CC BY
1
УДК 619:616.155.3:636.2
ДИНАМИКА ПЕРСИСТИРОВАНИЯ В КРОВИ КОЛОСТРАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ И НАПРЯЖЕННОСТЬ ИММУНИТЕТА ТЕЛЯТ, ПОЛУЧАВШИХ МОЛОЗИВО БОЛЬНЫХ ЛЕЙКОЗОМ КОРОВ-МАТЕРЕЙ
Мотавина Людмила Ивановна, канд. биол. наук, ассистент кафедры «Технология мяса и молока», ФГБОУ ВПО Башкирский ГАУ.
450001, Республика Башкортостан, г. Уфа, ул. 50-летия Октября, д. 34.
E-mail: [email protected]
Сахаутдинов Ильфат Салаватович, аспирант кафедры инфекционных болезней, зоогигиены и ветсанэкспер-тизы, ФГБОУ ВПО Башкирский ГАУ.
450001, Республика Башкортостан, г. Уфа, ул. 50-летия Октября, д. 34.
E-mail: [email protected]
Ключевые слова: вирус, лейкоз, антитела, молозиво, биопроба, иммунитет.
Цель исследования - научное отслеживание возрастной динамики персисистирования в сыворотке крови антител у телят, получавших молозиво больных лейкозом коров-матерей. Результаты представленные в данной статье говорят о том, что у телят, полученных от РИД и особенно от РИД+ коров-матерей в процессе роста и развития в организме нарушается баланс Т- и В-лимфоцитов. Наиболее ярко эти негативные перестройки развиваются в организме телят от РИД+ коров-матерей. Они проявляются в виде уменьшения в крови уровня Т-лимфоцитов, Т-хелперов, В-лимфоцитов и активизации реакции Т-супрессоров в крови телят от РИД+ коров-матерей и развития положительных иммунологических перестроек в содержании Т- и В-клеток, хотя эти изменения не являются достаточными для их полного баланса и по выраженности уступают таковым в организме телят от РИД коров-матерей. Известно, что молоко от больных лейкозом коров не только содержит вирус, но и способно вызывать инфицирование телят. Однако в стаде с высоким процентом животных, инфицированных ретровирусом, установлено, что около 90% телят после приема молозива имеют антитела к вирусу лейкоза крупного рогатого скота, но лишь 19% из них являются вирусоносителями. То есть, большинство телят получают материнские антитела к ретровирусу с молозивом и для выделения инфицированных телят в это время лучше применять методы, позволяющие выявлять вирус, такие как тест синцитиеобразования. Установлено, что все телята, родившиеся от больных лейкозом коров-матерей и содержащиеся в изоляторах, в месячном возрасте имели антитела к вирусу лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС). Причём, титры антител у 90,4% телят в 5-дневном возрасте были максимальными (1:32 - 1:64). Выявили постоянное снижение титров к 6-месячному возрасту и лишь у 19% телят обнаруживали антитела в титре 1:16. У большинства незараженных телят колостральные антитела исчезают через 5 месяцев после рождения. У телят, зараженных ВЛКРС и своевременно получивших молозиво матери, высокая концентрация антител сохранятся в течение всего первого года жизни, у безмолозивных животных антитела к ВЛКРС выявляются с 2-3-месячного возраста.
Развитие скотоводства как основной отрасли животноводства, обеспечивающей население мясом и молоком, во многом обусловлено благополучием по инфекционным болезням. Среди всех случаев инфекционной патологии крупного рогатого скота в Российской Федерации лейкоз занимает ведущее место. Огромный ущерб, наносимый лейкозом животноводству, складывается не только из потерь, связанных с гибелью и преждевременной выбраковкой высокопродуктивных коров, снижением продуктивности, качества молока, затратами на проведение противолейкозных мероприятий, но и рождения телят с иммунодефицитами. Несмотря на значительное число научных исследований по проблеме лейкоза, эта инфекция остается еще малоизученной. Профилактика и борьба с лейкозом базируется на основе строгого выполнения комплекса мер по охране благополучных стад от заноса инфекции вируса лейкоза крупного рогатого скота, выявлении и удалении больных, и инфицированных животных [1, 4, 6].
Цель исследований - научное отслеживание возрастной динамики персистирования в сыворотке крови колостральных антител у телят, получавших молозиво больных лейкозом коров-матерей.
Задачи исследований: изучить состояния Т- и В-систем иммунитета телят, полученных от РИД- и РИД + коров-матерей; установить иммунный статус телят, полученных от РИД и РИД + коров-матерей; изучить динамику персистирования колостральных антител в крови телят по возрастным периодам.
Материалы и методы исследований. Опыты проводили на телятах, рожденных от больных лейкозом коров-матерей черно-пестрой породы. Опытные группы телят формировались выбором случайного отбора из групп высокого риска. Коровы принадлежат неблагополучной по лейкозу МТФ №2 ООО «Агромир» Аургазинского района. Материалом для исследований служила сыворотка крови, полученная от телят в динамике с 1 по 12-й мес. жизни. Для изучение показателей Т- и В-систем иммунитета взятие крови из хвостовой вены осуществляли с помощью одноразовых закрытых систем «Моноветт», проводили первый раз до выпойки молозива и далее на 30, 60, 90, 120, 150, 180-й дни после рождения для гематологических,
биохимических, иммунологических и серологических исследований. Из коров-матерей были сформированы три группы (контрольная и две опытные) по десять голов в каждой [2, 3]. Количество Т- и В-лимфоцитов определяли методом спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана по Wybran et al. (1972). Фагоцитарную активность (ФА) лейкоцитов в крови устанавливали путем реакции фагоцитоза с латексом (С. Г. Потапов и др., 1977). Количество циркулирующих иммунных комплексов - по методу Ю. А. Гриневича, Н. И. Алферова (1981). Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием пакета статистического анализа для Microsoft Excel. Достоверность различий между группами по количественным признакам оценивалась при помощи t-критерия Стьюдента.
Результаты исследований. У телят после рождения перед первым скармливанием молозива в первые 10 часов жизни подсчитывали количество лейкоцитов в крови общепринятым в гематологии методом и определяли наличие антител в РИД с гликопротеидным антигеном ВЛКРС. Одновременно для выявления вируса кровь телят вводили интраперитонеально здоровым свободным от ВЛКРС овцам 8-12-месячного возраста. Овец содержали в отдельном помещении. Овец, на которых ставили биопробу, исследовали ежемесячно в течение трех месяцев на наличие антител к ВЛКРС с помощью РИД. За телятами наблюдали до 12-месячного возраста. Серологические (РИД) и гематологические исследования проводили ежеквартально [4, 5].
Результаты опытов показали (табл. 1), что в отдельных группах отмечали от 11,1 до 35,2% телят, заразившихся ВЛКРС пренатально. В среднем 21% телят, родившихся от инфицированных ВЛКРС коров, был инфицирован в пренатальный период отногенеза. При исследовании в РИД и РДСК сывороток крови новорожденных телят до приема молозива антитела к вирусу лейкоза крупного рогатого скота не были выявлены [4].
Таблица 1
Результаты изучения частоты пренатальной передачи вируса лейкоза_
Опытные группы Количество коров, гол./групп Количество телят, гол./групп Из них инфицировалось пренатально, %
1 21 21 4 19
2 16 16 3 18,7
3 18 18 2 11,1
4 17 17 6 35,2
Всего 72 72 15 21,0+6,0*
Примечание: * - р< 0,05.
Через сутки после приема молозива у всех телят в сыворотке крови обнаружены антитела против вируса лейкоза. У 12 телят титры антител в РДСК были 1:128, а у 18 - 1:64. При сравнительном анализе титров антител коров-матерей и телят выявлено, что у коров в сыворотке крови они не превышали 1:32. Интересно отметить, что от коров с высоким титром антител телята в свою очередь получали большее количество антител. При исследовании телят в первые 10 дней после рождения титры антител в РДСК не имели заметных различий. К 15 дню после приема молозива у 5 телят было отмечено снижение титра антител, причем у одного теленка, имеющего титр 1:128, он снизился до 1:64, а у четырех животных с титром 1:64 до 1:32 [4, 5, 6].
Титр антител к ВЛКРС в сыворотках крови телят заметно снижается к месячному возрасту. В месячном возрасте 19 телят имели титр антител в РДСК 1:64 (63,3%), 2 телят - 1:32 (36,7%). К 3-месячному возрасту у 14 телят антитела не были выявлены в сыворотке крови, 6 телят имели титр 1:4 и 10 - 1:16. В возрасте 4 месяца антитела к ВЛКРС сохранялись у 15 телят (10 телят с титром 1:4 и 5 телят с титром 1:8), которые к пятимесячному возрасту стали серологически отрицательными [5]. Следует отметить, что за время совместного содержания с инфицированными ВЛКРС животными, телята не заразились от них. Это говорит о том, что телят от заражения в это время предохраняли колостральные антитела против ВЛКРС, полученные о коров-матерей с молозивом. Такое предположение подтверждается и тем, что при последующем совместном содержании этих телят, но уже без колостральных антител против ВЛКРС произошло естественное заражение одного теленка в возрасте 8 месяцев. Методом биопробы на овцах и тестом синцитиеобразования у этого животного был выявлен вирус.
Через 30 дней после введения лейкоконцентрата у овец из яремной вены брали 1-2 см3 крови и проводили исследование сыворотки в РИД согласно методическим указаниям. У двух испытуемых овец были обнаружены антитела к ВЛКРС, у овец контрольной группы антитела к ВЛКРС обнаружены не были.
Из анализа полученных данных для изучения показателей Т- и В-систем иммунитета телят было определено содержание Т-клеток в крови телят: от РИД- коров-матерей, было ниже, чем в контроле в 1,53-1,54 раза (на14,5-14,7%), а в крови телят от РИД+ коров - в 1,88-1,92 раза (на 19,5-20%). Уровень Т-лимфоцитов в крови животных 2 группы по ходу опытов постепенно понижался и уступал фоновому и контрольному значениям на 30 день опыта в 1,07 и 1,69 раза (на 1,9 и 17,4%), на 60 день - в 1,16 и 1,93 раза (на 3,8 и 21,5%),
на 90 день - в 1,31 и 2,14 раза (на 6,5 и 23,4%), на 120 день - в 1,35 и 2,23 раза (на 7,0 и 24,6%), на 150 день - в 1,39 и 2,3 раза (на 7,6 и 25,0%), на 180 день в 1,44 и 2,37 раза (на 8,3 и 25,6%). Динамики содержания Т-лимфоцитов в крови телят от РИД- и РИД+ коров-матерей представлены в таблице 2.
Таблица 2
Динамика Т-лимфоцитов в крови телят, полученных от РИД- и РИД+ коров-матерей_
Срок исследования, дни Результаты исследований (М±т, п=10)
Контроль - здоровые РИД родитель РИД+ родитель
Т-лимфоциты, %
1 41,6±5,01 26,9±1,21 22,1±0,09
30 42,4±5,22 25,0±0,12*** 20,1±0,54***
60 44,7±5,09 23,1±1,05*** 18,4±1,23"
90 43,8±5,02 20,4±0,9Г 16,3±1,09"
120 44,5±4,91 19,9±0,89*** 14,7±0,18*"
150 44,3±4,81 19,3±1,05 13,6±1,02***
180 44,2±4,04 18,6±1,25" 12,5±0,98"
Примечание: *- достоверность различий значений показателей крови р< 0,05; " - р < 0,01; ~ - р < 0,001.
Максимальное понижение числа Т-клеток отмечалось в крови телят, полученных от РИД+ коров-матерей. Описываемый показатель понизился по сравнению и с первоначальным, и с контрольным уровнем: к 30 дню исследований: в 1,09 и 2,1 раза (на 2,0 и 22,3%), к 60 дню - в 1,2 и 2,42 раза (на 3,7 и 26,2%), к 90 дню - в 1,35 и 2,68 раза (на 5,8 и 27,5%), к 120 дню - в 1,5 и 3,02 раза (на 7,4 и 29,8%), к 150 дню -в 1,63 и 3,26 раза (на 8,5 и 30,7%), к 180 дню - в 1,76 и 3,53 раза (на 9,6 и 31,7%) [4, 5].
Данные по исследованию динамики изменения содержания в крови телят Т-хелперов представлены в таблице 3. Уровень Т-хелперов в крови животных контрольной группы не имел выраженных изменений по срокам опыта и колебался в пределах от 20,4 до 22,7%. Показатели Т-хелперов в крови телят опытных групп уже к началу исследований были ниже, чем в контроле. Их фоновое значение в крови телят от РИД- коров-матерей к началу опытов составило 16,4-16,8%, от РИД+ коров- матерей -13,0-13,2% [2, 4].
Таблица 3
Динамика Т-хелперов в крови телят, полученных от РИД- и РИД+ коров-матерей_
Срок исследования, дни Результаты исследований (М±т, п=10)
Контроль - здоровые РИД родитель РИД+ родитель
Т-хелперы, %
1 20,9±0,38 16,4±0,12 13,2±0,18
30 22,4±0,32 15,0±0,18~ 12,4±0,11 *"
60 21,8±0,48 13,4±0,23" 11,0±0,13*"
90 22,7±0,52 11,6±0,20 10,2±0,19"
120 20,4±0,44 11,9±0,19 9,4±0,10
150 20,8±0,36 11,6±0,18 8,5±0,12
180 21,1±0,26 11,2±0,17~ 7,6±0,08
Примечание: *- достоверность различий значений показателей крови р< 0,05; " - р < 0,01; ~ - р < 0,001.
В крови телят 2 группы регистрировалось понижение уровня хелперных реакций. К 30 дню исследований содержание Т-хелперов уступало фоновому и контрольному значениям на 1,09 и 1,49 раза (на 1,4 и 7,4%), к 60 дню - на 1,22 и 1,62 раза (на 3,0 и 8,4%), к 90 дню - на 1,41 и 1,94 раза (на 4,6 и 11,0%), к 120 дню - на 1,37 и 1,71 раза (на 4,5 и 8,5%), к 150 дню - на 1,41 и 1,79 раза (на 4,8 и 9,2%), к 180 дню - на 1,46 и 1,88 раза (на 5,2 и 9,9%). Уровень Т-хелперов в крови телят 3 группы, полученных от РИД+ коров-матерей, прогрессивно падал по срокам исследований. Данный показатель уменьшился по сравнению с его фоновым и контрольным значением у животных описываемой группы соответственно к 30, 60, 90, 120, 150 и 180 дням опыта в 1,06 и 1,8 раза (на 0,8 и 10,0%), в 1,2 и 1,98 раза (на 2,2 и 10,8%), в 1,29 и 2,21 раза (на 3,0 и 12,4%), в 1,4 и 2,17 раза (на 3,8 и 11,0%), в 1,55 и 2,44 раза (на 4,7 и 12,3%), в 1,73 и 2,77 раза (на 5,6 и 13,5%) соответственно. К концу опыта содержание Т-хелперов в крови телят опытных групп было ниже, чем у животных контрольной группы [4].
Таким образом, уровень Т-хелперов в крови телят 3 группы, полученных от РИД+ коров-матерей, прогрессивно падал по срокам исследований.
Результаты, полученные при исследовании динамики изменения содержания в крови телят реакции Т-супрессоров, приведены в таблице 4. Уровень Т-супрессоров в крови телят контрольной группы за период проведённых исследований не имел выраженных колебаний и находился в пределах от 13,8 до 14,4%. Содержание Т-супрессоров в крови животных от РИД- и особенно от РИД+ ИД коров-матерей к началу опытов
было повышено. Их фоновое значение в крови телят, полученных от РИД коров-матерей, составило 17,217,7%, а в крови телят от РИД+ родителя - 19,4-19,6%.
Таблица 4
Динамика изменения содержания Т-супрессоров в крови телят, полученных от РИД- и РИД+ коров-матерей
Срок исследования, дни Результаты исследований (М±т, п=10)
Контроль - здоровые РИД родитель РИД+ родитель
Т-супрессоры, %
1 14,4±0,31 17,7±1,23 19,4±1,52
30 13,8±0,89 17,9±1,02*** 20,1±1,02
60 14,2±1,03 18,6±0,98" 21,9±0,82"
90 14,0±0,35 19,3±0,58 23,0±0,98***
120 14,3±0,25 19,9±1,02 23,1±1,95"
150 14,2±0,45 19,8±1,25"" 23,4±1,45""
180 14,4±1,01 19,7±1,32 23,5±0,99"*
Примечание: "-достоверность различий значений показателей крови р< 0,05; ** - р < 0,01; "* - р < 0,001.
Уровень Т-супрессоров в крови животных 2 группы, полученных от РИД-ИД коров-матерей увеличился, по сравнению с его фоновым и контрольным показателями, к 30, 60, 120, 90, 150, 180 дням исследований соответственно в 1,01 и 1,28 раза (на 0,2 и 4,0%), в 1,05 и 1,3 раза (на 0,9 и 4,4%), в 1,09 и 1,37 раза (на 1,6 и 5,3%), в 1,12 и 1,4 раза (на 2,2 и 5,7%), в 1,11 и 1,39 раза (на 2,1 и 5,6%), в 1,11 и 1,37 раза (на 2,0 и 5,4%). Значительная активизация Т-супрессоров отмечалась в организме телят 3 группы, где наблюдалось повышение описываемого показателя по сравнению с его уровнем до опыта и в контроле к 30 дню исследований в 1,0,3 и 1,44 раза (на 0,7 и 6,2%), к 60 дню - в 1,12 и 1,54 раза (на 2,5 и 7,7%), к 90 дню - в 1,18 и 1,64 раза (на 3,6 и 9,0%), к 120 дню - в 1,22 и 1,66 раза (на 4,3 и 9,5%), к 150 дню - в 1,21 и 1,65 раза (на 4,0 и 9,2%), к 180 дню - в 1,21 и 1,64 раза (на 4,1 и 9,2%).
Таблица 5
Динамика изменения содержания В-лимфоцитов в крови телят, полученных от РИД и РИД+ коров-матерей
Срок исследования, дни Результаты исследований (М±т, п=10)
Контроль - здоровые РИД родитель РИД+ родитель
В-лимфоциты, %
1 16,3±0,21 14,1±0,17 12,6±0,10
30 16,8±0,18 13,4±0,16" 12,1±0,16"
60 17,6±0,17 12,6±0,09 11,3±0,15
90 18,4±0,26 13,9±0,23 10,6±0,16
120 17,9±0,22 14,2±0,21 9,3±0,17
150 18,0±0,21 14,3±0,20""" 9,1±0,14
180 18,2±0,23 14,4±0,19 9,0±0,12
Примечание: "- достоверность различий значений показателей крови р< 0,05; " - р < 0,01; """ - р < 0,001.
Как видно из таблицы 5, уровень В-лимфоцитов в крови телят контрольной группы за период опытов колебался в пределах от 16,3 до 18,4%, повышаясь до 90 дня опыта в возрастном аспекте. Фоновый показатель содержания В-лимфоцитов в крови животных опытных групп был понижен у телят от РИД- коров-матерей до 13,7-14,1%, у телят полученных от РИД+ коров матерей - до 12,6-12,8% [2, 3, 4].
В процессе опытов в крови животных наблюдалось дальнейшее понижение уровня В-клеток. Их значение в крови телят 2 группы уменьшилось к 30 дню исследований, по сравнению с фоновым и контрольным показателями, в 1,07 и 1,25 раза (на 0,7 и 3,4%), к 60 дню - в 1,11 и 1,39 раза (на 1,5 и 5,0%), к 90 дню - в 1,01 и 1,31 раза (на 0,2 и 4,4%). Содержание В-лимфоцитов в крови телят 3 группы (от РИД+ коров-матерей в процессе опыта интенсивно понижалось и уступало фоновому и контрольному значениям к 30 дню исследований в 1,04 и 1,38 раза (на 0,5 и 4,7%), к 60 дню - в 1,11 и 1,55 раза (на 1,3 и 603%), к 90 дню - в 1,18 и 1,72 раза (на 2,0 и 7,7%), к 120 дню - в 1,35 и 1,92 раза (на 3,3 и 8,6%), к 150 дню - в 1,38 и 1,98 раза (3,5 и 8,9%), к 180 дню - в 1,4 и 2,02 раза (3,2 и 9,2%) [2, 4].
Заключение. По результатам проведённых исследований было выявлено, что телят от заражения ВЛКРС защищали колостральные антитела, полученные от коров-матерей с молозивом. Сохранение высокой концентрации колостральных антител у некоторых телят старше 6-месячного возраста происходит вследствие особенностей структурной организации и функционального состояния их иммунной системы или кратковременной аутоиммунизации.
Анализ полученных результатов при изучении показателей Т- и В-систем иммунитета говорит о том, что у телят, полученных от РИД- и особенно от РИД+ коров-матерей, в процессе роста и развития в организме нарушается баланс Т- и В-лимфоцитов. Наиболее ярко эти негативные перестройки развиваются в организме
телят от РИД+ коров-матерей. Они проявляются в виде уменьшения в крови уровня Т-лимфоцитов, Т-хелперов, В-лимфоцитов и активизации реакции Т-супрессоров в крови телят от РИД+ коров-матерей, а также развиваются положительные иммунологические перестройки в содержании Т- и В-клеток, хотя эти изменения не являются достаточными для их полного баланса и по выраженности уступают таковым в организме телят от РИД- коров-матерей. Таким образом, снижение в крови уровня Т-лимфоцитов, Т-хелперов, В-лимфоцитов свидетельствует о физиологической гипоглобулинемии, которая наблюдается при отсутствии пассивного переноса иммуноглобулинов у новорожденных телят, о приобретённом дефекте синтеза иммуноглобулинов, недостаточности гуморального звена иммунитета [2, 4].
Библиографический список
1. Андреева, А. В. Динамика роста и развития новорожденных телят при дефиците микроэлементов и его коррекции / А. В. Андреева, О. Н. Николаева, Р. Г. Насретдинов // Достижения науки и техники АПК. - 2010. - №2. - С. 46-48.
2. Мотавина, Л. И. Иммунобиологический статус коров-матерей и телят при лейкозном процессе / Л. И. Мотавина, А. И. Иванов // Вестник Башкирского государственного аграрного университета. - Уфа : ФГБОУ ВПО Башкирский ГАУ, 2012. - №4 (24). - С. 27-29.
3. Мотавина, Л. И. Динамика изменения иммуноглобулинов в сыворотке крови телят, полученных от серонегативных (РИД-) и серопозитивных (РИД+) коров-матерей / Л. И. Мотавина, А. И. Иванов // Вестник мясного скотоводства. - Оренбург, 2013. - Т. 3, № 81. - С. 34-39.
4. Мотавина, Л. И. Эпизоотология, иммунобиологический статус коров-матерей и телят, инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота : дис. ... канд. биол. наук : 06.02.02 / Мотавина Людмила Ивановна. - Уфа, 2012. - 134 с.
5. Рамеев, Т. В. Длительность персистирования в крови, напряженность иммунитета и титр колостральных антител в динамике у телят, получавших молозиво больных лейкозом коров-матерей / Т. В. Рамеев, Л. И. Мотавина, А. Х. Таюпов, И. С. Сахаутдинов // Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии. - 2010. - №4. - С. 19-20.
6. Рамеев, Т. В. Передача вируса и распространение лейкоза крупного рогатого скота в хозяйствах Аургазинского района Республики Башкортостан / Т. В. Рамеев, Л. И. Мотавина, Р. Ф. Галеев // Научное обеспечение инновационного развития АПК : мат. Всероссийской научно-практической конференции. - Уфа : Башкирский ГАУ, 2010. - Ч. II. - С. 224226.
7. Сахаутдинов, И. С. Эпизоотологический мониторинг при лейкозе крупного рогатого скота в Миякинском районе // Вестник Башкирского ГАУ. - Уфа : ФГБОУ ВПО Башкирский ГАУ, 2013. - №3 (27). - С. 54-55.
8. Якупов, Т. Р. Возможности ИФА молока в диагностике лейкоза крупного рогатого скота / Т. Р. Якупов, Н. З. Хази-пов, А. М. Алимов, Б. В. Камалов // Ученые записки Казанской ГАВМ им. Н.Э. Баумана. - Казань, 2010. - Т. 201. - С. 133136.
9. Якупов, Т. Р. Молекулярно-генетические и иммунохимические методы в диагностике, индикации и идентификации возбудителей туберкулеза и лейкоза крупного рогатого скота [ИФА и ПЦР] : автореф. ... дис. д-ра вет. наук : 06.02.02 / Талгат Равилович Якупов. - Казань, 2011. - С. 49.
10. Зиннатов, Ф. Ф. Диагностическая ценность выявления провирусной ДНК ВЛКРС в молоке / Ф. Ф. Зиннатов, Т. Р. Якупов // Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии. - 2010. - №4. - С. 21-22.
