CC BY
107
ДИСТАНТНОЕ ДЕЙСТВИЕ В ПАТОГЕНЕЗЕ ОТРАВЛЕНИЙ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИМИ СОЕДИНЕНИЯМИ
© В. Б. Прозоровский, В. Г. Скопичев
НИИЦ(МБЗ) ГНИИИвоенной медицины Министерства обороны Российской Федерации, Санкт-Петербург; Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины
Ключевые слова________________________________________
фосфорорганические инсектициды; патогенез отравлений; дистантное действие ингибиторов холинэстеразы; холинэстераза эндотелиоцитов
Прозоровский В.Б., Скопичев В.Г. Дистантное действие в патогенезе отравлений фосфорорганическими соединениями // Обзоры по клин, фармакол. и лек. терапии. — 2004: — Т. 3, № 3. — С. 56-67.
Рассмотрена краткая история создания и изучения фосфорорганических ингибиторов холинэстеразы. Подробно изложены экспериментальные данные, на основе которых авторами доказано наличие у этих соединений дистантного действия на клетки, не имеющие иннервации: клетки крови и эндотелиоциты. Впервые описано наличие в эндотелиоцитах холинэстеразы. Обсуждена значимость дистантного действия в патогенезе отравлений. Библ. 20 назв.
В нашей лекции речь в основном пойдет о тех фосфорорганических соединениях (ФОС), которые относятся к фосфорорганическим ингибиторам (ФОИ) холинэстеразы (ХЭ). Причина такого выбора среди прочих ингибиторов этого фермента — карбаматов, бисчетвертичных аммониевых оснований и других — состоит в том, что именно ФОИ, в частности инсектициды, поданным Н.Н. Литвинова и сотрудников [8] являются одними из наиболее часто регистрируемых причин отравлений. В некоторых регионах России их частота достигала 16% с летальностью до 50%.
Не следует забывать и о том, что более чем 20 стран не подписали конвенции об отказе применения и уничтожении запасов фосфорорганических боевых отравляющих веществ — ФОБ (зарин, зоман, \/Х). Недавние террористические акты в Японии с применением зарина, где пострадавшими оказались более 5000 человек [19], доказали, что синтез этих веществ может быть осуществлен в примитивных лабораториях, и повторение таких актов можно ожидать в любом месте, в любое время. В 2003 году была вовремя обезврежена террористическая группа Аль-Каида, планирующая ата-
ку на парламент с применением зарина. Даже при уничтожении химического оружия на специализированных предприятиях могут (хотя и с малой вероятностью) происходить аварии и другие неожиданности, которые будут сопровождаться поражением не только работников объектов уничтожения, но и окружающего его населения. Во всяком случае такая вероятность обсуждается [7]. Наконец, ФОИ как инсектициды постоянно используются для распыления на полях и уничтожения насекомых в шерсти овец и крупного рогатого скота. Все эти вещества производятся тысячами тонн и свободно перемещаются ветром и водой. Согласно данным американских исследователей 2001 года, главным источником случайных отравлений является пища и вода. При исследовании в 1997 году установлено, что у взрослых жителей центральной Италии в «нормальной» ежедневной диете содержится около 40 мкг инсектицидов из группы ФОИ. Однако, по мнению крупнейшего специалиста России по защите растений А.Н. Мельникова (1989), без применения инсектицидов получение высоких урожаев невозможно, а ущерб здоровью населения и экологической обстановке в целом, наносимый ФОИ, преувеличивается.
В основном именно по перечисленным причинам интерес к ФОИ, в частности к патогенезу отравлений этими веществами, за многие годы их изучения отнюдь не снизился. А с учетом скандального «синдрома Персидского залива», отмеченного у многих военнослужащих США после военных действий, сопровождавшихся нарушением целости емкостей с зарином, даже несколько возрос.
Несколько слов об истории создания и изучения токсического действия ФОИ. Первые метильные производные фосфинов были поучены Л. Тенаром (I.. ТИепагс!) в 1847 году. Однако из-за их высокой токсичности и способности самовоспламеняться они не были подробно изучены. В 1905 году А.Е. Арбузов открыл новый простой способ получения фосфорорганических эфиров, который впоследствии был использован для широкого синтеза соединений этой группы многими химиками. Тем не менее вещества, полученные в первые десятилетия XX века, не нашли практического применения. Следующим шагом в синтезе ФОС явились соеди-
нения, полученные немецким химиком Шрадером (G. Schrader) в 1930-40-х годах. Они стали первыми ФОС, рекомендованными в качестве инсектицидов, а также предшественниками ФОВ, созданными химиками печально известной фирмы ИГ Фарбениндустри. С 1940-х годах синтезом ФОВ занялись английские химики под руководством Саундерса (К. Saunders). Подробности истории создания ФОС, ФОИ и ФОВ можно найти в руководствах Ю.В. Другова, 1959; С.Н. Голикова и В.И. Ро-зенгарта [4, 5]; В. О'Брайна, 1964; 3. Франке 1973; Ю.С. Кагана [6] и др.
Любопытный факт: первым веществом, вызыва-ющим‘при отравлении животных и человека тотальное холинэргическое возбуждение, был алкалоид физостигмин, выделенный Хессе (О. Hesse) еще в 1864 году из африканского растения Physostigma venenosum. В 1932 году Щтедман (Stedman) установил, что физостигмин вызывает токсические эффекты за счет угнетения фермента холинэсте-разы (ХЭ), разрушающего ацетилхолин (АХ), медиатор нервных импульсов в холинэргических синапсах. Несмотря на очевидное сходство симптомов Отравления физостигмином и многими ФОС, антихолинэстеразное действие последних было обнаружено лишь в 1941 году Адрианом и др. (по соображениям секретности эти данные были опубликованы только в 1947 году). С этого времени физостигмин и сходные с ним вещества, а также и ФОС, способные вызывать угнетение ХЭ в концентрации 10-6 моль и ниже (Голиков С.Н., Розенгарт В.И. [4]), именуются антихолинэстеразными (АХЭ).
Следует подчеркнуть, что во всех упомянутых выше,, а также и в руководствах по токсикологии последнего времени традиционно (правильней сказать ортодоксально) подчеркивается, что токсические эффекты ФОИ определяются угнетением лишь синаптической ХЭ [1, 2, 17]. Справедливости ради следует отметить, что в учебнике по фармакологии С.В. Аничкова и М.Л. Беенького(1968) впервые отмечено: «Не исключается возможность прямого действия АХЭ средств на холинорецепторы». В учебнике И-В. Марковой и М.В. Неженцева (1994) АХЭ средства названы «непрямыми холиномиметика-ми», чем подчеркивается способность этих средств тем или иным способом сохранять и усиливать действие АХ, что и расшифровывается в скобках (антихолинэстеразное и холиносенсибилизирующее действие). По нашему мнению, такое название неудачно, поскольку, с одной стороны, исключает прямое действие на холинорецепторы, с другой, — создает впечатление, что вещества этой группы могут препятствовать обратному захвату АХ, что никем не было отмечено. Предложенный нами ранее термин «холинопотенцирующие средства» не охватывает всех свойств ФОИ. По этой причине, надо полагать, первоначальный термин, связанный с сугубо специфическим эффектом — торможением активности ХЭ, является самым правильным. Естественно, что его нельзя понимать слишком узко.
В настоящее время нет особого смысла анализировать, кто и когда выявил у АХЭ средств, способность оказывать то ли иное внутрисинапти-ческое неантихолинэстеразное действие. Все же, пожалуй, наиболее ранним было обнаружение классиками учения о холинэргической медиации Кларком (С1агк А., 1937) и др. синаптических хо-линорецепторов (ХР) и основанное на сходстве их строения с ХЭ утверждение о возможности взаимодействия АХЭ средств с обоими белками. После установления антихолинэстеразного действия ФОИ в 50-60-х годах прошлого века данные о наличии у этих веществ не-АХЭ действия посыпались как из рога изобилия. Это не помешало, однако, большинству весьма уважаемых исследователей придерживаться ортодоксальной анти-холинэстеразной теории, игнорируя очевидные факты, свидетельствующие о высокой значимости влияния ФОИ на синаптическую передачу даже вне их влияния на ХЭ. Возможно, такое заблуждение объясняется тем, что конечное потенцирование эффекта АХ является результатом взаимодействия АХЭ и не-АХЭ действия, причем с увеличением АХЭ активности и дозы испытуемого ФОИ значимость не-АХЭ действия уменьшается и наоборот. Токсикологи, а среди интересующихся действием ФОИ таких было подавляющее большинство, не придавали значения не-АХЭ действию, которое больше интересовало относительно небольшое число фармакологов. В частности, одним из авторов этой лекции было доказано, что потенцирование эффекта АХ в опытах на прямой мышце живота лягушки осуществляется армином (лекарственный препарат!) за счет сенсибилизации ХР уже в концентрации 10'16 моль, а АХЭ обнаруживается лишь в концентрации 10‘” моль (Прозоровский В.Б., ВолковаЗ.А., 1969). Поскольку аналогичные исследования проводились в Военно-медицинской академии им. С.М.Кирова Н.В. Саватеевым и сотрудниками, то естественным результатом такого единомыслия было опубликование совместной монографии [12].
В настоящее время способность ФОИ оказывать синаптическое не-АХЭ действие общепризнана. Она проявляется в следующих четырех вариантах:
1. Изменение чувствительности ХР к АХ.
2. Влияние на освобождение АХ нервными окончаниями.
3. Непосредственное взаимодействие с ХР.
4. Взаимодействие с ионными каналами.
Получены также доказательства наличия у большинства ФОИ нехолинэргического и неспецифического фосфорилирующего, а также и проокси-дантного действия, которые обсуждены ранее (Прозоровский В.Б., Ливанов Г.А.) [11] и детально в настоящей работе не рассматриваются. Существенно лишь указать, что фосфорилирующее действие, лежащее в основе антихолинэстеразного, осуществляемое путем фосфорилирования аминокислоты серина, присуще активным ингибиторам.
Они могут фосфорилировать многие ферменты и белки, не только взаимодействуя с серином, но также и сих ЭН-группами. Напротив, неспецифическое прооксидантное действие присуще слабым ингибиторам, но с длительным действием.
Торможение даже ограниченного числа молекул таких ферментов, как трипсин, фосфатазы печени, фосфорилаза А, арилэстераза, цитохромоксидаза, ацетилхолинтрансфераза, фосфолипаза С, нейропептидаза, К,Ма-АТФ-аза сердца и изменение свойств мембран на местах даже непродуктивного фосфорилирования неминуемо должно приводить к лавинообразному нарастанию дезорганизации обменных процессов в мембранах и цитоплазме клеток, а в последующем и к их морфологическим изменениям. Цитотоксическое действие, как отмечал Е.А. Лужников [9], проявляется в первую очередь в печени.
Имеются указания на то, что поздний паралич дыхательного центра, не устраняемый атропином, определяется метаболическими нарушениями в головном мозге, связанными с угнетением ряда ферментов, в частности, АТФ-азы, сукцинатдегидроге-назы, альдолазы и пр., что ведет к нарушению потребления кислорода, блокаде окислительного фосфорилирования и ацидозу. Наибольшее значение имеет способность ФОИ разобщать дыхание и фосфорилирование. Это может явиться причиной гипоксической гибели клеток.
Существуют основания предполагать, что развитие инвалидизирующего отсроченного нейродист-рофического процесса при отравлениях ФОИ также связано с фосфорилированием цитозольных ферментов. Было показано, что развитие отдаленных нейропатий не зависит от угнетения ацетил-ХЭ: применение эзерина, обладающего профилактическим эффектом, с последующим лечением атропином не изменяет ни времени появления, ни степени выраженности отдаленных нейротоксических эффектов ФОС.
Впервые предположение о том, что развитие нейротоксических эффектов обусловлено ингибированием особого фермента в головном и спинном мозге высказал в 1970 г. М. ио1тзоп. Он обозначил этот фермент как «нейротоксическая эстераза» (НТЭ). В настоящее время под НТЭ понимают па-раоксонрезистентную мипафоксчувствительную фенилвалериатгидролазу (ЭодогЬ, \Лтедга, Ве1д е1 а1., 1994).
НТЭ представляет собой мембраносвязанный фермент, относящийся к классу карбоксилэстераз и транспортирующийся по аксону со скоростью 300 мм/сут. Его функция не является столь жизненно необходимой как ацетил-ХЭ. Специфического субстрата у нее может и не быть, так как НТЭ широко распространена в различных тканях многих животных, находящихся на разных ступенях филогенеза.
Цитотоксические эффекты ФОИ проявляются в концентрациях на 5-7 порядков больших, чем не-
обходимо для ингибирования НТЭ. К классическим ингибиторам НТЭ относят также мипафокс. Подробные сведения и литература, относящиеся к воздействию ФОС на НТЭ, приведены в обзоре
В.Б. Прозоровского и С.В. Чепура [16].
Если специфические токсические реакции в той или иной степени присущи всем ФОИ, то неспецифические реакции могут быть крайне выражены у одних веществ (карбофос) и не быть характерными для других (фосфакол, хлорофос) <
Итак, для ФОИ характерно как специфическое, так и неспецифическое действие. Различие этих вариантов действия принципиальное. В первом случае ФОИ вступают в комплекс или ковалентную связь со специализированными акцепторами, созданными природой для взаимодействия с АХ. Во втором случае происходит взаимодействие с разными радикалами аминокислот, липидов и белков, преимущественно ферментных, способных вступать в реакцию фосфорилирования, но не взаимодействующих с АХ. Результатом таких реакций становится активация перекисного окисления липидов, нарушение функции клеточных и субклеточных мембран, дезорганизация метаболизма, гипоксия и в конечном итоге гибель клеток. Суммарно такие реакции можно объединить понятием цитотоксическое действие.
Кроме такого деления вариантов действия ФОИ, появилась необходимость выделять среди специфического действия два варианта: действие внутрисинаптическое, о котором уже говорилось, и внесинаптическое.
До сравнительно недавнего времени специфическое внесинаптическое действие ФОИ практически не обсуждалось, поскольку скорость гидролиза АХ синаптической ацетил-ХЭ составляет несколько наносекунд, то есть практически мгно-венна. Пресинаптическое модулирующее влияние АХ, его миметиков и блокаторов на выделение медиаторов нейронами другой эрг.ичности в стриату-ме, обсужденное О.В. Годухиным [3], свидетельствует о существовании в мозге нервных волокон, оканчивающихся на терминалях аксонов иной эр-гичности. Следовательно, АХ действует там, где синтезируется и выделяется. Наличие несинаптических ХР обсуждалось М.Я. Михельсоном и
Э.В. Зеймаль [10].
К сожалению, полной ясности в возможности АХ диффундировать в межклеточных пространствах мозга, нет. С одной стороны, несомненно, высокая активность ацетил-ХЭ синапсов и способность глиальных клеток захватывать АХ с его последующим гидролизом вроде бы делает это невозможным, с другой, — появление АХ в дырчатой канюле, вставленной в мозг, тоже не вызывает сомнений.
До недавнего времени не было ответа и на более простой вопрос — зачем клеткам, свободно плавающим в крови, в частности эритроцитам и лейкоцитам, а также тучным клеткам либо их функ-
циональным аналогам — базофилам,, никак не связанным с нервными волокнами, иметь ХР и ХЭ? И как они реагируют на появлейие в крови ФОС?
Интерес к периферическому внесинаптическо-му действию АХ резко повысился после описания в 19801г. Фурчготтом и Завадским [18] ХР у эндотелиальных клеток, которые не имеют холинэргиче-ской иннервации, поскольку в сосудах терминали парасимпатических волокон заканчиваются в базальной мембране и до эндотелия не доходят. Однако при удалении эндотелия раздражение этих нервов более не вызывало расширения сосудов. Очевидно, что АХ свободно диффундирует из ад-вентиция через мезотелий в эндотелий, где и взаимодействует с ХР. Впоследствии показано, что эти ХР могут реагировать и с тем АХ, который находится в перфузионной жидкости или в крови, причем воздействие АХ на более чувствительные к нему М-ХР вызывает расширение, а на Н-ХР — сужение сосудов. Учитывая исключительно высокую: реактивность М-ХР некоторых артерий, выявляемую при воздействии АХ в концентрации 10-121моль, можно полагать, что генерализованная активация ХР может быть причиной развития тяжелой сосудистой патологии. Откуда же берется этот АХ и при какой патологии? Существует мнение, что основным источником АХ в крови являются многочисленные вегетативные ганглии. Показано, что именно в них внутрисинаптическое разрушение АХ холинэстеразой имеет наименьшую значимость и его удаление происходит в основном с током крови (Voile, 1980). По нашим неопубликованным данным, полученным под руководством
С.С. Крылова в 1960 г. в институте токсикологии АМН СССР, для такого удаления необходима достаточно высокая скорость кровотока. Следовательно, с падением артериального давления выход АХ из синаптических щелей прекращается. При отравлении ФОИ возрастание интенсивности пре-ганглионарной импульсации увеличивает скорость выделения АХ ганглиями, а повышение содержания АХ крови на фоне торможения ганглионарной ХЭ в свою очередь способствует выбросу новых порций АХ (Collier, Katz, 1975).
Повышение концентрации АХ в крови при отравлении параоксоном было установлено на биологических; объектах еще в 50-х годах сначала на животных, а в дальнейшем продемонстрировано у добровольцев при введении им зарина в минимальных токсических дозах (Grob, 1963). В недавнее время хроматографическим методом установлено, что у свиней через 15 мин после внутривенного введения зомана в дозе 2 ЛД50 содержание АХ в крови повышается с 0,7 нмоль/мл в норме до 3,0 нмоль/мл, причем нарастание концентрации АХ коррелирует с сосудистыми расстройствами [20]. У крыс при тяжелом,отравлении ФОИ содержание АХ возрастает с 0,5 нмоль/мл до 3,0 нмоль/мл.
Нарушение микроциркуляции при отравлении ФОИ отмечались неоднократно как в эксперимен-
те, так и в клинике. Для обсуждаемой проблемы существенно, что в некоторых наблюдениях отмечали появление в крови конгломератов эритроцитов. Любопытно, что образование в крови конгломератов отмечается также при травматическом шоке. По мнению В.К. Кулагина (1978), конгломерация является более тяжелым признаком шока, чем сгущение и повышение свертываемости крови. Причиной этого явления может быть возникающее при шоке снижение активности ХЭ цельной крови и повышение содержания в ней АХ. Непосредственная причина конгломерации никем не изучалась, хотя неоднократно высказывалось мнение, что данный эффект связан с непосредственным воздействием на мембрану эритроцитов. Основанием для такого предположения было наблюдение конгламериза-ции при отравлении животных ФОИ, несущими в своей молекуле полный положительный заряд на четвертичном азоте одного из радикалов, а следовательно, не проникающих в цитоплазму. Но что это за воздействие, оставалось неясным.
Наши опыты (Прозоровский В.Б., Скопичев В.Г. и соавт. [13-16]), естественно, были начаты с воспроизведения экспериментов, выполненных ранее другими авторами, а именно наблюдения за микроциркуляцией в мезоаппендиксе наркотизированных крыс при внутримышечном введении фосфакола (параоксона) в разных дозах. Естественно, опыты имели некоторые модификации.
Нарушение кровотока в артериолах и капиллярах оценивали в баллах, скорость кровотока определяли стробоскопическим методом. Пять баллов соответствовали норме и скорости кровотока 158 ±15 об/мин, 4 заметному снижению кровотока — 28 ± 2 об/мин, 3 — резкому снижению — 6 ± 1 об/мин, 2 — маятникообразному движению крови и 1 — стазу. Изменения кровотока при отравлении фосфаколом регистрируются в узком диапазоне доз: снижение кровотока до 4-х баллов отмечено лишь при введении ФОИ в дозе, равной 0,8 ЛД50, до 3-х — при дозе 0,9 ЛД50. При дозе, равной 1 ЛД50, кровоток снижается до 2-х и даже до 1-го балла. Артериальное давление при этом быстро снижается, и половина животных погибает. При используемом 70-кратном увеличении микроскопа «Биолам» существенной деформации эритроцитов не отмечали.
Естественно возникла необходимость проверить отсутствие влияния фосфакола в летальной дозе при большем увеличении и одновременном определении активности ХЭ крови. Фосфакол вводили крысам также внутримышечно в дозе ЛД50 = 0,82 ± 0,12 мг/кг, а кровь получали путем де-капитации через разные промежутки времени. Активность ХЭ цельной крови определяли методом потенциометрического титрования на автотитра-торе фирмы «Вас1юте1г», а эритроциты, осажденные на покровных стеклах, после высушивания и напыления золотом фотографировали, используя сканирующий вариант электронного микроскопа
Рис. 1. Сканирующая электронная микроскопия поверхности эритроцитов крыс при отравлении фосфаколом в дозе ЛДи - ЛДЮ:
а) эритроциты контрольных животных;
б) образование выростов плазматической мембраны, обнаруживаемое спустя 15 мин после затравки фосфаколом;
в) многочисленные эхиноциты в крови животных, отравленных фосфаколом;
г) нормализация клеточной поверхности эритроцитов спустя 1 час после начала отравления; масштаб электроннограмм указан в нижней части каждого фрагмента.
«НКасЫ-Н-300» (рис. 1). Установлено, что уже через 15 минут после введения фосфакола активность ХЭ подавляется на 100%, причем это подавление сохраняется в течение 4-х часов наблюдения. Через 24 часа подавление активности ХЭ составляло 58 ± 9%. Существенные изменения поверхности эритроцитов отмечены через 15 минут после затравки. Обнаруживается формирование многочисленных выростов клеточной поверхности, в результате чего часть клеток приобретает форму эхиноцитов. Одновременно происходит достоверное увеличение размеров эритроцитов с утратой их типичной двояковогнутой формы. Значительное количество клеток имеют дефекты плазмолеммы, сопровождающиеся их разрушением. Спустя 1 час после начала отравления можно отметить существенную нормализацию клеточной поверхности с одновременным восстановлением их размеров и формы. Через 4 часа на фоне сохранения угнетения активности ХЭ происходит практически полная нормализация морфологии клеток. Эти данные дают основание предполагать, что начальная и относительно кратковременная деформация эритроцитов связана не столько с по-
давление активности ХЭ, сколько с появлением к крови «волны» выбрасываемого нервными окончаниями АХ, которая заканчивается к 4 часам за счет опустошения его запасов или аутоторможения его выделения за счет активации пресинапти-ческих М-ХР.
Для проверки раздельных и совместных эффектов фосфакола на эритроциты были проведены эксперименты in vitro. После декапитации интакт-ных крыс полученную кровь разливали в 4 пробирки: № 1 оставляли для контроля, в № 2 добавляли фосфакол в конечной концентрации 0,167 мг/г, чем достигалось угнетение ХЭ на 93%, в № 3 добавляли АХ в концентрации 10-4, 10_6 или 10'8 моль, в №4 вводили фосфакол, а после 15-минутной инкубации АХ в тех же концентрациях. Через 30 мин. после воздействия фосфаколом отмечали уменьшение размеров клеток с 5,1 до 4,0 мкм (статистически, однако, не значимые из-за большого разброса результатов) и незначительные изменение поверхности клеток. Один АХ даже в больших (порядка 10_6 моль) концентрациях был не эффективен, в то время как его прибавление к эритроцитам, не защищенным ХЭ, вызывало все эф-
I Таблйца 1. ЧСС, газовый состав и кислотно-основное состояние крови крыс при отравлении фосфаколом в условиях ИВЛ (М ± т)
Показатели Контроль Время после начала ИВЛ
15 минут 2 часа
Без затравки Доза фосфакола в мг/кг Без затравки Доза фосфакола в мг/кг
0,5 5,0 50,0 0,5 5,0 50,0
ЧСС, уд/мин 388±20 425±20 340+40* 189±31* 93±20* 421±20 395±20 126±11* 71
рСО", мм рт. ст. 55±4 27±1 29±5 22±1* 29±2 27±1 30±5 33±5 28
НСО~, ммоль/л 28±2 28±1 28±1 18+1* 15±1 * 28±1 20±2* 17±1* 72
СБК, ммоль/л 26±2 31+1 30±2 22±1* 17±Г 31 ±1 22±3* 17± 1 * 8,2
СИОК, ммоль/л 5,1+0,6 5,4±0,8 5,5±1,7 -3,9±1,4* -9,8±1,2* 5,1 ±0,8 0,8±0,5* — 16,8±1,2* -21,4
pH 7,4±0,03 7,6±0,05 7,6+002 7,5±0,02 7,3±0,03* 7,6±0,03 7,4±0,03* 7,1 ±0,06* 7,0
Р02, мм рт. ст. 103±4 128±1 130±4 121 ±3 88±10* 128±1 112±4* 91±11 * 90
HAKO-, % 97±0,5 99±0,25 99±0,1 99±1,2 95±1,2 99±0,1 99±0,1 96±1,6 91
Примечание: В каждой группе животных использовано 5—6 животных (в опыте осталось живой всего 1 крыса); СБК — стандартный бикарбонат крови; СИОК — стандартный избыток оснований в крови; НАК02 — насыщение крови кислородом; достоверные отличия от показателей, отмечаемых при ИВЛ без затравки, отмечены звездочкой.
фекты', описанные в опытах in vivo. Деформацию отмечали, начиная с концентрации 10~12 моль, и с ее повышением она встречалась все чаще и была более выражена. С течением времени все описанные изменения оставались без изменений. Таким образом, было доказано, что даже значительное угнетение ХЭ без АХ вызывает лишь незначительные изменения (видимо за счет фосфорилирова-ния клеточных мембран). Один АХ вызывал эффекты лишь в очень больших концентрациях. Но самые существенные эффекты вызывает АХ, действующий на незащищенные ХЭ клетки. Причем их выраженность имеет четкую концентрационную зависимость.
Оставалось попытаться выяснить, что же все-таки происходит с эритроцитами при отравлении, каков механизм их деформации. Эксперимент был достаточно сложен. Под нембуталовым наркозом крысы были трахеотомированы, одну сонную артерию канюлировали. Частоту сердечных сокращений регистрировали на полиграфе «RM 600» фирмы «HihonlKohden». Газовый состав крови и содержание оснований определяли микрометодом Аструба на аппарате ABL-330 фирмы «Radiometr». Сканирующее электронно-микроскопическое исследование производили по методу, описанному выше. Оценку содержания цитоскелетного материала в эритроцитах производили по модифицированному нами методу Ю.И. Ченцова. Препараты анализировали на установке «Mortfokvant» в монохроматическом излучении :(540 нм). Определяли интегративную оптическую плотность и размеры клеток.
Крыс наркотизировали нембуталом, трахеото-мировали и канюлировали сонную артерию. Определял^ исходное состояние наркотизированных и ложно'оперированных животных — контроль. Состояние животных с ИВЛ, но без отравления — фон. Опытным животным фосфакол вводили внутримышечно, в дозах 0,5; 5,0 и 50 ЛД50, сразу после чего крыс подключали к сконструированному нами ап-
парату ИВЛ, и производили первое определение. Второе определение производили через 15 минут и третье — через 2 часа после начала ИВЛ, что соответствовало времени максимальной выраженно-ти интоксикации и времени стихания острых явлений. Результаты наблюдений приведены в табл. 1.
В контроле у животных, не получавших фосфакол, почти все параметры меняются, что связано с рефлекторным воздействием на ЧСС и гипервентиляцией легких, о чем свидетельствует не только резкое снижение парциального давления углекислого газа (рС02), но и увеличение содержания в крови бикарбонатов. Хотя этот процесс частично компенсируется возрастанием парциального давления кислорода (р02), однако проявляется повышением щелочности (pH) крови.
Выраженная зависимость ЧСС от дозы фосфа-кола в первые 15 мин после начала отравления позволяет сделать заключение о том, что ритм сердца в этом периоде определяется тонусом парасимпатической нервной системы и, вероятно, повышением содержания АХ в плазме. Степень угнетения активности ХЭ, по-видимому, существенной роли не играет, поскольку, начиная с дозы 5 ЛД50, она полностью подавлена.
С увеличением дозы фосфакола до 5-ти и тем более до 50 ЛД50, дыхательный алкалоз все в большей степени компенсируется нарастающим ткане-вым ацидозом. Компенсаторные механизмы обеспечивают подержание pH в течение первых 15 минут даже после введения фосфакола в дозе 50 ЛД50 на почти нормальном уровне. Однако по истечении 2 часов с момента отравления, даже при дозе 5 ЛД50, недостаток стандартного содержания оснований становится резко выраженным. Совершенно очевидно, что щелочные резервы истощаются за счет появления в крови большого количества недоокисленных продуктов метаболизма. Учитывая высокое содержание в крови кислорода, это явление трудно объяснить иначе, как возник-
Рис. 2. Сканирующая электронная микроскопия поверхности эритроцитов крыс при отравлении фосфаколом
в условиях гипервеитиляции легких:
а) эритроциты контрольных животных;
б) образование выпуклости поверхности эритроцитов в условиях гипервентиляции;
в) набухание эритроцитов в при действии фосфакола;
г) разрушение мембраны эритроцитов при действии фосфакола.
новением нарушения потребления кислорода тканями. Помимо отмеченных выше микроциркуляр-ных расстройств, необходимо обратить внимание на возможность нарушения кислородсвязываю-щих свойств эритроцитов. Об этом свидетельствует снижение р02 при сохранении насыщения им крови.
Через 2 часа происходит превалирование тканевых нарушений и полное истощение запасов оснований. Итогом является снижение pH крови при дозе 5 ЛД50 до уровня 7,1, близкому к критическому, а при дозе 50 ЛД50, вероятно, и ниже. Большинство животных до этого уровня не доживает,-чему способствует резкое падение артериального давления.
Морфологические исследования рельефа поверхности эритроцитов показали, что в контрольных образцах они имеют типичную форму дис-коцитов. При длительных сроках нахождения в условиях гипервентиляции отмечается типичное набухание, которое проявляется в выпуклости в центральной части дискоцитов (рис. 2).
Введение фосфакола в дозе 0,5 ЛД50 приводит к существенному изменению формы эритроцитов со всеми отмеченными выше особенностями. При увеличении дозы до 5,0 ЛД50 возникает набухание
клеток, которое компенсирует их начальное сжатие. С дальнейшим повышением дозы выраженность изменения эритроцитов, в частности набухание, увеличивается, что в сочетании с нарушением стромы ведет к разрушению клеток (рис. 2, г).
ИВЛ, не сопровождаемая отравлением, ведет к увеличению площади изображения клеток с 747 ± 49 до 901 ± 28 мкм — на 21 %. Ко второму часу наблюдения при одновременном ИВЛ и отравлении фосфаколом в малой дозе площадь уменьшается на 14%, при средней и больших дозах — увеличивается на 21 и 54%. Определение площади изображения эритроцитов и их интегральной оптической плотности позволяет вычислить относительное содержание цитоскелета в эритроцитах.
ИВЛ уменьшает оптическую плотность исключительно за счет увеличения размеров клеток. При отравлении фосфаколом в малой дозе цитоскелет фактически не меняется (компенсация), зато при больших дозах его содержание уменьшается — при введении фосфакола в дозе 50 ЛД50 в 2,7 раза, что превосходит изменение относительной площади. Следовательно, при отравлении фосфаколом в дозах, превышающих ЛД50, дозозависимо снижается содержание цитоскёлета в клетках. Полученные данные свидетельствуют о реальной
■ Таблица 2. Средние летальные дозы (в мг/кг) фосфакола, ДФФ, хлорофоса и карбофоса для разных животных при разных путях введения. (Антихолинэстеразное действие на эритроцитах in vitro оценены показателем plsg — отрицательный логарифм концентрации, необходимой для ингибиции фермента на 50%)
і I ФОС Токсичность, выраженная в ЛД,„
АХЭ активность на эритроцитах Виды животных Пути введения
через рот внутрибрюшинно подкожно
Фосфакол 8,0-8,7 Мышь 2,0-11,0 0,7-3,0 0,5-1,0
■ Крыса 0,5-16,0 0,3-1,7 0,4-0,5
ДФФ ' 5,0-6,8 Мышь 30,0-37,0 4,0-9,0 3,5-6,3
Крыса 6,0-13,8 1,8-5,0 2,2-4,4
Хлорофос 3,7-4,5 Мышь' 250-600 500-650 400-650
Крыса 300-750 225-250 500-590
Карбофос 3,0-4,0 Мышь 260-390 130-800 200-300
I Крыса 360-580 350-700 700-900
возможности нарушения рельефа и целостности эритроцитов при воздействии ФОИ за счет прогрессирующего разрушения цитоскелета, что являемся также и одной из причин развития геми-ческо^ гипоксии. Возникновение изменений цитоскелета возникают значительно раньше сдвигов рН|крови, что свидетельствует о независимости этих процессов.
Полученные результаты позволяют утверждать, что установленная деформация клеток крови под воздействием АХ в условиях устранения защитной роли ХЭ происходит в значительной мере за счет деформации и разрушения цитоскелета.
Все]проделанные серии опытов выполнены с использованием в качестве эталонного ФОИ препарата фосфакола (параоксона). Однако этот препарат является не инсектицидом, а в настоящее время — лекарсром. Реальных отравлений этим веществом не происходит. Это обстоятельство послужило причиной проведения дополнительных экспериментов с другими веществами.
Международным стандартом служит диизоп-ропилфторфосфат (ДФФ), синтезированный в Англии как потенциальное боевое отравляющее вещество, но, как выяснилось после второй мировой войны, не идущее ни в какое сравнение с немецкими зарином и зоманом. Впоследствии он был предложен как лекарство при тяжелой миастении, потом превратился в некую единицу измерения для прочих ФОИ. В России до сих пор наиболее частой причиной отравления являются инсектициды хлорофос (диптерекс) и карбофос (малатион). Несмотря на примерно равную малую токсичность, разница между ними весьма существенна. Если при отравлениях хлорофосом летальность в условиях стационарного лечения составляет 1-2%, то при отравлении карбофосом — 40-50%. В наших дальнейших исследованиях мы, естественно,, обратились к карбофосу. Сравнительная токсичность упомянутых соединений по нашим и литературным данным приведена в табл. 2. Сравнительная эффективность холиноблокатора
■ Таблица 3. Коэффициенты защиты мышей, отравленных ФОС внутрибрюшинно в условиях защиты атропином и дипирок-симом, а также их комплексов (внутримышечно) на разных этапах отравления (М ± т; п = 8-25 особей)
I ФОС I Антидоты и их дозы в мг/кг Время применения Средняя летальная доза - ЛД50 Коэффициент защиты ЛД /ЛД ”50 контроля7 ”50 опыта
ДФС > Нет Атропин (А) - 10,0 Дипироксим (Д) - 20,0 +атропин - 10,0 +дипироксим - 20,0 На первых признаках отравления 2,3 ±0,2 4.2 ±0,3 5.3 ±0,4 12,3 ± 1,2 1.8 ± 0,1 2.3 ±0,2 5.3 ±0,5
Фосфа кол Нет Атропин - 10,0 Дипироксим - 20,0 Атропин+дипироксим Профилактически А - за 15 мин Д - за 30 мин 1,4 ±0,2 2,2 ±0,2 17,5 ±3,6 68,7 ±8,8 1,6 ±0,2 12,5 ±2,6 49,1 ± 12,4
о а. о 5 юс Нет Атропин - 10,0 +дипироксим - 20,0 На первых признаках отравления 252 ± 25 2520 ± 222 11,2 ±8,9
Карбо^ >ос Нет Атропин-10,0 +дипироксим - 20,0 Атропин - 40,0 На первых признаках отравления 372 ± 30 870 ±71 1,6 + 0,1 1,7 ± 0,2 2,3 ±0,2 ■
Атропин - 40,0 +дипироксим - 30,0
Рис. 3. Дозозависимое изменение эритроцитов при отравлении крыс карбофосом в разных дозах:
а) образование эхиноцитов в крови животных при отравлении карбофосом;
б), формирование конгломератов эритроцитов с отложением фибрина.
атропина (стандартного антидота) реактиватора дипироксима, введенных мышам в равных дозах приведена в табл. 3. Из всех сравниваемых препаратов карбофос менее других, в том числе и высокотоксичных, при сравнении в равных условиях применения, поддается терапии. Даже при увеличении доз антидотов их эффективность почти не возрастает. Для нас важно, что антидотная терапия при отравлении карбофосом фактически в 5 раз менее эффективна, чем при отравлении хлорофосом и даже ДФФ. То есть с учетом реального запаздывания помощи отравленным она фактически неэффективна. Очевидно, тому должна быть причина.
Естественно было предположить, что одной из причин малой эффективности лечебного применения антидотов при отравлении карбофосом служит более интенсивная деформация эритроцитов, которая может резко нарушить мйкроциркуляцию крови и вызвать гемическую гипоксию.
Эти предположения полностью оправдались. В опытах на крысах и мышах при наблюдении кровотока в микрососудах аппендикса установлено, что при введении карбофоса в дозе ЛД50 уже через 20 минут возникают явления стаза. В просвете сосудов наблюдается множество конгломератов, состоящих из форменных элементов. С помощью сканирующей электронной микроскопии установлено, что введение карбофоса в дозах ЛД50, 1/3 и 1/10 ЛД50 вызывает дозозависимые множественные грубые нарушения рельефа поверхности эритроцитов, ведущие к образованию конгломератов
(рис. 3). Восстановление нормальной формы клеток напрямую зависело от дозы карбофоса.
Особенно наглядно демонстрируется конгломерация эритроцитов при наблюдении за пиальными сосудами у крыс при удалении черепной крышки. Отчетливо видны «ампутированные сосуды, забитые конгломератами форменных элементов крови, и более мелкие плазменные сосуды, свидетельствующие о том, что препятствие задерживает только клетки, но не плазму. Следовательно, это не тромбы.
Дополнительно исследовали зависимость между торможением ацетил-ХЭ крови и частотой регистрации деформированных эритроцитов у крыс после внутрибрюшинного введения карбофоса в дозе ЛД50(табл. 4).
Согласно данным таблицы, торможение ХЭ создает условия для действия АХ, но в дальнейшем деформация задерживается дольше, чем восстановление активности фермента.
Материал для наблюдения за состоянием сосудов получали из брыжейки декапитированных крыс. Обработка препаратов и подготовка к электронномикроскопическому исследованию, в том числе в сканирующем режиме, описана ранее. Холинэс-теразу определяли гистохимически по Карновско-му и Руте (1964), ацетилхолинэстеразу выявляли, используя в качестве субстрата ацетилтиохолин, бу-тирилхолинэстеразу — бутирилтиохолин. Наблюдения производили на электронном микроскопе НИасЫ-НЗОО. Контрольные опыты выполняли в среде без субстрата, но с добавлением физостигмина в концентрации 5x10-5 г/мл.
■ Таблица 4. Активность ацетилхолинэстеразы крови (ацетил-ХЭ) и частота выявления деформированных эритроцитов у крыс в разные сроки после внутрибрюшинного ведения карбофоса в дозе ЛД50 (п=5; 10 полей зрения в каждой пробе; М± т; %)
Изучаемые показатели Время после введения карбофоса
Контроль 5 минут 15 минут 1 час 4 часа
Активность ацетил-ХЭ эритроцитов 7 99 ±8 6* 29 ±4* 11 ± 1*
Деформированные эритроциты, в % 11,0 ±2,1 28,3 ±3,3* 31,2 + 4,5* 21,3 ±3,2* 17,2 ±3,0
* — р < 0,05 по отношению к контролю.
ЛЕКЦИИ ДЛЯ ВРАЧЕЙ
40019 20КУ 51)
40020 20КУ 501)
б)
Е^Щ^їС
^ 3*»*, 4
"Ї4
Щ. У \ ^ ,-Г4^
$ \КхіЧ‘^йЗ
&' . *' ,5 \ \ч^-'
1'^ Л5 \ ’ ‘^\к \ 'г'*''' ^
34059 20К\/ . 51)
43080 20КУ
; Рис. 4. Сканирующая электронная микроскопия поверхности эндотелиальных клеток, обращенных в просвет | при отравлении карбофосом:
] а) поверхность интимы сосуда контрольных животных;
б) поверхность интимы сосуда спустя 0,5 часа после отравления карбофосом; видны набухшие клетки эндотелия, расхождение краев клеток и образование фенестр;
; в) спустя 2 часа; отмечается наличие высоких складок поверхности эндотелиальных клеток в виде «гребней»;
г) спустя 10 часов видно разглаживание поверхности интимы сосудов.
В первой серии опытов определяли характер нарушений рельефа микрососудов брыжейки у ин-тактны|Х и отравленных фосфаколом, ДДВФ или карбофосом крыс. Для сканирующей электронной микроскопии получали продольные срезы микро-сосудо]в брыжейки мезоаппендикса. Животных де-капитировали через 0,5-10 часов. При отравлении карбофосом, также как и при отравлении ДДВФ, уже через 0,5 часа наблюдали набухание эндотелия капилляров и приподнимание их над базальной мембраной с одновременным расширением межклеточных щелей. На некоторых препаратах в теле клеток отмечено появление сквозных отверстий (фенестр). Через 2 часа явления набухания и фенестрации значительно уменьшаются, однако даже ч]ерез 10 часов после введения карбофоса состояние клеток эндотелия отличается от нормы (рис. 4|). При введении фосфакола отмечены те же явления, только меньшей выраженности и длительности.
Во второй серии опытов выявляли наличие ХЭ в эндотелии капилляров брыжейки и ее торможение при отравлении ДДВФ или карбофосом в дозах 1 /2 ЛД 50. Опыты]выполнены на предварительно гепаринизи-рованных животных, у которых после декапитации
через дугу аорты производили промывание кровяного русла раствором Хенкса. При исследовании, выполненном на интактных крысах, установлено, что эндотелиоциты микрососудов содержат как ацетил-, так и бутирил-ХЭ. Продукт гистохимической реакции локализуется в пузырьках, преимущественно расположенных внутри клеток. Пузырьки с ХЭ частично располагаются по всей цитоплазме, частично в виде скоплений прилежат к клеточной мембране, что позволяет предполагать ихтрансци-тоз. При взятии материала через 0,5 часа после введения ДДВФ продукты гидролиза ацетил- и бути-рилтиохолина в цитоплазме не обнаруживаются
■ Таблица 5. Среднее содержание конгломератов в крови у больных, отравленных карбофосом, подвергнутых гемосорбции и без нее
Часы после поступления в клинику
1 ч Гемосорбция 5 ч 7ч 10 ч 34 ч
11 ±1 Нет 12 ±1 8 ± 2 6 ± 1 5 ± 1
10 ± 2 Гемосорбция 1 -4 ч 5 ±1 4 ±1 * 3 ± 2* 2 ± 1
* — р < 0,05 после гемосорбции (по 3 человека в 10 полях зрения).
Рис. 5. Гистохимическая реакция по выявлению активности холинэстеразы:
а) продукт реакции равномерно распределяется в эндотелиальной клетке и концентрируется в везикулах, расположенных у люменальной поверхности эндотелия;
б) отсутствие продукта реакции при отравлении ДДВФ.
(рис. 5). Итак, оценивая наблюдаемые изменения эритроцитов и микрососудов при отравлении испытанными ФОИ, можно утверждать, что все они уже при первом прохождении по кровеносной системе сорбируются на поверхности эритроцитов и эндо-телиоцитов. Проникая в цитоплазму, они инактивируют ХЭ, гидролизующую АХ, который в этих условиях вызывает их деформацию, преимущественно за счет сокращения цитоскелета. Деформация эн-дотелиоцитов, сопровождающаяся увеличением межклеточных пространств и особенно фенестра-цией, ведет к потере плазмы крови. Наблюдаемые изменения являются одной из первичных токсических реакций, которые усугубляют нарушение тканевого метаболизма с выходом в кровь многих физиологически активных веществ и форсируют поли-органную патологию.
Г.А. Ливанов и Л.М. Колмансон (Институт скорой помощи им. И.И. Джанелидзе, Санкт-Петербург)
любезно предоставили нам кровь больных, пострадавших от отравления карбофосом в случае применения гемосорбции и без нее. Данные приведены в табл. 5.
Хотя число обследованных пациентов мало, что связано с известными трудностями в критических условиях, причем один из больных, не подвергнутых сорбции, погиб, тем не менее стойкое снижение числа конгломератов после гемосорбции дает основания предполагать, что они в процессе сорбции частично отфильтровываются, что не может не сказаться на исходе интоксикации. Во всяком случае, приведенные данные свидетельствуют в пользу применения этого метода на самых ранних этапах врачебной помощи.
Итак, мы полагаем целесообразным обобщить варианты синаптического и внесинаптического дистантного действия, отмечаемые при отравлении ФОИ в табл. 6.
■ Таблица 6.Холинэргическое действие ФОС
Синаптическое действие
Антихолинэстеразное Торможение ХЭ -» накопление в синапсе АХ -> холинопозитивный или негативный эффект
Неантихолинэстеразное
а) Холиносенситизирующее — повышение сродства к АХ -> потенцирование эффекта АХ.М-ХР
б) Десенситизирующее — снижение сродства к АХ -> ослабление эффекта АХ..........М-ХР
в) Взаимодействие с функциональными ХР — деполяризация или гиперполяризация......М-ХР и Н-ХР
г) Влияние на освобождение АХ — облегчение -> потенцирование Н-ХР, подавление -» ослабление М-ХР
д) Взаимодействие с ионными каналами — активация, потенцирование или блок............Н-ХР
Дистантное внесинаптическое действие Эффект
Влияние на клетки, не имеющие иннервации; а) эритроциты — деформация и разрывы оболочки -> конгломерация, закупорка сосудов; б) эндотелиоциты — нарушение рельефа, расхождение клеток, фенестрация; в) тучные клетки — дегрануляция, выброс гистамина -» Гемическая гипоксия -> Нарушение микроциркуляции, отек -> Активация ^-рецепторов, гистамина, парез капилляров, спазм бронхов -»
Литература
1. Военная токсикология, радиология и медицинская защита: Учебник / Под ред. Н.В. Саватеева. Военно-мед. акад. 2-е изд., перераб. и доп. — Л.,\1987.
2. Военная токсикология, радиология и медицинская защита: Учебник/Под ред. С.А. Куценко. — СПб.: Фолиант, 2004.
3. Году хин О. В. Модуляция синаптической передачи в мозге. — М.: Наука, 1987,
4. Гэликов С. Н., Розенгарт В. И. Холинэстеразы и ан^ихолинэстеразные вещества. — Л.: Медицина, 1964.
5. Гэликов С.Н. Профилактика и терапия отравлений
6.
фосфорорганическими инсектицидами. — М. ; Медицина, 1968.
Каг^ан Ю.С. Общая токсикология пестицидов. — Киев: Здоровья, 1981.
7. Козаков В. П., Куценко С.А., Маркин Б.А. и др. Проблемы создания средств оказания первой погЬощи на объектах уничтожения химического
8.
10.
11.
оружия // Рос. хим. журн. им. Д. И. Менделеева. — 1993. - Т. 3, № 3. - С. 99-101.
Литвинов Я.Я., Остапенко Ю.Я., Казачко В. И. и др. Анализ зарубежных и отечественных статистических данных по острым химическим отравлениям // Токсикол. вестн. — 1997. — №5. — С. 5-12.
Лужников Е.А. Клиническая токсикология М.: Медицина, 1994.
Михельсон М.Я., Зеймаль Э.В. Ацетилхолин. — Л.: Наука, 1970.
Прозоровский В.Б., Ливанов Г.А. Некоторые теоретические и клинические проблемы токсикологии фосфорорганических
инсектицидов // Токсикол. вестн. — 1997. — Ns3.-C.2-11.
12. Прозоровский В.Б., Саватеев Н.В. Неантихолинэстеразное действие антихолинэсеразных средств. — Л.: Медицина,
1976.
13. Прозоровский В.Б., Скопичев В.Г. Морфологические изменения эритроцитов мышей и крыс при воздействии фосфорорганических ингибиторов холинэстераз // Бюл. эксперим. биол. и мед. —
1993. - Т. 115, № 45. - С. 443-445.
14. Прозоровский В.Б., Скопичев В.Г., Петров В.В., Дубровник М. С. Структурные изменения эритроцитов крыс при отравлении фосфаколом // Бюл. эксперим. биол. и мед. — 1995. — Т. 119, № 5. -С. 517-520.
15. Прозоровский В.Б., Скопичев В.Г., Ардабьева Т.В.. Панов П. Б. Структурные изменения эритроцитов как возможная причина низкой эффективности специфический терапии отравлений карбофосом // Морфология. — 1997. — Т. 116, № 6. — С. 60-64.
16. Прозоровский В. Б, Чепур С. В. Новое в эффектах фосфорорганических ингибиторов холинэстеразы //
. Токсикол. вестн. — 2001. — №4. — С. 2-7
17. Указания по военной токсикологи МО РФ / Под ред. И.М. Чижа. — М.: ГВКГим. Н.Н. Бурденко, 2000.
18. Furchgott R.F., Zawadski A. The obligatory role ofendotelial cells in relaxation of arterial muscle by cetylcholine // Nature. — 1980. — Vol. 288,
N 5780. - P. 373-376.
19. Masuda N.. Takatsu М., Monad H., Ozawa T. Sarin poisoning in Tokyo subway// Lancet. — 1995. —
N8962.- P. 1446-1447.
20. McKenzie J.E., Scandling D.M., Ahle N.A. etal. Effects of soman on coronary blood and cordial functijn
in swine // Fundam. Appl. Toxicol. — 1996. — Vol. 29,
N 1. - P. 140-146.
