CC BY
330
Эффективность Фенотропила как родоначальника класса модуляторов с соразмерным влиянием при экспериментальном инсульте различной этиологии
В.И. Ахапкина
В статье представлены результаты исследования влияния оригинально-инновационного состава субстанции Фено-тропил или (Р8)-2-(2-оксо-4-фенилпирролидин-1-ил)ацетамид на течение и прогноз ишемического и геморрагического инсульта у крыс. Показано, что состав субстанции проявляет достоверно выраженный терапевтический эффект независимо от типа инсульта и возраста животных. Эффект препарата в исследованных дозах 100, 200 и 300 мг/кг проявляется в остром периоде уже после однократного применения, усиливаясь при курсовом введении, при этом значительно сокращается постинсультный восстановительный период. Фенотропил, как родоначальник класса модуляторов с соразмерным влиянием, оказывает при монотерапии положительный эффект на исход инсульта, предупреждая гибель животных в 100% случаев с устранением неврологического дефицита и восстановлением когнитивных функций. Он обеспечивает ограничение зоны поражения головного мозга и ускоряет процессы регенерации. Выявленные в эксперименте свойства Фенотропила показывают перспективность нового - модуляторного направления для профилактики и лечения тяжелых неврологических расстройств, связанных с сосудистой патологией головного мозга различной этиологии.
Ключевые слова: Фенотропил, модуляторы с соразмерным влиянием, модуляторное направление, ишемический инсульт, геморрагический инсульт, экспериментальные модели инсульта, окклюзия средней мозговой артерии, внут-римозговое кровоизлияние.
В настоящее время цереброваскулярные заболевания занимают одно из ведущих мест в мире среди причин смертности и инвалидности. По данным Всемирной организации здравоохранения, ежегодно регистрируется около 20 млн. случаев инсульта. Смертность от инсульта составляет 25%, и восстанавливаются примерно 20% от общего числа лиц, перенесших инсульт. В структуре эпидемиологических показателей инсульта, остававшегося до недавнего времени прерогативой пожилого и старческого возраста, просматривается очевидная тенденция к “омоложению”: заболевание получает всё большее распространение среди трудоспособной части населения в возрасте 25-55 лет. В России показатели заболеваемости и смертности от инсульта остаются одними из самых высоких среди развитых стран. Зарегистрировано свыше
1 млн. человек, перенесших инсульт, более чем у 80% из них имеется инвалидность различной степени тяжести, что достигает показателя распространенности 3,2 на 10000 населения с лидирующим положением среди всех причин первичной инвалидности. Ежегодно в нашей стране регистрируется приблизительно 400000 случаев инсульта, летальность в остром периоде достигает 35%.
Валентина Ивановна Ахапкина - главный научный
специалист, председатель научно-технического совета
ОАО “Валента Фармацевтика”, президент ФГИП “ВИРА”.
Инсульт - острое нарушение мозгового кровообращения, характеризующееся внезапным проявлением очаговых или общемозговых неврологических симптомов, сохраняющихся более 24 ч или приводящих к летальному исходу в более ранние сроки. Причины развития инсульта по-лимодальны. Профилактика первичного и повторного инсульта, ранняя диагностика, оперативность оказания специализированной медицинской помощи в период манифестации острого состояния и реабилитация - наиважнейшие факторы успеха в борьбе с этой тяжелой цереброваскулярной патологией. По характеру поражения выделяют два основных типа инсульта: ишемический (церебральный инфаркт) - результат внезапного нарушения кровоснабжения участка мозга и геморрагический - спонтанное (нетравматическое) внутричерепное кровоизлияние. В структуре инсульта ишемия составляет примерно 85%, из которых 15-20% приходится на тромботический характер поражения, 15-20% - на кардиоэмболический, 5-10% - на гемодинамический, 15-20% - на лакунарный и 20-30% - на криптогенный. При геморрагическом инсульте (ГИ) наиболее распространено внутримозговое (паренхиматозное) кровоизлияние (10-12% случаев). Субарахноидальное кровоизлияние встречается в 1-5% случаев, внутрижелудочко-вое кровоизлияние составляет менее 1% [9, 15-17, 19].
Существует два дополняющих друг друга направления в терапии ишемического инсульта - антитромботическая
терапия (фибринолитики, антикоагулянты, антиагреганты) и нейропротекция. Эффективность первого направления доказана в большом количестве клинических исследований. Что касается фармакологической нейропротекции, то на сегодняшний день ведется активный поиск таких препаратов. При ГИ применяют препараты, нормализующие артериальное давление, поддерживающие гомеостаз организма, по показаниям применяется нейрохирургическое вмешательство. Ранняя реабилитация при ГИ не менее важна, чем при ишемической форме заболевания. Высокая медико-социальная значимость проблемы инсульта делает крайне актуальным дальнейший поиск эффективных и безопасных лекарственных средств.
Модуляторная и дивергентная концепции (В.И. Ахапки-на, 2006) с разработанными для них собственными специфическими (облигатными) критериями позволили открыть два новых базовых класса лекарственных средств, разработать для них систематизацию, открыть новые подходы и направления в лечении и профилактике различных заболеваний и патологических состояний [8]. Концептуализация модуляции (соразмерное влияние) и дивергентности (расхождение влияния) - результат собственного многолетнего исследовательского труда по сопоставлению изменений, происходящих в организме в обычных условиях, в условиях космического полета, авиационного полета с перегрузками скорости (соответственно, и давления), при глубоководном морском погружении и высокогорном подъеме с разработкой соответствующих методов и средств адаптации функционального состояния человека к этим условиям.
Данные концепции базируются на фундаментальном принципе, получившем название “балансирующей матрешки” в структурно-функционально-патогенетической модели построения (включая организацию и управление) любого организма, начиная с одноклеточного, где сопряжению модуляторно-дивергентных отношений на разных уровнях отводится ведущая роль, а стимуляции и подавлению - ведомая, т.е. как частные регулируемые/недостаточно регулируемые проявления в структуре ведущих. Природа дивер-гентности - стратегия, а модуляции - тактика/оперативная тактика. Наибольшее многообразие сопряжений обеспечивается более чувствительной и более мобильной, чем ди-вергентность, модуляцией, заполняющей “поле дивергентности” в объемно-пространственно-временном измерении. В абсолютно упрощенной графической форме дивергентные ритмы можно представить в виде синусоид, сопряженных между собой в цепочки восьмерками, а модуляторные -в виде диаграмм, “прошивающих” поля и места сопряжения дивергентности. Одно и то же вещество, синтезируемое в организме, играет в функционально-патогенетической иерархии различные роли в зависимости как минимум от места, времени, состояния, концентрации с главенствующей, но не независимой значимостью нервной системы у человека и животных.
Когда ведомые процессы становятся по разным причинам в каких-то звеньях относительно ведущими, то разви-
вается расстройство, болезнь разной степени тяжести, старение (с аут-направлением). Применение препаратов с однозначно направленной по преимуществу активностью зачастую не дает желаемого устойчивого результата, приводит к возникновению новых расстройств, называемых побочными действиями. Подобные препараты демонстрируют недостаточность регуляции по принципу “доза-эффект”, зачастую неспособны устранить причину заболевания, восстановить нарушенный баланс сопряжений в структурно-функционально-патогенетической организации и управлении на конкретном уровне/в конкретном звене. Определение “преимущественно направленная активность” применимо к любому классу препаратов - модуляторы, дивергенты, стимуляторы, ингибиторы, поскольку, воздействуя даже точечно, невозможно избежать совокупного прямого и опосредованного влияния.
Модуляторы (соразмерное влияние) и дивергенты (расхождение влияния) сочетают в базовой активности и стимуляцию, и подавление. У истинных модуляторов их действие соразмерно по направлению и выраженности эффекта в зависимости от состояния исследуемых показателей при разных типах нормы и разных видах и типах расстройства нормы. У дивергентов перемена парадигмы влияния расходится по преимуществу в зависимости от дозы. Пластичность влияния, включая изменение направления влияния, связана в любом случае с конформацией органических молекул, в том числе полимерных. Она зависит и от того, какие молекулы, в какой очередности взаимодействуют друг с другом. На это указывает и полиморфизм нейронов с различными подтипами рецепторов.
К дивергентам можно отнести препараты Фенибут, Пан-тогам и Мексидол, которые в низких терапевтических дозах оказывают преимущественно стимулирующее действие, а в более высоких - подавляющее (вплоть до снотворного у Фенибута, что характерно для у-аминомасляной кислоты (ГАМК) в высоких концентрациях, обладающей функционально-дивергентной активностью). Регуляторная активность модуляторов, реализуясь через триггерную 38^3Н трансмиссию в своем диапазоне [3, 7], вероятно, связана с конформационно-реверсивными и таутомерными структурно-функциональными особенностями веществ, ограничивающих экстенсивно-репрессивное влияние в попеременном диапазоне пределов от максимума до минимума дивергентности. Эта трансмиссия регулирует/ограничивает дивергентность, и наоборот [8]. Сегодня, при наличии синтетических модуляторов и дивергентов, есть основания говорить о том, что крайняя степень проявления стимуляции или подавления соразмерного влияния может иметь место в некоторых случаях, но продолжается ограниченное время до достижения приемлемой функциональной нормы, нарушение которой связано либо с истощением клеточного потенциала, либо с его чрезмерным угнетением.
Родоначальником класса модуляторов с соразмерным влиянием является разработанный нами оригинально-инновационный состав (ОИС) Фенотропил или (Я8)-2-(2-ок-
со-4-фенилпирролидин-1-ил)ацетамид [4]. Изначально Фенотропил или ^карбамоил-метил-4-фенил-2-пирроли-дон был зарегистрирован (патентованное лекарственное средство) для практического здравоохранения в 2003 г в качестве ноотропа (код АТХ группы: N06BX) из класса пси-хоаналептиков (код АТХ: N06) с иными сопутствующими компонентами действия, указанными в инструкции по применению. Непосредственный автор и разработчик препарата от истока и поныне, автор оригинального патентованного названия/original brand name - Фенотропил (Phenotropilum, Phenotropil) с зарегистрированным приоритетом (1992 г.), патентообладатель и лицензиар - автор настоящей статьи. Фенотропил входит в аптечку Международной космической станции, комплектуемую российской стороной, зарегистрирован и экспортируется из России в другие страны. Производство фармацевтической субстанции осуществляет ФГУП “Технолог”, а таблеток - ОАО “Валента Фармацевтика”. Учитывая, что препарат первоначально разрабатывался нами под цели и задачи космической медицины, ему было присвоено в свое время название-легенда Карфедон (Carphedonum, Carphedon), составленное в данном случае из слогов химического названия ^карбамоил-метил-4-фенил-2-пир-ролидон до степени смешения по правописанию и фонетической созвучности с кардиотропными средствами. Названия-легенды, заменявшие шифр, присваивались перспективным проектам специального назначения согласно правилам Института медико-биологических проблем -ИМБП (ГНЦ РФ ИМБП РАН), штатным сотрудником которого автор настоящей статьи являлась более 24 лет. ИМБП (ГНЦ РФ ИМБП РАН) как юридическое лицо прекратил участие в проекте в силу сложившихся в стране в конце ХХ века форс-мажорных социально-экономических обстоятельств.
Открытие новых свойств и характеристик Фенотропи-ла полностью изменило существовавшее ранее представление о соединении и как о химическом (начиная с температуры плавления), и, что самое главное, как о биологически активном (не имеющем аналогов) продукте. Фактически соединение для медицины было открыто нами заново [1-8]. Оригинально-инновационный состав обладает уникальной в фармакологии специфической модуляторной активностью с широким комплексом соразмерных эффектов и сопутствующих компонентов действия.
Спектр специфического соразмерного влияния ОИС Фенотропила проявляется на разных функционально-патогенетических уровнях, характеризуясь при этом юнимо-дуляторным и промоутмодуляторным характером действия в сочетании с психомодуляторной и психоперандмоду-ляторной, нейромодуляторной, операндмодуляторной, инкретомодуляторной, иммуномодуляторной и цитомоду-ляторной активностью. Нейролептический, стимулирующий, антидепрессивный, анксиолитический, противосудо-рожный, ноотропный, мнемотропный, тренинг-стресс-факторный, адаптогенный и многие другие компоненты
действия, проистекая из ведущей модуляторной активности, также соразмерны, что принципиально отличает их от препаратов из других классов и групп, включая психостимуляторы и подавляющие (угнетающие, ингибирующие) средства.
Введение в рациональное химическое название (Я8)-обозначения указывает на то, что состав биологически активных веществ антиподов продукта установлен, свойства и характеристики изомеров определены. Модуляторной активностью обладают, как установлено, и входящие в состав вещества антиподы, характеризующиеся конфор-мационно-реверсивными свойствами, способностью при определенных условиях переходить друг в друга. Если исходно в кристаллическом состоянии рацемическое соединение (Я8)-2-(2-оксо-4-фенилпирролидин-1 -ил)ацетамид представляет из себя два вещества в одном составе, то в различных средах обитания - как четыре или даже более веществ из одного состава, что объясняет его беспрецедентно широкий спектр выявленных фармакологических эффектов. В разделенном состоянии оптически чистые энантиомеры уступают по активности хроматографически чистому рацемату, их производство в десятки раз дороже, требует применения биологически инертных стабилизаторов, легко отделяемых от действующих веществ в растворах и биологических средах.
Авторы далеки от мысли считать Фенотропил идеальным модулятором, продолжают поиск новых веществ и комбинаций веществ, но именно данный препарат является родоначальником нового класса лекарственных средств, и именно эти выявленные эффекты и механизмы действия, результаты сравнительных исследований заложили инновационную базу в АТХ, позволив, в свою очередь, систематизировать различные компоненты действия, проистекающие из той или иной ведущей активности, связанные с ней и зависимые от нее, имеющие в разных случаях разных классов средств либо эксфолиативные, либо переменные признаки в диапазоне доз терапевтической широты.
По признакам семейственно-групповой химической принадлежности согласно существующим правилам Фено-тропил относится к производным 4-диафенилпирроли-дин-2-он (Фепирон, 4-фенилпирролидин-2-он - транквилизатор с выраженной токсичностью) из группы 4-диа-пирролидина (наличие асимметричного атома углерода в 4-м положении молекулярного ядра). Он априори не принадлежит и не может принадлежать к производным пирро-лидона из группы пирролидина с фантазийным названием “рацетамы” (пирацетам, анирацетам, прамирацетам, леве-тирацетам), не содержит в себе молекулу пирацетама. Применение к (Я8)-2-(2-оксо-4-фенилпирролидин-1-ил)ацет-амиду таких вымышленных названий, как “4-фенилпираце-там”, “фенилпирацетам”, “фонтурацетам”, не является обоснованным и правомерным.
Целью настоящего исследования явилось изучение эффективности ОИС субстанции Фенотропила (ЛД50
Рис. 1. Схема дистальной ОСМА. Стрелкой указано место ОСМА.
Рис. 2. Срез головного мозга крысы с ишемическим инсультом.
1000 мг/кг у белых беспородных мышей-самцов против ранее известного показателя ЛД50 800 мг/кг) при экспериментально вызванном инсульте различной этиологии. Показатель ЛД50 (полулетальная доза) важен для обеспечения безопасности по терапевтическому индексу (отношение высшей суточной дозы к токсической у животных). Инсульт любого типа - экстренный случай, когда зачастую требуется применение в клинике высших суточных доз препаратов. С учетом фармакокинетики Фенотропила (выведение из организма в течение 3 сут даже у спортсменов высшей квалификации при больших физических и психоэмоциональных нагрузках) терапевтический индекс в клинике приобретает особое значение.
Активность ОИС Фенотропила в отношении экспериментально вызванного инсульта исследовалась у крыс разного возраста, распределенных по группам случайным образом. Эксперименты проведены на белых беспородных крысах-самцах (110 крыс с массой тела 200-250 г) на модели ГИ и крысах-самцах линии Wistar (110 крыс с массой тела 250-300 г) на модели ишемического инсульта. Фено-тропил применялся в дозах 100, 200 и 300 мг/кг при внут-рибрюшинном и интрагастральном введении с дистиллированной водой или физиологическим раствором (ФР). Для приготовления стандартных растворов необходимо учитывать, что субстанция препарата без участия вспомогательных веществ мало растворима в воде и ФР в обычных условиях и хорошо растворима при нагревании. Относительная стабильность таких экстемпоральных растворов сохраняется при комнатной температуре около 2 ч. Контролем служили интактные, ложнооперированные и “инсультные” группы крыс, получавшие ФР или дистиллированную воду. Для оценки достоверности результатов использовали параметрический критерий статистической обработки данных по методу Стьюдента (t-test) и критерий х2 с помощью компьютерной программы В^а1
Влияние различных веществ на течение инсульта в эксперименте изучают на различных моделях ишемического инсульта и ГИ, которые создают у животных - чаще всего путем пережатия или разрушения сосудов оболочек или
глубоких структур мозга [10-14, 18, 21-24]. Ишемический инсульт моделировали у крыс Wistar методом дистальной окклюзии средней мозговой артерии (ОСМА) [21], а ГИ - у беспородных крыс по методике локального кровоизлияния (интрацеребральная посттравматическая гематома) [18].
Локальную ишемию головного мозга вызывали у наркотизированных хлоралгидратом животных (300 мг/кг вну-трибрюшинно). При операции голову крысы жестко фиксировали в боковом положении левой стороной кверху. После разреза кожи посередине между левой ушной раковиной и левым глазом раздвигали волокна височной мышцы до поверхности черепа. С помощью бормашины (диаметр бора 0,5 мм) в месте шва чешуйчатой кости с лобной делали отверстие диаметром приблизительно 3-4 мм, обнажая место пересечения средней мозговой артерии (СМА) с нижней мозговой веной. Под микроскопом с увеличением 14,0 х 3,3 подводили под левую СМА специальный металлический крючок и методом электрокоагуляции производили ОСМА проксимальнее места ее бифуркации на фронтальную и париетальную ветви (рис. 1). При этом в поле зрения микроскопа наблюдалось прекращение тока крови по СМА выше места окклюзии. После операции рану послойно ушивали и проводили ипсилатеральную окклюзию общей сонной артерии. Ложнооперированной группе крыс электрокоагуляцию и окклюзию не проводили.
Для оценки влияния Фенотропила на зону ишемии использовали метод гистохимического прокрашивания ткани головного мозга [20]. Для этого на 4-е сутки (через 72 ч) после ОСМА животных под наркозом декапитировали, головной мозг извлекали из черепной коробки. Готовили 6 фронтальных срезов толщиной 1 мм, которые прокрашивали 2,3,5-трифенилтетразолия хлоридом. Проводили двустороннее сканирование и компьютерную планиметрию каждого окрашенного среза. Определяли площадь ипсила-терального полушария (ИП) и зоны поражения (ЗП) на каждом срезе. На рис. 2 представлен образец среза с указанием зоны ишемического поражения, а на рис. 3 - примеры по 5 срезам в экспериментальных группах. Процентное отношение объема ЗП к объему ИП вычисляли по формуле
V(
+ S
(ЗП)^(ИП) _ (^ЗП)
где S(3n) и S(Mn) - площади ЗП и ИП для каждого среза [23].
Исследовали изменения неврологического статуса (неврологический дефицит) по стандартной шкале McGraw Stroke Index в модификации И.В. Ганнушкиной у животных с ишемическим инсультом после ОСМА, не получавших препарат (контрольная группа, вводился ФР внутрибрюшинно), и у животных, получавших внутрибрю-шинно по схеме Фенотропил 100, 200 и 300 мг/кг/сут в течение 3 сут [13, 14]. Регистрировалось количество животных с легкой симптоматикой (до 2,5 балла по шкале МсGraw Stroke Index) - вялость движений, слабость конечностей, односторонний полуптоз, тремор, манежные движения и с тяжелыми неврологическими нарушениями (от 3
+
Ш&
11 to
>тт
ш ш ш
Срез 1
Срез 2
Срез 3
Срез 4
Срез 5
Рис. 3. Примеры фронтальных срезов головного мозга крыс после операции ОСМА (зона ишемии указана стрелкой): а - контроль с ОСМА, б - Фенотропил (начиная за 60 мин до операции, 200 мг/кг/сут) + ОСМА, в -ОСМА + Фенотропил (после операции, 200 мг/кг/сут).
до 10 баллов) - парезы и параличи конечностей, а также боковое положение. Трем группам крыс Фенотропил начинали вводить за 60 мин до операции, а трем группам - через 5 мин после операции. Через 24 ч после операции исследовали способность животных к обучению (условный рефлекс пассивного избегания - УРПИ) по стандартной методике в установке Lafayette Instrument Co (США) и еще
через 24 ч - сохранность обучения при наблюдении в течение 3 мин [10-12].
В процессе операции и в ходе исследований гибели крыс не было. При анализе неврологического статуса, регистрируемого по шкале McGraw Stroke Index, выявлено, что во всех группах животных с ишемическим инсультом и у ложнооперированных крыс наблюдались нарушения неврологического статуса в виде тремора, снижения раздражительности, вялости, замедленности движений, ограничения подвижности, одностороннего полуптоза, динамика которых изменялась в течение 72 ч после операции (рис. 4). У ложнооперированных животных с введением ФР или Фенотропила в дозе 200 мг/кг также отмечались однотипные изменения неврологического статуса, которые компенсировались в течение 72 ч на 92 и 100% соответственно. При этом в группах животных, получивших Фенотропил за 60 мин до ОСМА и через 5 мин после операции, тремор и замедленность движений уже в 1-е сутки наблюдались значительно реже, чем в контрольных группах. В контрольной группе у животных с ОСМА вялость, замедленность движений, тремор присутствовали и на 2-е, и на 3-и сутки. Выраженность и некоторое нарастание левостороннего полуптоза, вероятно, отражают развитие послеоперационного отека. Манежные движения отсутствовали во всех группах, за исключением группы животных с ОСМА, получившей ФР. В 1-е сутки исследований эффективность Фенотропила (% животных с неврологической симптоматикой) в дозах 100, 200 и 300 мг/кг в группах, получивших его за 60 мин до операции, составила 63, 63 и 55% соот-
100
1S
о
л
II
О s О. О ь >5
о о
80
SB 60
Q Ш
СО Q. 5 CQ
Ь Ф ш 1 -0- ° -Є- з ГО £
s
*
40
20
1 -е сутки | 2-е сутки | 3-й сутки Ложнооперированные
1 -е сутки | 2-е сутки | 3-й сутки Фенотропил + ОСМА
1 -е сутки | 2-е сутки | 3-й сутки ОСМА + Фенотропил
ФР ■ Фенотропил 100 мг Фенотропил 200 мг ■ Фенотропил 300 мг
Рис. 4. Влияние Фенотропила на неврологический дефицит по шкале McGraw Stroke Index у крыс при ишемическом инсульте.
50 г
1 -е сутки 2-е сутки 3-й сутки
Фенотропил + ОСМА ОСМА + Фенотропил
Рис. 5. Сопоставление эффективности Фенотропила при ишемическом инсульте по совокупности показателей за 72 ч с момента манифестации заболевания.
ветственно по сравнению с контролем (ОСМА + ФР), а в группах, получивших Фенотропил в тех же дозах, но через 5 мин после операции, - 50, 55 и 53% соответственно по сравнению с контролем. В среднем эффективность препарата в группах Фенотропил + ОСМА и ОСМА + Фенотропил составила 60 и 53% соответственно. На 2-е сутки улучшение показателей неврологического статуса в контрольной группе составило 8-16%, а в группах с введением Фенотропила до и после операции - 72 и 68% соответственно. Через 72 ч после операции признаки неврологического дефицита сохранились у 50% животных контрольной группы с ОСМА, и только у 17 и 19% крыс на фоне введения Фено-тропила до и после операции соответственно сохранились признаки одностороннего полуптоза.
В ходе исследования сохранности процессов обучения и памяти на модели УРПИ с воспроизведением памятного следа через 24 ч после обучения (табл. 1) было выявлено,
Таблица 1. Влияние Фенотропила на обучение (УРПИ) через 24 ч после ОСМА с воспроизведением памятного следа через 24 ч после обучения
Группа (п = 10 в каждой группе) Латентное время первого захода в темный отсек, с
Контрольная (ФР) 101,2 ± 19,0
ФР+ОСМА 48,5 ± 17,5*
Фенотропил 100 мг/кг + ОСМА 93,6 ± 22,3**
Фенотропил 200 мг/кг + ОСМА 104,6 ± 18,8**
Фенотропил 300 мг/кг + ОСМА 90,6 ± 22,6**
ОСМА + Фенотропил 100 мг/кг 83,3 ± 26,1**
ОСМА + Фенотропил 200 мг/кг 84,5 ± 19,6**
ОСМА + Фенотропил 300 мг/кг 67,6 ± 18,4**
Примечание. Различия достоверны (р < 0,05) по сравнению с показателями: * - контрольной группы (ФР), ** - группы ФР + ОСМА.
что ОСМА на 53% снижала показатели обучения и памяти по сравнению с таковыми в контрольных группах животных. Применение Фенотропила сохраняло способность к обучению и воспроизведению УРПИ практически на уровне показателя контрольной группы (ФР) и превысило показатель группы ФР + ОСМА. В группе ОСМА + Фенотропил 300 мг/кг этот показатель не отличался от такового в группе Фенотропил 100 мг/кг + ОСМА, что также свидетельствует о достаточно высокой активности Фенотропила в 1-е сутки после операции при всех исследованных дозах препарата.
Через 72 ч после операции (табл. 2) у контрольных животных (ОСМА + ФР) отношение ЗП/ИП составляло 11,8%. У крыс, получавших Фенотропил в дозах 100, 200 и 300 мг/кг за 60 мин до операции и в течение 3 сут после операции, отмечено выраженное изменение этого отношения: оно уменьшалось на 36, 43 и 48% соответственно в зависимости от дозы. При послеоперационном введении Фенотропила (через 5 мин) наблюдался менее выраженный эффект в отношении этого показателя в остром периоде, чем у предыдущих групп животных, но тем не менее в зависимости от дозы (100, 200 и 300 мг/кг) снижение отношения ЗП/ИП составило 4, 6 и 17% соответственно. Отмечено, что зависимость доза-эффект была наиболее значимой в случаях применения Фенотропила в остром состоянии, при котором требуются более высокие суточные дозы препарата и, по всей вероятности, более длительные курсы лечения для сокращения ЗП, хотя по картине восстановления неврологического статуса и когнитивных функций значимой разницы в зависимости доза-эффект в эксперименте не выявлено.
Влияние Фенотропила в дозах 100, 200 и 300 мг/кг на сокращение ЗП головного мозга в течение 72 ч составило 35, 45 и 47% соответственно при введении за 60 мин до операции и 24, 35 и 25% соответственно при введении через 5 мин после операции (см. табл. 2). По совокупности всех исследуемых показателей (рис. 5) упреждающее введение препарата было несколько более эффективным. Однако на 2-е сутки эффективность в группах сравнялась и
Таблица 2. Влияние Фенотропила на объем ЗП головного мозга при ишемическом инсульте (ОСМА) у крыс
Группа Объем ИП (мм3), % Объем ЗП (мм3), % ЗП/ИП, %
ОСМА + ФР 765,6 ± 3,77 90,0 ± 7,75 11,8 ± 0,98
Фенотропил 100 мг/кг + + ОСМА -3,0 -35* -36*
Фенотропил 200 мг/кг + + ОСМА -3,4 -45* -43*
Фенотропил 300 мг/кг + + ОСМА +4,1 -47* -48*
ОСМА + Фенотропил 100 мг/кг +3,0 -24* -4
ОСМА + Фенотропил 200 мг/кг +4,0 -35* -6
ОСМА + Фенотропил 300 мг/кг +5,0 -25* -17
* р < 0,05.
через 72 ч не имела статистически достоверных различий. Это свидетельствует, с одной стороны, о важном значении препарата в качестве профилактического средства, с другой - о его роли в качестве средства лечения возникшего тяжелого поражения.
С целью моделирования ГИ у крыс, наркотизированных хлоралгидратом (400 мг/кг внутримышечно), проводили трепанацию черепа и затем при помощи мандрен-ножа и стереотаксиса осуществляли деструкцию мозговой ткани в области внутренней капсулы с последующим (через 2-3 мин) введением в место повреждения крови, взятой из-под языка животного (0,02-0,03 мл). Таким способом создавалась локальная аутогеморрагическая билатеральная гематома (диаметр 2 мм, глубина 3 мм) без существенных повреждений вышерасположенных образований мозга и неокортекса. Во время операции и сразу после нее погибло 40% из 75 крыс. У выживших животных с ГИ (n = 45) в последующем регистрировали различные неврологические, когнитивные и другие нарушения поведения. Контролем служили группа интактных и группа ложноопе-рированных животных (ложнооперированные крысы - это животные, которых наркотизировали, проводили трепанацию черепа, но не осуществляли разрушения мозговой ткани). Животным опытных групп интрагастрально с помощью зонда вводили ФР (n = 25) и Фенотропил с ФР из расчета 100 мг/кг (n = 20) через 5 ч после операции однократно ежедневно в течение 7 дней.
Для оценки нарушения поведения и состояния животных после ГИ использовали традиционно применяемые для этих целей методы, такие как выявление неврологического дефицита по шкале оценки инсульта МсGraw Stroke Index, регистрация мышечного тонуса (тест подтягивания на горизонтальной перекладине), регистрация координации двигательной активности на вращающемся стержне, исследование норкового рефлекса, исследование УРПИ в установке Lafayette Instrument Co и ориентировочно-исследовательского поведения (по методике “открытого поля”). Регистрировали динамику нарушений, вызванных интрацеребраль-ной посттравматической гематомой, и влияние Фенотропи-ла на поведение крыс, а также гибель животных на протяжении 14 дней после операции. Поведение и состояние крыс оценивали на 1-е, 3-и, 7-е и 14-е сутки после операции. Тяжесть состояния оценивали по сумме соответствующих баллов. Фиксировали количество крыс с легкой симптоматикой (до 2,5 балла по шкале МсGraw Stroke Index - вялость движений, слабость конечностей, односторонний полуптоз, тремор, манежные движения) и с тяжелыми проявлениями неврологических нарушений (от 3 до 10 баллов - парезы и параличи конечностей, а также боковое положение). Животные были распределены по группам случайным образом.
В 1-е сутки после операции при оценке неврологических отклонений у крыс с ГИ контрольной группы регистрировали разнообразные неврологические нарушения: вялость и замедленность движений - у 100%, слабость конечностей - у 90%, манежные движения - у 40%, парезы и
Таблица 3. Влияние Фенотропила на неврологический дефицит у крыс с ГИ (по шкале McGraw Stroke Index) в 1-е сутки после операции
Количество животных с различной неврологической симптоматикой, %
Неврологические
симптомы ложно- ГИ
опериро- ванные ФР Фенотропил (100/300 мг/кг)
Вялость, замедленность движений 4G 1GG* 30**/20**
Слабость конечностей 3G * О ся 30**/20**
Манежные движения G * о 4 0**/0**
Парез 1-4 конечностей G 3G* 20**/15**
Паралич 1-4 конечностей G 3G* * * О * * о
Примечание. Здесь и в табл. 4-10: различия достоверны (р < < 0,05, х2) по сравнению с показателями: * - группы ложноопери-рованных крыс, ** - группы ГИ + ФР.
Таблица 4. Влияние Фенотропила на мышечный тонус животных в тесте горизонтальной перекладины при ГИ
Группа Количество животных, не подтянувшихся на горизонтальной перекладине
1-е сутки 3-и сутки 7-е сутки 14-е сутки
абс. % абс. % абс. % абс. %
Интактные (без операции) G/1G G G/1G G G/1G G G/1G G
Ложноопери- рованные 1/1G 1G 2/1G 2G 1/1G 1G G/9 G
ГИ + ФР 11/25 43* 9/18 5G* 5/13 38* 4/11 * 6 3
ГИ + Фенотропил 1GG мг/кг 5/2G 25** 4/2G 20** 3/2G 15** 2/2G 10**
ГИ + Фенотропил 3GG мг/кг 6/2G * * О 3 2/2G 10** G G** G G**
параличи 1-4 конечностей - у 30 и 40% животных соответственно. У ложнооперированных крыс эти нарушения проявлялись в 40% случаев в виде вялости и заторможенности движений и в 30% - в виде слабости конечностей (табл. 3). Выраженных неврологических нарушений, таких как манежные движения по кругу, парезы и параличи конечностей, в этой группе не наблюдалось. Фенотропил после двукратного введения (через 5 ч и на 1-е сутки после операции) в дозе 100 мг/кг выраженно ослаблял проявления неврологического дефицита. На фоне его применения полностью отсутствовали манежные движения и параличи 1-4 конечностей. Случаи вялости и замедленности движений составляли только 30%, а парезов 1-4 конечностей - 20%. Полученные результаты указывают на высокую эффективность Фено-тропила при его применении в первые сутки после ГИ.
У животных контрольной группы с ГИ (ФР) частота нарушений мышечного тонуса на 1-е и 3-и сутки составляла 43 и 50% соответственно, а на 7-е и 14-е сутки - 38 и 36% соответственно (табл. 4). В группе с введением Фенотро-пила ослабление мышечного тонуса на 1-е и 3-и сутки наблюдалось у 25 и 20% животных соответственно, на 7-е сутки - только у 15% животных, а к 14-м суткам этот пока-
Таблица 5. Влияние Фенотропила на координацию движений животных в тесте вращающегося стержня при ГИ и после ин-трацеребральной посттравматической гематомы
Количество животных, не удержавшихся
на вращающемся стержне (3 об/мин)
Группа в течение 2 мин
1-е сутки 3-и сутки 7-е сутки 14-е сутки
абс. % абс. % абс. % абс. %
Интактные 0/10 0 0/10 0 0/10 0 0/10 0
(без операции)
Ложноопери- 2/10 20 3/10 30 1/10 10 1/9 10
рованные
ГИ + ФР 12/25 48* 9/18 50 5/13 38* 5/11 45*
ГИ + Фенотропил 100 мг/кг 5/20 25** 4/20 20** 0/20 0** 0/20 0**
ГИ + Фенотропил 300 мг/кг 3/20 15** 3/20 15** 0/20 0** 0/20 0**
Таблица 6. Влияние Фенотропила на норковый рефлекс у крыс с ГИ в 1-е сутки после операции
Группа Латентное время захода в темную камеру при обучении норковому рефлексу, с
Интактные (без операции) 12,8 ± 1,2
Ложнооперированные 13,03 ± 0,9
ГИ + ФР 35,2 ± 10,1*
ГИ + Фенотропил 100 мг/кг 18,0 ± 2,1**
ГИ + Фенотропил 300 мг/кг 14,7 ± 3,0**
затель снизился до 10%, причем различие с показателем животных с инсультом в контрольной группе было статистически достоверным (см. табл. 4).
При исследовании динамики нарушений координации движений в тесте вращающегося стержня у крыс с ГИ указанные нарушения на 1-е и 3-и сутки отмечались у 48 и 50% животных соответственно, на 7-е и 14-е сутки - у 38 и 45% соответственно (табл. 5). Фенотропил в дозе 100 мг/кг
Таблица 7. Влияние Фенотропила на воспроизведение УРПИ у крыс с ГИ
24 ч после обучения 3 сут после обучения
Группа латентное время захода в темную камеру, с количество крыс, не вошедших в темную камеру, % латентное время захода в темную камеру, с количество крыс, не вошедших в темную камеру,%
Интактные (без операции) 155,9 ± 23,3 80 152,6 ± 14,1 80
Ложно- опериро- ванные 143,3 ± 17,2 70 137,8 ± 15,8 65
ГИ + ФР 68,0 ± 24,6 25* 74,4 ± 32,7 28*
ГИ + Фено-тропил 100 мг/кг 168,5 ± 22,4 76** 149,7 ± 18,4 70**
ГИ + Фено-тропил 300 мг/кг 152,0 ± 25,9 * * 0 7 140,8 ± 15,1 70**
ослаблял нарушения координации движений у крыс начиная с 1-х суток после операции: в 1-е сутки количество животных с нарушениями составило 25%, на 3-и сутки - 20%, а на 7-е и 14-е сутки ни у одного животного не отмечалось нарушений координации движений (см. табл. 5).
При исследовании сохранности норкового рефлекса грызунов, основанного на врожденном рефлексе - стремлении к ограниченному затемненному пространству, было установлено, что интактные и ложнооперированные крысы при помещении их на освещенную платформу быстро, с коротким латентным периодом переходят в темную камеру (табл. 6). У крыс с ГИ норковый рефлекс сохранялся, но со значительным увеличением (в 2,8 раза) латентного периода по сравнению с таковым в группе интактного контроля и в 2,7 раза - по сравнению с показателем у ложноопериро-ванных животных, что свидетельствует о выраженной заторможенности крыс с ГИ + ФР Фенотропил при двукратном введении в 1-е сутки в дозе 100 мг/кг способствовал сохранению норкового рефлекса у животных - на фоне его использования латентный период захода крыс в темную камеру с освещенной площадки увеличивался только в
1,4 раза, т.е. по сравнению с показателем животных с инсультом в контрольной группе это время сокращалось практически в 2 раза (см. табл. 6).
При исследовании воспроизведения (через 24 ч после обучения) УРПИ было установлено, что интактные, ложно-оперированные животные и крысы с инсультом на фоне применения Фенотропила хорошо помнили об ударе током в темной камере: 80, 70 и 76% животных из этих групп соответственно не заходили в опасный (темный) отсек. Остальные крысы заходили в темный отсек с большим латентным периодом (табл. 7). В контрольной группе крыс с ГИ, которым вводился ФР, только 25% животных не зашли в темную камеру, т.е. помнили об ударе током, а у 75% крыс память была нарушена. Через 3 сут сохранность УРПИ практически не изменилась во всех группах.
Таблица 8. Влияние Фенотропила на воспроизведение УРПИ у крыс после интрацеребральной посттравматической гематомы
7 сут после обучения 14 сут после обучения
латентное количество латентное количество
Группа время крыс, не время крыс, не
захода вошедших захода вошедших
в темную в темную в темную в темную
камеру, с камеру, % камеру, с камеру,%
Интактные 143,1 ± 18,4 75 130,9 ± 23,7 60
(без
операции)
Ложно- 123,4 ± 26,2 60 115,0 ± 20,2 55
опериро-
ванные
ГИ + ФР 26,8 ± 3,7* 15* 21,2 ± 10,4* 8*
ГИ + Фено- 120,3 ± 60** 104,8 ± 55**
тропил ± 23,1** ± 27,7**
100 мг/кг
ГИ + Фено- 148,2 ± 70** 121,3 ± 60**
тропил ± 12,4** ± 20,5**
300 мг/кг
Таблица 9. Влияние Фенотропила на ориентировочно-исследовательское поведение и двигательную активность животных в условиях методики “открытого поля” в остром периоде и на 3-и, 7-е и 14-е сутки после ГИ
Группа Горизонтальная двигательная активность Вертикальная двигательная активность Обследование отверстий Суммарный показатель
Интактные (без операции) 15,6 ± 2,3 1-е сутки 5,6 ± 1,4 3,3 ± 0,9 24,5 ± 4,6
Ложнооперированные 14,7 ± 1,9 2,9 ± 0,6* 3,2 ± 0,7 20,8 ± 3,2
ГИ + ФР 7,3 ± 1,1* 2,7 ± 0,8 1,8 ± 0,3* 11,8 ± 2,2*
ГИ + Фенотропил 100 мг/кг 8,8 ± 3,5 4,4 ± 2,1** 1,3 ± 0,5 14,5 ± 6,9
ГИ + Фенотропил 300 мг/кг 9,1 ± 1,5** 4,7 ± 1,1** 2,2 ± 0,3 16,0 ± 2,9**
Интактные (без операции) 14,0 ± 1,2 3-и сутки 5,1 ± 1,1 3,2 ± 0,8 22,3 ± 3,1
Ложнооперированные 13,7 ± 2,3 3,2 ± 0,8 3,1 ± 0,5 20,0 ± 3,6
ГИ + ФР 6,2 ± 1,2* 2,7 ± 0,4 1,7 ± 0,5 10,6 ± 2,1*
ГИ + Фенотропил 100 мг/кг 15,2 ± 5,4** 4,5 ± 1,5** 1,9 ± 0,7 21,6 ± 6,1**
ГИ + Фенотропил 300 мг/кг 14,3 ± 2,5** 4,3 ± 0,4** 2,6 ± 0,8** 21,2 ± 3,7**
Интактные (без операции) 13,6 ± 2,3 7-е сутки 5,3 ± 1,4 4,1 ± 1,2 23,0 ± 4,9
Ложнооперированные 13,4 ± 2,1 4,1 ± 2,8 2,9 ± 0,6 20,4 ± 5,5
ГИ + ФР 7,8 ± 1,9* 3,2 ± 1,3 2,4 ± 0,5 13,4 ± 3,7*
ГИ + Фенотропил 100 мг/кг 20,9 ± 4,1** 10,9 ± 3,2** 4,6 ± 1,3** 36,4 ± 8,6**
ГИ + Фенотропил 300 мг/кг 15,5 ± 1,5** 8,1 ± 2,2** 4,7 ± 0,8** 28,3 ± 4,5**
Интактные (без операции) 12,4 ± 2,5 14-е сутки 5,6 ± 1,3 3,5 ± 1,2 21,5 ± 5,0
Ложнооперированные 13,4 ± 2,2 6,2 ± 1,4 3,3 ± 0,6 22,9 ± 4,2
ГИ + ФР 8,1 ± 2,4* 3,7 ± 1,4* 3,2 ± 1,3 15,0 ± 5,1*
ГИ + Фенотропил 100 мг/кг 12,2 ± 2,8** 6,9 ± 1,9** 3,0 ± 0,7 22,1 ± 5,4**
ГИ + Фенотропил 300 мг/кг 14,4 ± 3,2** 5,8 ± 0,4** 4,1 ± 0,6** 24,3 ± 4,2**
При изучении воспроизведения УРПИ на 7-е и 14-е сутки в группе интактного контроля и у ложнооперированных крыс было выявлено, что животные также достаточно хорошо помнили о негативной ситуации (табл. 8). В сравнении с этими данными, на 7-е и 14-е сутки после ГИ и обучения память животных на получение болевого раздражения в темной камере была достоверно нарушена, причем это нарушение было более выраженным, чем на 1-е и 3-и сутки после операции. Так, через 7 сут только 15% животных с ГИ помнили о негативном раздражении, а остальные крысы заходили в темный опасный отсек уже через 27 с. Через 14 сут только у 8% животных этой группы сохранялся УРПИ. Фенотропил при курсовом применении в дозе 100 мг/кг обеспечивал сохранение памяти у крыс на 7-е и 14-е сутки после операции по созданию ГИ. Под влиянием препарата наблюдалось статистически достоверное увеличение числа животных, помнивших негативную ситуацию, по сравнению с показателем контрольной группы крыс с инсультом. Практически в 5 раз увеличивалось и латентное время захода в темную камеру по сравнению с таковым у крыс с инсультом без применения Фенотропила. Таким образом, препарат обладает выраженной способностью восстанавливать нарушенную при ГИ память, как показано на модели УРПИ. Результаты проведенного исследования указывают на способность Фено-тропила не только оказывать протекторное влияние, но и предотвращать и ограничивать нарушения, а также восстанавливать высшие интегративные функции головного мозга при развитии цереброваскулярной патологии.
При изучении ориентировочно-исследовательского поведения в условиях методики “открытого поля” в 1-е сутки после операции у крыс с ГИ отмечалось значительное (в
2 раза) снижение показателей двигательной активности и исследовательского поведения. Сходные показатели наблюдались и на 3-и, 7-е и 14-е сутки после ГИ, хотя животные и были несколько активнее (табл. 9). Фенотропил при регистрации эффекта через 3 сут после ГИ способствовал увеличению суммарных показателей поведения до уровня показателей интактных и ложнооперированных животных. После 7 дней введения Фенотропила суммарный показатель двигательного поведения по сравнению с таковым в группе ГИ + ФР увеличился в 2,7 раза и превышал суммарный показатель интактной группы на 69,3%, а через 14 сут
Таблица 10. Влияние Фенотропила на выживаемость животных после ГИ на протяжении 14 сут
Группа Количество погибших животных
1-е сутки 3-и сутки 7-е сутки 14-е сутки
абс. % абс. % абс. % абс. %
Интактные (без операции) 0/20 0 0/20 0 0/20 0 0/20 0
Ложноопери- рованные 0/23 0 1/23 4 0/22 0 2/22 9
ГИ + ФР 7/32 23* 5/23 22* 5/18 28* 2/13 15*
ГИ + Фенотропил 100 мг/кг 0/20 0** 0/20 0** 0/20 0** 0/20 0**
ГИ + Фенотро-пил 300 мг/кг 0/20 0** 0/20 0** 0/20 0** 0/20 0**
после операции активирующий эффект препарата на поведение крыс сохранялся и указанный показатель полностью соответствовал таковому в интактной группе.
Как было отмечено выше, во время операции и непосредственно после нее погибло 40% крыс. В течение 7 сут после операции в группе ложнооперированных крыс гибели животных не наблюдалось, на 14-е сутки 2 из 22 крыс погибли. В интактной группе в период исследования гибели животных не было. В группе ГИ + ФР в 1-е сутки погибло 23% животных. К 14-му дню этот показатель достиг 59,4% от общего числа в группе (табл. 10). Фенотропил в дозе 100 мг/кг интрагастрально ежедневно в течение 7 сут полностью предупреждал гибель крыс с ГИ, и на протяжении последующих 7 сут (всего - 14 сут исследований) гибели животных не отмечалось. Следовательно, в экспериментальных исследованиях Фенотропил обеспечил 100% выживаемость крыс с ГИ. Данный факт указывает на уникальную способность Фенотропила предотвращать гибель животных с инсультом.
Таким образом, полученные результаты исследования свидетельствуют о перспективности применения в неврологии препаратов, обладающих модуляторным эффектом, с целью профилактики и лечения инсульта, коррекции его последствий и предупреждения развития рецидивов. Показано, что Фенотропил, как модулятор с соразмерным влиянием, при монотерапии оказывает существенное положительное влияние на исходы экспериментального ишемического и геморрагического инсульта у животных различного возраста с массой тела от 200 до 300 г. Его эффект проявляется уже после однократного введения, усиливаясь при курсовом применении. Препарат обеспечивает восстановление нарушенных неврологических функций животных, ограничивает зону поражения головного мозга и ускоряет процессы регенерации с сохранностью жизненно важных локомоторных и когнитивных функций. Начиная с 1-х суток введения Фенотропила на его фоне наблюдается положительная динамика всех исследованных показателей с полной компенсацией их дефицита при курсовом применении. Каких-либо отрицательных побочных реакций в экспериментальных исследованиях не выявлено. Кроме того, Фенотропил в 100% случаев предупреждал гибель животных при ГИ, а в группе без его использования частота летального исхода составила 40% в начале эксперимента и достигла почти 60% к окончанию наблюдения. Результаты проведенных исследований подчеркивают необходимость скорейшего внедрения инъекционной формы препарата для применения в порядке оказания неотложной помощи больным с острой цереброваскулярной патологией, когда использование таблетированной формы затруднено либо практически неосуществимо. Необходимо также отметить, что эффекты ОИС Фенотропила проявляются четче и более выражены, чем это было нами описано ранее. Известно, что чем выше доза препарата, тем больше количество сопровождающих его примесей при сохранении их масс-про-центного соотношения. Индивидуальные примеси Фено-тропила (исходный продукт и промежуточные продукты
синтеза) биологически высокоактивны, относятся к рацемическим соединениям. ЛД50 ОИС Фенотропила не ограничивает его применение в более высоких дозах по экстренным показаниям. Входящие в состав Фенотропила вещества-антиподы не только не ухудшают, но и улучшают свойства и характеристики препарата по всем исследованным физико-химическим и фармакологическим показателям, описанным нами в предыдущих публикациях. Таким образом, применение наряду с другими препаратами инновационного лекарственного средства Фенотропил с профилактической и лечебной целью при цереброваскулярной патологии различного генеза является экспериментально обоснованным и, вероятно, способно внести весомый вклад в решение важнейшей задачи снижения показателей заболеваемости и смертности от инсульта в нашей стране.
Список литературы
1. Ахапкин Р.В., Ахапкина В.И. // Сб. матер. XIX Российского национального конгресса “Человек и лекарство”. М., 2012. С. 350.
2. Ахапкин РВ. // Сб. матер. XIX Российского национального конгресса “Человек и лекарство”. М., 2012. С. 465.
3. Ахапкин РВ., Ахапкина В.И. // Рус. мед. журн. Неврология и психиатрия. 2012. № 19. С. 952.
4. Ахапкина В.И., Ахапкин РВ. Патент RU № 2480214 на изобретение “Состав, обладающий модуляторной активностью с соразмерным влиянием, фармацевтическая субстанция (варианты), применение фармацевтической субстанции, фармацевтическая и парафармацевтическая композиция (варианты), способ получения фармацевтических составов” с приоритетом от 22 сентября 2011 г
5. Ахапкина В.И. // Сб. матер. XIX Российского национального конгресса “Человек и лекарство”. М., 2012. С. 351.
6. Ахапкина В.И., Ахапкин РВ. // Сб. матер. XIX Российского национального конгресса “Человек и лекарство”. М., 2012. С. 465.
7. Ахапкина В.И., Ахапкин Р.В. // Рус. мед. журн. Неврология и психиатрия. 2012. № 19. С. 933.
8. Ахапкина В.И., Ахапкин Р.В. // Рус. мед. журн. Неврология и психиатрия. 2012. № 29. С. 1445.
9. Верещагин Н.В., Варакин Ю.Я. // Журн. неврол. и психиатр. Прилож. “Инсульт”. 2001. № 1. С. 34.
10. Воронина Т.А. // Вестн. РАМН. 2000. Т. 9. С. 27.
11. Воронина Т.А., Середенин С.Б. // Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. М., 2000. С. 126-130.
12. Воронина Т.А., Островская Р.У // Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. М., 2000. С. 153-158.
13. Ганнушкина И.В. Функциональная ангиоархитектоника головного мозга. М., 1977. С. 224.
14. Ганнушкина И.В. // Журн. невропатол. и психиатр. 1996. № 1. С. 14.
15. Гусев Е.И. // Журн. неврол. и психиатр. Прилож. “Инсульт”. 2003. № 9. С. 3.
16. Гусев Е.И., Скворцова В.И. Ишемия головного мозга. М., 2001.
17. Гусев Е.И. и др. // Журн. неврол. и психиатр. Прилож. “Инсульт”. 2003. № 8. С. 4.
18. Макаренко А.Н. и др. Способ моделирования геморрагического инсульта. Авт. свид. № 1767518 от 03.11.1990.
19. Штульман Д.Р, Левин О.С. Неврология. Справочник практического врача. М., 2005. С. 385-434.
20. Bederson J.B. et al. // Stroke. 1986. V. 17. P 1304.
21. Chen S.T. et al. // Stroke. 1989. V. 17. № 4. Р 738.
22. Jackowski A. et al. // J. Cereb. Blood Flow Metab. 1990. V. 10. P. 835.
23. Roda J.M. et al. // Stroke. 1995. V. 26. № 10. Р 1888.
24. Smith S. et al. // Neuroscience. 1997. V. 77. № 4. P 1123. j
