CC BY
45
БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ
УДК 615. 281 [6:539] - 022.532
действие селеноорганических соединении
на грамотрицательные микроорганизмы
© 2010 г. И.В. Бабушкина1, А.Н. Мольченкова2, С.П. Власова2, Е.П. Меркулова 2, И.А. Горошинская3
В.А. Мартьянова 2, В.Б. Бородулин2
1Саратовский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии, ул. Чернышевского, 148, г. Саратов, 410002, [email protected]
2Саратовский государственный медицинский университет, ул. Б. Казачья, 112, г. Саратов, 410012, meduniv@sgmu. т
3Ростовский научно-исследовательский онкологический институт, 14 линия, 63, г. Ростов н/Д, 344037, [email protected]
Saratov Research Institute of Traumatology and Orthopedics, Chernishevskiy St., 148, Saratov, 410002, sarniito-lab@yandex. ru
2 Saratov State Medical University, B.Kazachia St., 112, Saratov, 410012, [email protected]
3 Rostov Research Oncological Institute, 14 liniya, 63, Rostov-on-Don, 344037, [email protected]
Изучено антибактериальное действие 5 селеноорганических соединений на 30 полиантибиотикорезистентных штаммах грамотри-цательных бактерий, выделенных от больных с гнойными осложнениями. Выявлено, что 2-бензоил-3,5-дифенил-селенофен во всех изучаемых концентрациях не оказывает антибактериального действия на клетки E.coli, в концентрации 10 мг/мл статистически достоверный антибактериальный эффект выявляется на клетках K. oxytoca и Ps. aeruginosa. При воздействии 1,5-ди-(щ-хлор-фенил)-3-селенапентандиона-1,5, 2,6-дифенил-4-(п-метоксифенил)-4Н-селенопирана и 2,4,6-трифенилселенациклогексана на клетки E. сoli отмечается выраженный антибактериальный эффект в зависимости от концентрации.
Ключевые слова: грамотрицательные бактерии, селен, антибактериальное действие.
The research concerns the antibacterial action of 5 selen-organic compounds on 30 polyantibioticoresistant strains of gram-negative bacteria, exuded from patients with purulent complications of the traumatological and orthopedic hospital. It is revealed, that 2-benzoyl-3,5-diphenyl-selenofen in all the concentrations under study does not have antibacterial effect on E.coli cells, in the concentration of 10 mg/ml statistically significant antibacterial effect emerges in K. oxytoca and Ps. аeruginosa cells. Under the influence of 1,5-di-(n-chlorine-phenyl)-selenium pentandion-1,5; 2,6-diphenyl-4-(n-methoxiphenyl)-4H-selenopyran and 2,4,6-triphenyl selenium cyclohexan on E.coli cells evident antibacterial effect appears to be according to the concentration.
Keywords: gram-negative bacteria, selenium, antibacterial action.
Лекарственная устойчивость микроорганизмов -широко распространенное явление, препятствующее лечению инфекционных болезней. Ее преодоление достигается различными путями: введением так называемых ударных доз антимикробных препаратов, способных подавлять рост относительно устойчивых к ним микроорганизмов, сменой антибиотиков, применяемых в клинике, а также комбинированной химиотерапии. Ведется также поиск новых природных антимикробных веществ, эффективных против бактерий, устойчивых к уже применяемым препаратам. Интересными с этой точки зрения являются селеноор-ганические соединения, которые могут так же быть источниками селена для макроорганизма [1].
И у животных организмов, и у человека селен -составляющая белков, в частности, глутатионперок-сидазы эритроцитов и тромбоцитов, и он участвует в антиоксидантной защите клеток [2], тормозя развитие ряда патологических состояний в организме [3].
Дефицит селена приводит к снижению устойчивости к бактериям и вирусам, ослабляет функциональ-
ную активность нейтрофилов, продукцию антител, деятельность Т-киллеров и естественных киллеров [4], в 2-3 раза усиливает токсичность нитрофуран-тоина, параквата, диквата, фуразолидона, хлорированных дибензодиоксинов, нитрата натрия [5].
Материалы и методы исследований
Для бактериологического исследования взято 5 селеноорганических веществ: 2-бензоил-3,5-дифенил-селенофен (препарат 1), 1,5-ди-(2,4-диоксифенил)-3-селенапентандион (препарат 2), 1,5-ди-(п-хлорфенил)-3-селенапентандион-1,5 (препарат 3), 2,6-дифенил-4-(п-метоксифенил)-4Н-селенопиран (препарат 4) и 2,4,6-трифенилселенациклогексан (препарат 5).
Эти препараты были синтезированы в СВИ БХБ под руководством Б.И. Древко.
Исследования проводили на штаммах Pseudomonas aeruginosa (10), Escherichia coli (10), Klebsiella oxytoca (10), выделенных от больных с гнойными осложнениями, находящихся на лечении в травматолого-ортопеди-
Таблица 1
Влияние препаратов 1, 2 и 3 на рост E. Coli
Концентрация, мг/мл Количество вы росших колоний, M±m, n=10
Препарат 1 Препарат 2 Препарат 3
10 616±31 832±78 Нет роста*
1 528±146 1184±145 32±78*
0,1 576±56 984±96 172±87*
0,01 592±83 808±309 138±42*
0,001 680±91 756±98 335±61*
Контроль 798±71
ческом стационаре Саратовского научно-исследовательского института травматологии и ортопедии и обладающих резистентностью к 5 и более профильным антибиотикам. С помощью оптического стандарта мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича (10 единиц) и метода последовательных разведений готовили суспензию, содержащую 5-105 микробных тел в 10 мл физиологического раствора. Ее считали исходной.
Навески соединений селена 1, 2, 3 для приготовления рабочих растворов отвешивали на аналитических весах, затем растворяли в определённом количестве стерильного 0,9%-го раствора хлорида натрия.
В пробирки с разведениями препаратов 1, 2, 3 в физиологическом растворе в различных концентрациях (0,001; 0,01; 0,1; 1; 10 мг/мл) добавляли по 100 мкл конечной суспензии (5000 КОЕ/мл) микроорганизмов. В качестве контроля использовали бактериальную взвесь, разведённую в аналогичных пропорциях с физиологическим раствором и инкубированную в течение того же времени.
1 мг соединений 4 и 5 растворяли в 100 мкл ДМФА (диметилформамида), добавляли 900 мкл 0,9%-го NaCl - проба 1 (1 мг/мл). В качестве контроля использовали 1 мл ДМФА + 9 мл 0,9%-го NaCl. Затем из пробы 1 отбирали 100 мкл, добавляли 900 мкл 0,9%-го NaCl, получая пробу 2 (0,1 мг/мл). Из нее отбирали 100 мкл содержимого, добавляли 900 мкл 0,9%-го NaCl, получая пробу 3 (0,01 мг/мл). Из нее отбирали 100 мкл раствора, добавляли 900 мкл 0,9%-го NaCl, получая пробу 4 (0,001 мг/мл).
В пробирки с разведениями препаратов добавляли по 100 мкл конечной суспензии (3 105 КОЕ/мл) микроорганизмов, встряхивали и инкубировали в течение 30, 60, 90, 120, 180 мин при комнатной температуре.
В качестве контроля использовали такие же количества бактериальной взвеси, разведённые в аналогичных пропорциях с контролем (ДМФА с 0,9%-м NaCl) и также выдержанные в течение тех же промежутков времени. После этого бактериальные взвеси из каждой пробирки в количестве 100 мкл высевали на чашки Петри с твёрдой питательной средой (мясо-пептонный агар), которые затем помещали в термостат на 24 ч при 37 °С. Подсчёт колоний производили на следующий день. Проводили постановку биохимических тестов для определения изменений ферментативных свойств исследуемых культур в опытной и контрольной культурах. При этом использовали специальную дифференциально-диагностическую систему для идентификации энтеробактерий ENTERO test 16 (MIKRO-LA-TEST), NEFERMtest 24.
Производили статистическую обработку материала с подсчетом средних значений (М), их среднеквадратичных ошибок (m).
Результаты исследований
Данные табл. 1 свидетельствуют, что при воздействии препаратами 1 и 2 в различных концентрациях (0,001-10 мг/мл) не отмечалось достоверных отличий между контрольными и опытными образцами, что свидетельствует об отсутствии антибактериального и ростстимулирующего эффектов данных препаратов на клетки E. rnli (табл. 1).
* - р<0,01.
Препарат 3 в концентрации 0,001 мг/мл снижает количество микробных колоний, выросших на мясо-пептонном агаре, на 58 %, в концентрации 0,01 мг/мл антибактериальный эффект возрастает до 82 % (р<0,01). Ее увеличение от 0,1 до 1,0 мг/мл не приводит к значительному усилению антибактериального эффекта. Концентрация 10 мг/мл вызывает 100%-ю гибель бактериальных клеток.
Из табл. 2 видно, что при воздействии препаратов 1 и 2 в различных концентрациях (0,001-10 мг/мл) достоверные отличия между контрольными и опытными образцами наблюдались только при использовании концентрации 10 мг/мл; при концентрации от 1 до 0,001 мг/мл статистически достоверного снижения количества колоний под влиянием действия данных препаратов на клетки ^ оxytoca не было.
Препарат 3 в концентрации 0,001 мг/мл снижает количество микробных колоний, выросших на мясо-пептонном агаре, на 64; в концентрации 0,01 мг/мл антибактериальный эффект возрастает до 85 %. Увеличение концентрации от 0,1 до 10 мг/мл ведет к усилению антибактериального эффекта до 97 %. Таким образом, чем выше доза препарата, тем интенсивнее снижение численности K. oxytoca .
Данные табл. 3 свидетельствуют, что при воздействии препаратов 1 и 2 в различных концентрациях (0,001-10 мг/мл) достоверные отличия между контрольными и опытными образцами наблюдались только при использовании концентрации 10 мг/мл, при ее снижении от 1 до 0,001 мг/мл статистически достоверного снижения количества колоний данных препаратов на клетки Ps. aeruginosa не было.
Таблица 2
Влияние препаратов 1, 2 и 3 на размножение K. oxytoca
Концентрация, мг/мл Количество выросших колоний, M±m, n=10
Препарат 1 Препарат 2 Препарат 3
10 149±78 262±89 19±11*
1 261±93 280±62 15±26*
0,1 276±141 385±156 37±21*
0,01 482±69 302±47 62±84*
0,001 497±56 567±187 153±37*
Контроль 423±121
* - р<0,01.
Таблица 3
Препарат 1 и 2 на размножение Ps. aeruginosa
Концентрация, мг/мл Количество выросших колоний, M±m, n=10
Препарат 1 Препарат 2
10 289±191* 119±61*
1 347±117 450±163
0,1 358±286 574±98
0,01 532±116 449±86
0,001 628±89 596±156
Контроль 514±156
* - р<0,01.
При воздействии препаратов 4 и 5 в различных концентрациях (0,001-10 мг/мл) отмечается выраженное статистически достоверное уменьшение количества колоний на твердых питательных средах. Препарат 4 в концентрации 0,001 мг/мл снижает количество микробных колоний, выросших на мясо-пептонном агаре, на 73 %, в концентрации 0,01 мг/мл антибактериальный эффект возрастает до 92 %. Увеличение концентрации до 1 мг/мл и выше приводит к 100%-му антибактериальному эффекту. Препарат 5 в концентрации 0,001 мг/мл снижает количество колоний на 93 %; 0,01 мг/мл - 96; 0,1 мг/мл - на 97; использование концентрации 10 мг/мл приводит к полному подавлению роста микроорганизмов. Выявлена зависимость подавления бактерий от дозы внесённого препарата: чем выше доза, тем интенсивнее наблюдалось снижение численности E. coli (табл. 4).
Таблица 4
Влияние препаратов 4 и 5 на размножение E. coli
Большой интерес представляло изучение физиоло-го-биохимических свойств микроорганизмов после воздействия селеноорганических соединений. У E. coli после воздействия на неё препарата 2 изменяются сахаролитические свойства (появляется способность
использовать мальтозу), протеолитические (E. coli теряет способность расщеплять лизин, орнитин, эску-лин до конечных продуктов), пептолитические (данный штамм E. coli перестаёт образовывать продукты азотного обмена - индол); приобретается способность использовать цитрат и теряется способность к гидролизу мочевины.
Р^ аеruginosa после воздействия препаратов 1 и 2 изменила сахаролитические свойства (перестала использовать мальтозу, гидролизовать ß-галактозидазу), потеряла способность расщеплять аминокислоты (ор-нитин, эскулин) и начала использовать цитрат. После воздействия препаратом 1 Р^ аеruginosa перестает гидролизовать мочевину; вариабельно использует маннитол и сорбит, препаратом 2 - перестает расщеплять аминокислоту лизин; начинает использовать такие углеводы, как инозит, аденозит, целлюлоза, и перестает использовать сорбит и маннитол.
К. oxytocü после воздействия препарата 2 изменила сахаролитические свойства (перестала использовать мальтозу, инозит, аденозит), протеолитические (потеряла способность расщеплять орнитин, эскулин), гид-ролизует ß-галактозидазу, цитрат и мочевину.
Выводы
Исследования показали, что селен как микроэлемент оказывает сильное воздействие на процессы жизнедеятельности грамотрицательных микроорганизмов рода Escherichia, Klebsiella и Pseudomonas.
Полученные результаты позволяют рекомендовать анализируемые соединения селена в качестве антисептиков для использования в медицинской практике при госпитальных инфекциях или в качестве антибактериальных средств при лечении гнойных осложнений.
Литература
1. Горбачев A^., Скальный A£., Ефимова A£. Физиоло-
гическая роль селена и вариации его содержания в организме жителей северо-востока России // Микроэлементы в медицине. 2001. Т. 2, вып. 4. С. 31-36.
2. Aвцын A.n. Недостаточность эссенциальных микроэле-
ментов и ее проявление в патологии // Архив патологии. 1990. № 3. С. 3-8.
3. Скальный A.В. Химические элементы в физиологии и экологии человека. М., 2004. 216 с.
4. Clark L.C., Cantor K.P., Allaway W.H. Selenium in forage crops and cancer mortality in US counties // Arch. Environ. Health. 1991. Vol. 46. P. 37-42.
5. Решетник ЛЛ., Парфенова Е.О. Биогеохимическое и
клиническое значение селена для здоровья // Микроэлементы в медицине. 2001. Т. 2, вып. 2. С. 84-96.
Концентрация препаратов, мг/мл Количество выросших колоний, M±m, n=10
Препарат 4 Препарат 5
10 Нет роста Нет роста
1 Нет роста 6±12*
0,1 49±78* 18±34*
0,01 44±31* 19±7*
0,001 123±87* 38±81*
Контроль 456±154
* - р<0,01.
Поступила в редакцию_3 марта 2009 г
