Эффект синтетических пептидных агонистов соматостатина на рост перевиваемых опухолей мышей Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

ЭФФЕКТ СИНТЕТИЧЕСКИХ ПЕПТИДНЫХ..

57

УДК 616-006.6-092.4:577.112.6:615.277.3

1 2 J 2 2 2

А.Н. Балаев , В.Н. Осипов , В.Е. Фёдоров , Л.И. Смирнова , А.П. Смирнова , Л.П. Сушинина , С.В. Устинкина2, З.С. Смирнова2, Л.М. Борисова 2, М.П. Киселева2 ЭФФЕКТ СИНТЕТИЧЕСКИХ ПЕПТИДНЫХ АГОНИСТОВ СОМАТОСТАТИНА НА РОСТ ПЕРЕВИВАЕМЫХ ОПУХОЛЕЙ МЫШЕЙ

1ЗАО «Фарм-Синтез», Москва

2ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН, Москва

Контактная информация

Осипов Василий Николаевич, старший научный сотрудник лаборатории химического синтеза

НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей

адрес: 115478, Москва, Каширское шоссе, 24; тел. +7(916)412-61-43

e-mail: [email protected]

Статья поступила 27.03.2013, принята к печати 09.07.2013.

Резюме

Исследовано влияние синтетических пептидных агонистов соматостатина как в обычной, так и в пролонгированной формах на перевиваемые опухоли мышей: рак шейки матки, эпидермоидную карциному лёгкого Льюис и аденокарциному молочной железы (Ca-755).

Ключевые слова: агонисты соматостатина, противоопухолевая активность, синтетические пептиды.

A.N. Balaev1, V.N. Osipov2, V.E. Fedorov1, L.I Smirnova2, A.P. Smirnova2, L.P. Sushinina2, S. V. Ustinkina2, Z.S. Smirnova 2, L.M. Borisova 2, M.P. Kiseleva2 SYNTHETIC PEPTIDE SOMATOSTATINE AGONIST EFFECT ON GROWTH OF TRANSPLANTED TUMORS OF MICES

1CJSC «PHARM-SINTEZ», MOSCOW

2FSBI «N.N. Blokhin RCRC» RAMS, Moscow

Abstract

Investigated the antitumor activity of synthetic peptide somatostatin agonists on models of transplanted tumors in mice: cervical cancer, Lewis lung epidermoid carcinoma and mammary adenocarcinoma (Ca-755) as in the ordinary and in the long-acting forms.

Key words: somatostatine agonists, antitumor activity, synthetic peptides.

Введение

Нейроэндокринные опухоли органов брюшной полости и забрюшинной клетчатки, включая и карциноидные опухоли, являются сравнительно распространёнными. Их частота составляет 25-50 новых наблюдений на 1 млн. населения в год. Ежегодная смертность при этих заболеваниях составляет до 30 % от числа выявленных больных [2; 6; 7].

Вследствие своего взаимодействия с сомато-статиновыми рецепторами опухоли агонисты соматостатина (как, например, Октреотид) подавляют секрецию гормонов и оказывают антипролифера-тивное действие. На основании такого механизма действия эти вещества не только уменьшают симптомы, связанные с гормональной активностью опухоли, но и замедляют или останавливают ее рост [3; 8; 9].

Проведённые ранее исследования цитоток-сической активности [1] пептидных агонистов соматостатина, содержащих фрагмент -Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-, на клеточных линиях опухолей человека, экспрессирующих рецепторы соматостатина: карциномы простаты человека КМСар, LNCap-LN3, LNCap-clon ГСС и нейробластома человека 8И-8У5У, показали достоверно значимое антипроли-феративное действие.

Поэтому было решено проверить их противоопухолевую активность на перевиваемых опухолях мышей в двух лекарственных формах: в виде раствора и пролонгированной (депо) форме.

Материалы и методы

ПГ-46 (H-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-OMe) синтезирован известным ранее методом [5], синтез ПГ-114 (H-Cys(Acm)-Phe-D-Trp-Lys-Thr-OMe диацетат) осуществлён по [1], Октреотид, чистотой 99,5%+, синтезирован на ЗАО «Фарм-Синтез» (г. Москва).

Все пептиды применялись в двух лекарственных формах: депо (в растворе маннита) и в виде раствора (в физ. р-ре) на перевиваемых опухолях мышей: РШМ-5, LLC и аденокарциноме молочной железы Ca-755. Лечение проводили через 48 ч после перевивки опухоли. Путь и режимы введения, дозы указаны в таблицах.

Критериями оценки противоопухолевого эффекта служили: ТРО, % и увеличение продолжительности жизни (Т/С, %). Минимальные критерии активности - торможение роста опухоли >50 %, увеличение продолжительности жизни >25 %.

Переносимость препаратов оценивали по ранней гибели мышей по сравнению с контрольными животными и состоянию внутренних органов животных (масса селезенки), изменению массы тела по сравнению с исходной.

Статистическая значимость противоопухолевого эффекта по отношению к нелеченному контролю определялась по методу Фишера-Стьюдента. Различия между сравниваемыми группами считались статистически достоверными при р<0,05.

Группы формировались с учетом получения статистически достоверных результатов: контроль-

58

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

ЛЕЙКОЦИТАРНЫЕ ИНТЕГРИНЫ..

ная группа состояла не менее чем из 10 мышей, опытная группа - из 8-10 животных. Опыты на каждой модели повторяли дважды.

Депо формы пептидов (микросферы 10-90 микрон) были изготовлены методом двойной эмульсии. К раствору пептида в воде добавляют раствор полимера RG503H (poly-d,l-lactide-co-glycolide) в хлористом метилене. Смесь гомогенезируют и выливают в раствор стабилизатора эмульсии (раствор натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы и манита в воде). Перемешивают до получения устойчивой эмульсии и выливают её в водный раствор твина-80. Продолжают перемешивание до полного испарения хлористого метилена. Центрифугируют образующиеся микросферы, просеивают через сита 90 микрон, промывают водой для отмывания стабилизатора эмульсии, снова центрифугируют и лиофилизируют. Получают микросферы с содержанием 30 мг пептида в 1 г микросфер.

Результаты и обсуждение

Данные представленные в табл. 1 показывают, что на РШМ-5 противоопухолевая эффективность аналогов соматостатина ПГ-46 и Октреотида в депо-форме в дозе 4 мг/кг (доза соответствует 20 мг при пересчете дозы для человека) при внутримышечном введении ниже минимального критерия противоопухолевой активности по ТРО [4]. В то же время ПГ-114 в депо-форме в дозе 4 мг/кг вызывал кратковременный статистически значимый противоопухолевый эффект - торможение роста РШМ-5 на 3 день после введения препарата составляло 69 %, а к 10 дню снижалось уже до 48 %.

На РШМ-5 при увеличении вводимой внутримышечно однократно дозы депо-формы до 50 мг/кг противоопухолевая активность выявлена у ПГ-46 и составляет 60 % ТРО на 3 день после введения препарата (табл. 2). Терапевтический эффект снижался к 9 дню после проведения лечения до 43 % ТРО. ПГ-114 в депо-форме на 3 день после введения препарата тормозил рост РШМ-5 на 52 % (р>0,05), но к 9 дню противоопухолевый эффект повысился до 65 % ТРО и становится статистически значимым (р=0,05). Однако к 16 дню противоопухолевая активность ПГ-114 снижается до 31 % ТРО. Тогда как у Октреотида в депо-форме при повышении вводимой дозы до 50 мг/кг терапевтический эффект оставался ниже минимального критерия противоопухолевой активности по ТРО. ПГ-114 в физиологическом растворе в дозе 10 мг/кг при введении внутримышечно 5 раз с интервалом в 7 дней, на 3 день после первого введения препарата, оказывал терапевтический эффект практически равный минимальному критерию противоопухолевой активности (ТРО=49 %). Растворитель манит не проявлял противоопухолевого действия, а следовательно не влиял на эффективность аналогов гипо-таламического гормона соматостатина

При изучении противоопухолевой активности аналогов гипоталамического гормона соматостатина в разных лекарственных дозах и при разных путях введения на LLC было показано, что только ПГ-114 растворимый в воде при подкожном и внутримышечном введении проявлял статистически значимый противоопухолевый эффект (табл. 3). Так, непосредственно после окончания ежедневного подкожного введения препарата в течение 5 дней, на 7 день после перевивки опухоли ТРО составляло 79 %, к 13 дню опыта ТРО снижалось до 50 %, а к 17 дню до 39 %. Однако следует отметить, что даже ТРО=39 % статистически

значимое. ПГ-114 растворимый в воде при внутримышечном введении проявлял более слабый, но статистически значимый противоопухолевый эффект только на 7 день после перевивки опухоли - ТРО составляло 56 %. ПГ-114 в депо-форме на LLC не проявлял противоопухолевой активности как при разных режимах, так и путях введения. Отсутствие эффективности Октреотида в депо-форме свидетельствует о низкой экспрессии или отсутствии Рц (1,3,5) сомато-статина, с которыми препарат должен был связаться в клетках перевиваемых опухолях РШМ-5 и LLC.

Изучение противоопухолевой активности на Са-755 аналогов гипоталамического гормона сомато-статина в растворимой в воде форме при ежедневном подкожном введении в течение 5 дней в дозе 10 мг/кг показало, что ПГ-46 проявляет слабое противоопухолевое действие равное 52 % ТРО. В то же время Ок-треотид в той же лекарственной форме и при том же пути введения оказывал длительное в течение 10 дней статистически значимое противоопухолевое действие. ПГ-114 в растворимой форме на Са-755 не проявлял противоопухолевого действия.

Выводы

1. В результате проведенных исследований установлено, что спектр противоопухолевого действия на изученных перевиваемых моделях опухолевого роста мышей 3 пептидных агонистов гормона со-матостатина различается. Так, ПГ-46 в депо-форме в дозе 50 мг/кг проявляет кратковременный статистически значимый противоопухолевый эффект равный 60 % ТРО на РШМ-5 на 3 день после введения препарата. Кроме того, в растворимой в воде лекарственной форме при ежедневном подкожном введении в течение 5 дней в дозе 10 мг/кг ПГ-46 проявляет слабое противоопухолевое действие равное 52 % ТРО на Са-755.

2. Установлено, что ПГ-114 в депо-форме оказывает кратковременный противоопухолевый эффект на РШМ-5 в дозе 4 мг/кг на 3 день после введения препарата (69 % ТРО), а в дозе 50 мг/кг более длительный на 3 и 9 дни после лечения (52 % и 65 % ТРО). Максимальный статистически значимый терапевтический эффект наблюдается на 9 день после введения препарата и составляет 65 % ТРО.

3. Показано, что на LLC в растворимой в воде форме ПГ-114 при подкожном введении в течение 5 дней вызывает статистически значимый противоопухолевый эффект в течение 10 дней: 79 % - 50 % -39 %, однако при этом не вызывает увеличения продолжительности жизни опытных мышей по сравнению с контрольными животными.

4. Установлено, что Октреотид проявляет статистически значимый противоопухолевый эффект в течение 10 дней только на Са-755 в растворимой лекарственной форме при ежедневном подкожном введении в течение 5 дней в дозе 10 мг/кг, ТРО составляет 48-67 %. Максимальное противоопухолевое действие препарат оказывает на 10 день после перевивки опухоли (на 4 день после окончания введения препарата) равное 67 % ТРО.

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

ЭФФЕКТ СИНТЕТИЧЕСКИХ ПЕПТИДНЫХ.

59

Таблица 1

Терапевтическая эффективность аналогов гипоталамического гормона соматостатина в депо-форме в дозе 4 мг/кг на РШМ-5

Препарат ТРО, % (дни после введения препаратов) СПЖ, дни Т/С, %

3 10 17

Контроль - - - 26,3 ± 3,6 -

ПГ-46 46 16 9 25,8 ± 2,6 98

ПГ-114 69* 48 25 25,8 ± 2,4 98

Октреотид 36 25 9 24,5± 3,1 93

Маннит 1 18 10 25,3 ± 2,8 98

*р = 0,05 по отношению к контролю

Таблица 2

Терапевтическая эффективность аналогов гипоталамического гормона соматостатина в разных лекарственных формах на РШМ-5_____

Препарат Доза (мг/кг) х n введений ТРО,% (дни после введения препаратов) СПЖ, дни Т/С, %

3 9 16

Контроль - - - - 22,6 ± 3,7 -

ПГ-46 депо-форма 50 х 1 60* 43 0 22,1 ± 3,6 100

ПГ-114 депо-форма 50 х 1 52 65* 31 22,5 ± 2,6 100

ПГ-114 в физ.растворе 10/24 х 5 49 47 16 23,1 ± 3,2 95

Октреотид депо-форма 50 х 1 45 20 +6 21,9 ± 2,3 100

Маннит 0,1 мл х 1 5 12 +2 21,8 ± 2,1 100

*р < 0,05 по отношению к контролю

Таблица 3

Терапевтическая эффективность аналогов гипоталамического гормона соматостатина в разных лекарственных дозах и при разных путях введения на LLC ___

Препарат Режим введения Путь введения ТРО, % (дни после перевивки опухоли) СПЖ, дни Т/С, %

7 13 17 22

Контроль - - - - - - 40,0 ± 2,6 -

ПГ-114 депо-форма 50 х 1 в/м 5 11 9 3 38,3 ± 5,4 96

50 х 1 п/к 15 3 10 6 39,0 ± 2,7 97

25 х 2** в/м +13 13 16 6 35,8 ± 2,7 89

ПГ-114 растворимый 10/24 х 5 в/м 56* 11 17 5 38,8 ± 4,7 97

10/24 х 5 п/к 79* 50* 39* 24 40,3 ± 2,9 101

Октреотид депо-форма 50 х 1 в/м +15 4 6 +4 37,6 ± 5,9 96

50 х 1 п/к 5 36 16 +4 40,6 ± 4,2 102

25 х 2** в/м +36 24 14 +7 39,0 ± 4,0 97

*р < 0,05 по отношению к контролю; **двукратное введение с интервалом 7 дней.

Таблица 4

Терапевтическая эффективность аналогов гипоталамического гормона соматостатина в растворимой форме при ежедневном подкожном введении в течение 5 дней в дозе 10 мг/кг на Са-755_

Препарат ТРО,% (дни после перевивки опухоли) СПЖ (дни) Т/С, %

7 10 13 17 20

Контроль - - - - - 20,6 ± 4,6 -

ПГ-46 (мономер) 26 52* 31 28 14 22,4 ± 5,9 109

ПГ-46 (димер) 0 11 33 40 49 20,4 ± 2,4 100

ПГ-114 19 37 37 44 20 17,5 ± 2,6 95

Октреотид 48* 67* 58* *63 47 23,6 ± 7,4 114

*р < 0,05 по отношению к контролю

Литература

1. Балаев А.Н., Осипов В.Н., Фёдоров В.Е. и др. Синтез и изучение цитотоксической активности аналогов гипоталамического гормона соматостатина // Российский биотерапевтический журнал. - 2012. -Т. 11, № 4. - С. 47-53.

2. Горбунова В.А., Орел Н.Ф., Кузминов А.Е. Современные направления лечения нейроэндокринных опухолей // Современная онкология. - 2010. - №1. - С. 7-12.

3. Егоров А.В., Кондрашин С.А., Фоминых Е.В. и др. Аналоги соматостатина в диагностике и лечении нейроэнокринных опухолей // Анналы хирургической гепатологии. - 2009. - Т. 14, № 4. - С. 1-7.

4. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. (Под редакцией А.Н.Миронова, ФГБУ НЦЭСМП Минздрава России.) - М.: Гриф и К, 2012 - 944 с.

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

ЛЕЙКОЦИТАРНЫЕ ИНТЕГРИНЫ...

5. Смирнова Л.И., Устинкина С.В., Смирнова А.П. и др. Средство, обладающее противоопухолевым действием. Патент № 2254139.

6. Massironi S., Sciola V., Peracchi M. et al. Neuroendocrine tumors of the gastro-entero- pancreatic system // World J. Gastroenterol. - 2008. - 14(35). - P. 5377-84.

7. Modlin I.M, Oberg K., Chung D.C. et al. Gastroenteropancreatic neuroendocrine tumors // Lancet Oncol. -2008. - 9. - P. 61-72.

8. Susini C., Buscail L. Rationale for the use of somatostatin analogs as antitumor agents // Ann Oncol. - 2006. - 17(12). - P. 1733-42.

9. PollakM.N., SchallyA.V. Mechanism of antineoplastic action of somatostatin analogs // Proc Soc Exp Biol Med. - 1998. - 217(2). - P. 143-52.

О.А. Бочарова, В.А. Ильенко, Р.В. Карпова, Е.В. Бочаров, А.Ю. Барышников

ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТЬ ЖИЗНИ МЫШЕЙ ВЫСОКОРАКОВОЙ ЛИНИИ СВА УВЕЛИЧИВАЕТСЯ ПОД ВОЗДЕЙСТВИЕМ ФИТОАДАПТОГЕНА В ПРОФИЛАКТИЧЕСКОМ РЕЖИМЕ

ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН, Москва

Задача исследования. Оценить влияние комплексного фитоадаптогена при профилактическом применении на продолжительности жизни мышей линии СВА, наследственно предрасположенных к развитию гепатокарцином. Материалы и методы. Фитомикс-40 - стандартизованный препарат, включающий компоненты 40 растительных экстрактов; обладает иммуномодулирующим, адгезиогенным, интерфероногенным, антимутагенным, ан-тиоксидантным, радиопротекторным эффектами. В работе использовали 140 мышей линии СВА: 1 группа (n=70) - контрольная, мыши получали в качестве питья воду; 2 группа (n=70) - опытная, мыши получали фито-микс-40 с питьевой водой в профилактическом режиме в течение 1-го месяца постнатального развития, включая критический период дифференцировки ткани печени. Среднюю продолжительность жизни (СПЖ) и медиану выживаемости определяли по методу Каплан-Мейера.

Результаты. СПЖ мышей контрольной группы в среднем не достигала 22 месяцев. Медиана выживаемости мышей контрольной группы составила 21,1 месяц. Профилактическое применение фитомикса-40 способствовало удлинению жизни опытных мышей на 14,5 % (р<0,001). Медиана выживаемости при этом повысилась на 23 % и составила 25,9 месяцев. Ни одно животное контрольной группы не пережило 1000 дней. В опытной группе указанный срок (около 33 месяцев) пережило 2 мыши (р<0,001). Повышение выживаемости мышей опытных групп сопровождалось увеличением экспрессии лейкоцитарных интегринов LFA-1 и Mac-1, снижением сывороточного уровня интерлейки-нов-6 и -10, уменьшением частоты возникновения гепатом, лучшим соматическим состоянием животных. Выводы. Профилактическое введение комплексного фитоадаптогена с адгезиогенным действием при спонтанном канцерогенезе увеличивает выживаемость экспериментальных животных; полученные результаты могут быть перспективны для разработки способа профилактики опухолей, возникающих при соответствующей генетической предрасположенности.

Р.В. Карпова, О.А. Бочарова, В.А. Ильенко, Е.В. Бочаров, А.Ю. Барышников ЛИМФОЦИТАРНАЯ ИНФИЛЬТРАЦИЯ ОПУХОЛЕЙ ПЕЧЕНИ МЫШЕЙ ВЫСОКОРАКОВОЙ ЛИНИИ СВА

ПРИ ПРОФИЛАКТИЧЕСКОМ ВОЗДЕЙСТВИИ ФИТОАДАПТОГЕНА

ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН, Москва

Задача исследования. Оценить морфологические изменения в ткани печени мышей линии СВА, наследственно предрасположенных к спонтанному гепатоканцерогенезу, при профилактическом применении комплексного фитоадаптогена фитомикса-40.

Материалы и методы. Фитомикс-40 - стандартизованный препарат, включающий компоненты 40 растительных экстрактов; обладает иммуномодулирующим, адгезиогенным, интерфероногенным, антимутагенным, ан-тиоксидантным, радиопротекторным эффектами. В работе использовали 140 мышей-самцов линии СВА: 1 группа (n=70) - контрольная, мыши получали в качестве питья воду; 2 группа (n=70) - опытная, мыши получали фитомикс-40 с питьевой водой в профилактическом режиме в течение 1-го месяца постнатального развития, включая критический период дифференцировки ткани печени. Гистологическое исследование печени контрольных и опытных животных проводили на парафиновых срезах, окрашенных гематоксилином и эозином. Результаты. В возрасте 4 месяцев у мышей контрольной и опытной группы опухоли обнаружены не были. В возрасте 8 месяцев у 10 % контрольных животных выявлены трабекулярные гепатокарциномы умеренной дифференцировки. В возрасте 22 месяцев у всех мышей контрольной группы и у 69,2 % мышей опытной группы микроскопически обнаружены умеренно- и низкодифференцированные трабекулярные и трабекулярно-ацинарные гепатокарциномы, т.е. опухоли смешанного строения. Вместе с тем в спонтанных гепатокарциномах мышей опытной группы выявлена выраженная лимфоцитарная инфильтрация опухолей и признаки деструкции. В печени мышей контрольной группы инфильтрации опухоли лимфоцитами не наблюдали. Лимфоцитарная инфильтрация и деструкция опухолей опытных животных сопровождалась повышением экспрессии лейкоцитарных интегринов LFA-1 и Mac-1 на эффекторах иммунитета. При этом у опытных животных наблюдали снижение частоты и размера опухолей, а также повышение продолжительности жизни.

Выводы. Выявление лимфоцитарной инфильтрации и деструкции опухолевых участков в печени животных при профилактическом применении фитоадаптогена является благоприятным прогностическим фактором течения опухолевого процесса.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИИ

РШМ-5

LLC

ТРО

- рак шейки матки

- карцинома лёгкого Льюис

- торможение роста опухоли