CC BY
62
УДК 630*232.3 1нж. Ю.М. Юсипович; ст. наук. ствроб. В.А. Ковальова, канд. бюл. наук; проф. Р. Т. Гут, д-р бюл. наук - НЛТУ Украши, м. Львiв
Д1АГНОСТИКА КОРЕНЕВО1 ГУБКИ (HETEROBASIDION ANNOSUM (FR.) BREF. S.STR.) МЕТОДОМ ПОЛ1МЕРАЗНО-ЛАНЦЮГОВО1 РЕАКЦН1
Представлено методику визначення ДНК коренево!' губки (Heterobasidion anno-sum s.str.) у тканинах сосни звичайно!' шляхом полiмеразно-ланцюговоï реакци (ПЛР) i3 використанням специфiчних праймерiв. Методику апробовано на трирiчних сiянцях сосни звичайноï, штучно шфжованих мiцелieм кореневоï губки. Проведено дiагностику санiтарного стану 40-рiчних дерев i3 осередкiв поширення фiтопатогена у соснових насадженнях
Ключовг слова: коренева губка, сосна звичайна, псшмеразно-ланцюгова реакцiя.
Вступ. Одним 1з найбшьш небезпечних збудниюв грибних хвороб у соснових деревостанах е коренева губка (Heterobasidion annosum (Fr.) Bref.). Гриб належить до базидюмщепв i е факультативним паразитом, що тривалий час мо-же iснувати як сапрофiт, який живиться залишками деревини у пщстилщ та rрунтi. Коренева губка поширюеться на живi дерева тiльки за умов серйозних порушень у бюгеоценоз^ якi виникають внаслiдок впливу природних та антро-погенних факторiв. Осередки всихання в сосновому насадженнi зазвичай фор-муються в мiсцях, де вплив негативних чинниюв (нестача вологи, пщтоплення, iнтенсивнi вибiрковi рубки, тощо) викликае найбiльше напруження i призво-дить до його куртинного нерiвномiрного ослабления. У монокультурах сосни, створених за однаковою схемою в подiбних умовах, такими мiсцями можуть бути фрагментарш Грунтовi вiдмiнностi, як характеризуются потужним гуму-сованим шаром або наявнютю на невеликих глибинах шарiв Грунту з бiльшою об'емною масою та тдвищеною щiльнiстю [1].
Первинне шф^вання здорових насаджень, частiше за все, вщбуваеться через потрапляння базидюспор на свiжозрiзану поверхню стовбура. Спори про-ростають, i мiцелiй, що розвиваеться, переходить до заболонноï деревини коре-ня, спричиняючи кореневу гниль. Вторинне зараження, яке сприяе поширенню гриба у насадженш, здiйснюеться мiцелiем у мюцях контактiв або зростання ко-ренiв здорових i хворих дерев. Iнфiкувания дерев також вщбуваеться через трь щини на коренях, через вiдмерлi дрiбнi корiнцi або мертвi закшчення коренiв. Коренева губка доходить до кореневоï шийки, шдшмаючись по стовбуру на ви-соту до 1 -2 м, утворюючи суцшьну гниль, що зумовлюе швидке всихання дерева. Зазвичай, ранш етапи шф^вання кореневою губкою проходять без види-мих ознак. На шзшх етапах, коли гниль стае суцшьною, у хворих дерев помггно зменшуеться прирют; крона стае ажурною, тьмяше i жовтiе хвоя. Для попере-дження масового ураження деревосташв та вчасного впровадження лiсiвничих заходiв щодо боротьби з кореневою губкою важливо ще на раннiх етапах поширення гриба у насадженш виявляти уражеш мiцелiем дерева i вилучати ïх.
Hайпоширенiшим заходом захисту насаджень вщ пошкодження кореневою губкою е вибiрковi санiтарнi рубання. Сьогоднi ступiнь життездатностi дерев у насадженнях, уражених кореневою губкою, визначають за зовшшшми оз-наками, але цей метод не е точним, оскшьки ураження кореневою губкою ос-
1 Робота тдтримана грантом ДФФД Украши (проект № Ф41.4/049).
hobhoï маси коршня меншою мiрою позначаються на зовшшшх ознаках дерев. При вiдборi за зовнiшнiми ознаками дерев у вибiрковi санiтарнi рубки значна частина уражених кореневою губкою стовбурiв залишаеться, що е однieю з причин подальшого поширення хвороби га ютотно знижуе ефекгивнiсгь цього заходу. Рання дiагностика санiтарного стану дерев за бюелектрнчними показника-ми, як характеризують рiвень метаболiзму дерев, дае змогу вiдбирати латентно уражет патогеном екземпляри. Перспективними для визначення стану дерев е показники струмопровщносп прикамбiального шару тканин (ССП). Основним методом фгтопатолопчного контролю лiсiв в Украш залишаеться вiзуальне об-стеження, яке не дае змогу виявляти кореневу гниль на раншх етапах, i тому ак-туальним е впровадження в практику лiсового господарства чутливих високос-пецифiчних молекулярно-генетичних метсдав дiагностики та iдентифiкацiï фгто-патогешв, за допомогою яких можна визначити присутшсть ДНК Неterobasidion annosum у рослинах i Грунта.
На сьогодт у медицинi та сiльському господарст широко застосову-ють чутливi молекулярш методи iдентифiкацiï патогенних органiзмiв, зокрема, рiзнi модифiкацiï полiмеразно-ланцюговоï реакцiï. Метою цiеï роботи е розроб-лення методики визначення кореневоï губки в тканинах сосни на основi ПЛР зi специфiчними праймерами, яка дала б змогу та ефективно проводити дiагности-ку цього фiтопатогена у соснових насадженнях.
Матер1али i методи. У робот використано iзоляг кореневоï губки, який видiлено iз плодового тла в сосновому насадженнi Страдчанського навчально-виробничого комбiнату. Мiцелiй гриба Heterobasidion annosum (Fr.) Bref. sensu stricto (s.str.) отримано шляхом виаву базщоспор iз плодового тiла кореневоï губки на поживне середовище - 2 % LB-агар. Культуру гриба дослщжено мш-роскопiчно та ПЛР зi специфiчними праймерами.
Сiянцi сосни звичайноï вирощували упродовж трьох роюв на науково-дослiднiй дiлянцi Ботатчного саду НЛТУ Украïни. Для зараження сiянцiв сосни використовували блоки агару розмiром 0,5x0,5x0,3 см, як мютили мiцелiй гриба. Iнокуляцiю проводили тд кору, мiсце зрiзу iзолювали парафiном i через 30 дiб вщбирали зразки деревини з мiсця ураження для мiкроскопiчного i ПЛР аналiзу. За негативний контроль слугували аянщ з тiеï ж дiлянки, яю iнокулювали агаром без мiцелiю. Експериментальна i контрольна група мiстили по 5 сiянцiв.
Для визначення кореневоï губки у тканинах дерев, природно уражених фгтопатогенним грибом, вiдiбрано зразки корешв i деревини (керни) з дерев в осередку поширення кореневоï губки у 40-рiчному сосновому насадженш Лопа-тинського лiсництва ДП "Радехiвське ЛГ".
Видiлення ДНК iз тканин сосни проводили ЦТАБ-методом [2, 4]. Поль меразну ланцюгову реакцгю для визначення кореневоï губки здiйснювали за допомогою праймерiв, прямого MJ-F: 5'-GGTCCTGTCTGGCTTTGC-3' та зворот-ного MJ-R: 5'-CTGAAGCACACCTTGCCA-3' [8]. Реакцiйна сумiш для ПЛР мiс-тила 2,5 мМ MgCl2; 0,2 мМ дНТФ (Fermentas); 0,8 рМ кожного праймера, 1мкг ДНК та 1 U TaqPol ДНК-полiмерази (Fermentas). Умови ПЛР: початкова денату-рацiя 95°С, 3 хв та 35 цикшв: денатурацiя 95°С, 1 хв; вiджиг 53°С, 1 хв; елонга-цiя 72°С, 1 хв i тсля останнього циклу ще 10 хв елонгацiï за температури 72°С. Очiкувана довжина амплiфiкованого продукту - 100 пар нуклеотидiв
(п.н.). Для контролю вмюту ДНК сосни у дослiджуваних зразках використову-вали праймери до послщовносп генуPsDef2, прямий Def2-F: 5'-GAATGTGC AAAACCCCAAGT-3' та зворотний Def2-R: 5'-GGGCAGGGTTTGTAGCAGTA-3' [6]. Довжина очжуваного продукту 148 п.н. Продукта ПЛР роздшяли в 2 % агарозному гелi у 0,5 % трис-боратному буферi, забарвлювали бромистим ети-дieм (0,5 мкг/мл), вiзуалiзували за допомогою УФ-трансiлюмiнатора та фотогра-фували. Кшьюсний розрахунок ДНК проводили за допомогою програми GelPro Analyzer 4.0 "MediaCybernetics", США.
Результати i обговорення. У межах виду коренево! губки юнують рiзнi iзолята гриба так зваш iнтерстерильнi групи: P - H. annosum, S - H. parviporum та F - H. abietinum. У Сврош поширений P-тип, який часто уражае Pinus sylvestris L., проте може iнфiкувати й iншi види хвойних. S-тип паразитуе на ялиш бiлiй (Picea abies), а основним господарем для F-типу коренево! губки е Abies alba та iншi види роду Abies [7]. Для отримання чисто! культури коренево! губки H. annosum s.str. вдабрано плодовi тiла в сосновому насадженш на тери-торi! Страдчанського навчально-виробничого комбiнату (рис. 1. А). 1з базидюс-пор вирощували мiцелiй коренево! губки. 1дентифжащю гриба проводили мш-роскопiчно i ПЛР. На рис. 1 В у свгтловому мжроскош (Zeizz, Нiмеччина) при збiльшеннi 10x25x100 простежуються сформованi конiдiеносцi з конщефорами на фонi яких помiтнi кошдюспори, властивi для нестатевого розмноження коре-нево! губки [3].
Рис. 1.1дентифжацш культури кореневоИгубки: А) плодове тгло кореневог губки в основг стовбура 40-ргчно1 сосни звичайног; Б) електрофореграма ¡дентифгкацп ДНК
кореневог губки методом ПЛР: М - Маркери 100 bp DNA Ladder Plus (Fermentas); доргжки 1-3-40 нг, 4 пг i 4x10-3 пг ДНК H. annosum у зразку. Довжина ампл1фжовано-го продукту - 100 п.н.; В) свтлова мжроскотя мщелт з конiдieносцями кореневог губки, збыьшення 10x25x100
Для молекулярно! щентифжацп використовували праймери, запропоно-ваш Hantula J. та íh. [8], як е специф!чними до H. annosums. str. Внаслщок ПЛР отримано амптфжований продукт очкувано! довжини - 100 п.н. (рис. 1. Б, до-р1жка 1). Для щентифкацп ДНК фггопатогенного гриба у зразках деревини не-обхщна висока чутливють методу. Сершне розведення ДНК матриц! дозволило визначити пор1г чутливост! ПЛР за описаних вище умов. Шсля проведения ре-акцп амптфжацп визначено, що ця методика дае змогу визначати 4x10-3 пг ДНК коренево! губки у реакцшнш сумш! (рис. 1. Б, дор1жка 3). Така висока чутливють реакцп зумовлена тим, що послщовносп праймер1в е гомолопчними до послщовностей ISR (Intergenic Spacer Region) рибосомальних гешв, як тан-демно повторюються у геномах.
Штучне ураження оянцш мiцелieм гриба проведено для визначення коренево! губки в тканинах сосни. 1нф^вання сосни в природному середовищi кореневою губкою можливе вже з трьохрiчного вжу, проте мщелш фгтопато-генного гриба не може долати захисний бар'ер кори [5]. Трирiчнi сшнщ, виро-щеш у вщкритому Грунп, уражали мщетем у зрiз пщ корою i через 30 днiв ана-лiзували ураженi дiлянки рис. 2. А (фото 1, 2). Морфолопчно уражеш сiянцi вщ-рiзнялися вiд здорових наявнютю iнтенсивного смолопродукуваня та утворен-ням некротично! зони в мющ контакту мiцелiю з деревиною рис. 2. А (фото 3, 5), яка поширювалася вщ периферп до серцевини у виглад конуса, рис. 2. А (фото 4, 6). ДНК видшяли iз здорових трирiчних сiянцiв сосни та iз зони ураження шфжованих. За результатами ПЛР ДНК Н. аппозыш детектувалась у зразках деревини уражених аянщв (рис. 2. Б, дорiжка 2), продукти амптфжаци були вiдсутнiми у зразках деревини здорових сосен (рис. 2. Б, дорiжка 3).
Рис. 2. Штучне зараження пянщв сосни звичайноЧмщелкм кореневоИгубки (А) та електрофоретичний анализ визначення ДНК патогена в тканинах сосни методом ПЛР (Б). А: 1) вставка LB-агарозного блоку з мiцелieм кореневоi губки у 3pi3 nid кору; 2) iзоляцiя контактноi дтянки парафтом; 3) контрольний Ыянець сосни, токульований агаром без мщелш; 4) поперечний зрiз стовбура не ураженого Ыянцю у Mi^i токуляцп; 5) штучно уражений кореневою губкою Ыянець сосни;
6) поперечний зрiз шфжованог дыянки аянцю. Б: М) маркери 100 bp DNA Ladder Plus (Fermentas); 1) ДНК кореневог губки; дорiжка 2) Ыянець, уражений кореневою губкою; 3) здоровий аянець сосни звичайног
Розроблену методику використали для визначення ураження фгтопато-генним грибом 40^чних дерев в осередку поширення коренево! губки у сосновому насадженш. Об'екгами для дослщження слугували дерева Í3 симптомами ураження (похилений стовбур, рщка крона) i без видимих ознак захворювання. Оскшьки вщомо, що коренева губка уражае кореш i шдшмаеться стовбуром сосни до 1 -2 м, то для анатзу вдабрано керни деревини iз основи стовбура та 6Í4¿ кореш Вдабраш для аналiзу керни мютили деревину вщ кори до серцевини дерева. Як вщомо, мщелш гриба поширюеться по стовбуру нерiвномiрно, i тому деревину вщбирали з рiзних дшянок керну, подрiбнювали та iз загально! сум^ вщбирали зразки для видшення сумарно! ДНК.
За допомогою ПЛР виявлено ДНК H. annosum у деревиш стовбурiв сосен iз ознаками ураження (рис. 3, дорiжки 2, 3, 5), i вiзуально здорових (дорiжки
4, 6). ДНК патогена не детектувалась у зразках деревини 1з здорово! 40-р1чно! сосни поза осередком коренево! губки (дор1жки 7, 8).
Рис. 3. Електрофоретичний анажз продуктов амплгфЫацй сумарноТ ДНК, видтеног b деревини сосни, b геноспециф1чними до кореневоТ губки праймерами:
М) маркери 100 bp DNA Ladder Plus (Fermentas); дорiжка 1) ДНК кореневог губки (позитивний контроль); дорiжки 2-6) ДНК дерев i3 вогнища кореневог губки; дорiжки 7, 8) ДНК iз здорових дерев (негативний контроль)
Анал1з деревини б1чних корешв уражених сосен показав наявнють ДНК коренево! губки лише в одному дерев1 1з шести, в деревин стовбур1в яких щен-тифжовано патоген, що свщчить про те, що поширення мщелш у кореневш систем1 вщбуваетъся нер1вном1рно, i негативний результат потребуе додатково-го тдтвердження шляхом збшьшення кшькоста зразюв [9].
Препарати ДНК, видшеш 1з деревини сосен 1з осередку коренево! губки, мютили як ДНК сосни, так i ДНК гриба рис. 4. А. Сшввщношення м1ж кшьюс-тю ДНК рослини i патогена може слугувати показником ступеня ураження господаря. Для оцшки р1вня шф1кування дерев кореневою губкою нами використа-на натвкшьюсна ПЛР. В однш реакцшнш сумш1 використовували дв1 пари праймер1в. Одна пара (MJ-F i MJ-R) е геноспециф1чною до коренево! губки i внаслщок амптфжацп утворювався продукт довжиною 100 п.н. Друга пара (Def2-F i Def2-R) е специф1чною до гена PsDef2 сосни звичайно! i внаслщок ре-акцп ампл1ф1кувався продукт довжиною 148 п.н. Як свщчать результати, наведен! на рис. 4. А, в уах препаратах ДНК, яка була видшена 1з уражених сосен спостеркалось утворення двох ПЛР продуктав оч1кувано! довжини (дор1жки 1 -5). Амплжон довжиною 100 п.н. не визначався в препарата ДНК 1з здорового дерева (негативний контроль, дор1жка 6). Нормал1зац1я кшькоста ДНК патогена у зразку до кшькоста ДНК сосни проведено 1з використанням програми GelPro Analyzer 4.0. Високе вщносне значения кшькоста ДНК коренево! губки харак-терне для препаратав ДНК, видшених 1з дерев 1з симптомами ураження i ютотно нижчими були щ значения для в1зуально здорових сосен (рис. 4. Б, колонки 2, 4). Отже, вщносне значения кшькоста ДНК коренево! губки до кшькоста ДНК сосни корелювало 1з в1зуальними ознаками ураження дерева, що робить можли-вим використання цього показника для визначення р1вня шф1кування.
Такий шдхщ анал1зу важливий через те, що явш ознаки шф1кування ста-ють помггаими в останш 3-5 роюв життя дерева. Для впровадження саштарних рубок важливе значения мае саштарний стан дерев та р1вень !хнього ушкоджен-ня. Уражеш сосни з прихованим перебком захворювання потенцшно небезпеч-
Нацюнальний лiсотexнiчний yнiвepситeт Украши
н1 для сусщнж дерев, оск1льки i в1дмерл1 дерева, в цьому випадку важливо виз-начати меж1 осередку ураження у деревосташ за участ1 i такта особин.
Рис. 4. Визначення ступеня ураження сосни кореневою губкою методом натв-ктьтсноТПЛР. А: Електрофореграма продyкmiв амплiфiкацiï сyмарноï ДНК iз дво-ма парами праймерiв (MJ, MJ-R та Def2- F i Def2-R); l48 п.н. - продукт гена PsDef2; lOO п.н. - продукт гена рuбосомальноï РНК H. annosum. l-З) тфтоват дерева, б) негативний контроль. Б: Пстограма сniввiдношення ^brnrni ДНК кореневоï губки до ^bm^i ДНК сосни у зразках, вiдiбранuх iз сmовбyрiв сосен в осередку поширення кореневоï губки; l), S), З) дерева iз ознаками ураження;
2), 4) сосни без ознак ураження
Отже, ця методика дае змогу визначати кореневу губку в деревиш сосни на pаннix стадiяx розвитку патолопчного процесу, що сприятиме тдвищенню ефективносп лiсозаxисниx заxодiв щодо поширення цього небезпечного патогена. Bикоpистання цього методу в перспектив! дасть змогу оцшити саштарний стан люовж насаджень, об'ектившше визначати меж1 осередку ураження, а та-кож виявляти потенцшш вщмшносл у чутливосп окремж дерев чи груп дерев до H. annosum, що своею чергою може використовуватись у селекцiйниx прог-pамаx пошуку генетично стiйкиx особин.
Лiтepaтypa
1. Булат А.Г. Особливосп ураження кореневою губкою сосновиx насаджень Харк1вщи-ни та заxоди щодо профилактики xвоpоби i автореф. дис. на здобуття наук. ступеня канд. с.-г. наук! спец. 0б.0З.0З "Л1сознавство i лгавництво" / А.Г. Булат. - Харк1в, 200б. - 21 с.
2. Гут P.T. Пор1вняльний анализ piзниx методов вид1лення ДНК з xвоï сосни звичайно!' (Pinus sylvestris L.) / P.T. Гут, Ю£. Bеpбовицька // Науковий в1сник НЛTУ Украши i зб. наук.-теxн. праць. - Льв1в i PBB KÏÏTy Украши. - 200S. - Bип. 1S.S. - С. 11б-121.
3. Павлов И.Н. К вопросу образования очагов куртинного уськана сосны обыкновенной на стаpопаxотныx земляx (роль корневой губки, эдафическиx факторов и изменения климата) / И.Н. Павлов, О.А. Барабанова, С.С. Кулаков // Хвойные бореальной зоны. - 2010. -Bип. XXVII, № З-4. - С. 2бЗ-272.
4. Tопчiй Н. Сучасш методи видшення ДНК вищиx рослин / Н. ^пчш // Biсник Льв1в-ського университету. - Сеp.: Б1олог1чна. - Льв1в i Bид. центр ЛНУ 1м. 1вана Франка. - 200б. -Bип. 42. - С. 2б-З1.
5. Шевченко С.B. Лесная фитопатология / С.B. Шевченко. - Львов i Bto-во "Bища шк.", 1978. - З20 с.
6. Юсипович Ю.М. Диференц1йна експрес1я дефензину PsDef2 в оpганаx сосни зви-чайноï на piзниx етапаx онтогенезу / Ю.М. Юсипович, BA. Ковальова, P.T. Гут // Биология растений и биотеxнология i I конф. мол. учен. (с междунар. участием); S-7 октября 2011 p.i прогр. и материалы. - Белая Церковь, 2011. - С. 49.
7. Asiegbu F.O. Conifer root and butt rot caused by Heterobasidion annosum (Fr.) Bref. s.l. / F.O. Asiegbu, A. Adomas, J. Stenlid // Molecular plant pathology. - 200S. - Vol. б, № 4. - P З95-409.
8. Hantula J. Specific Primers for the Differentiation of Heterobasidion annosum (s.str.) andH. parviporum Infected Stumps in Northern Europe / J. Hantula, E. Vainio // Silva Fennica. - 200З. -Vol. З7, № 2. - P. 181-187.
9. Skipars V. Genetic aspects of resistance of Scots pine (Pinus sylvestris L.) against root rot caused by Heterobasidion annosum (Fr.) Bref: summary of the doctoral thesis for the scientific degree Dr. silv. in Forest Ecology and Silviculture / V. Skipars. - Jelgava, 2011. - 80 p.
Юсипович Ю.М., Ковалева В А., Гут Р.Т. Диагностика корневой губки (Heterobasidion annosum s. str.) путем полимеразно-цепной реакции
Представлена методика определения ДНК корневой губки (Heterobasidion annosum s.str.) в тканях сосны обыкновенной путем полимеразно-цепной реакции (ПЦР) с использованием специфических праймеров. Методика апробирована на трехлетних сеянцах сосны обыкновенной, искуственно инфицированных мицелием корневой губки. Проведена диагностика санитарного состояния 40-летних деревьев в очаге распространения фитопатогена в сосновых насаждениях
Ключевые слова: корневая губка, сосна обыкновенная, полимеразно-цепная реакция.
Yusypovych Yu.M., Kovalyova VA., Gout R.T. Identification of Heterobasidion annosum s. str. by polymerase-chain reaction
The technique of identification of root rot fungus (Heterobasidion annosum s.str.) DNA in Scots pine tissue by polymerase-chain reaction (PCR) approach with specific primers are presented. The method has been tested on tree-year old Scots pine seedlings artificially infected with the root rot mycelium. Diagnostics of the health of 40-year old tree in focus of spread of root rot disease in Scots pine plantations was carried out
Keywords: root rot fungus, Scots pine, polymerase-chain reaction.
