургия институтининг «Bюstem» биотехнологиялар халцаро маркази, Донецк, Украина
Жигарнинг цирротик шикастланишларида узак хужайраларнинг трансплантациясида кулланиладиган уму-мий жигар артериясини катетерлашнинг ишлаб чицилган усулни куллаш натижалари тахлил килинган. Ши-кастланган жигар паренхимасининг регенерациясини кучайтиришда ушбу усул узак хужайраларни жигарга ин-траартериал боришини таъминлаб, узак хужайраларни портал вена оркали трансплантация килишга нисбатан самаралирок эканлиги курсатилган. Муваффациятли тажрибалардан сунг таклиф килинаётган ушбу усул портал гипертензия билан асоратланган жигар циррози бор 2 беморда кулланилган.
