CC BY
60
УДК [616-002-022.7:57.063.8-085.281:546.23:547.222].001.6(045)
АНТИБАКТЕРИАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ СЕЛЕНООРГАНИЧЕСКОГО СОЕДИНЕНИЯ ДИАЦЕТОФЕНОНИЛСЕЛЕНИД И ЕГО ХЛОРПРОИЗВОДНОГО НА КЛИНИЧЕСКИЕ ШТАММЫ СИНЕГНОЙНОЙ ПАЛОЧКИ
© 2012 г. Н.Ю. Русецкая, И.А. Горошинская, В.Б. Бородулин, Д.П. Димидов, Я.В. Бородулин
Русецкая Наталья Юрьевна - кандидат биологических наук, ассистент, кафедра биологической химии, Саратовский государственный медицинский университет, ул. Б. Казачья, 112, г. Саратов, 410012, e-mail: [email protected].
Горошинская Ирина Александровна - доктор биологических наук, профессор, руководитель биохимической лаборатории, Ростовский научно-исследовательский онкологический институт, ул. 14 линия, 63, г. Ростов н/Д, 344037, e-mail: [email protected].
Rusetskaya Natalia Yurievna - Candidate of Biological Science, Assistant, Biochemistry Department, Saratov State Medical University, B.Kazachia St., 112, Saratov, 410012, e-mail: [email protected].
Goroshinskaya Irina Aleksandrovna - Doctor of Biological Science, Professor, Head of Biochemical Laboratory, Rostov Research Oncological Institute, 14-line, 63, Rostov-on-Don, 344037, e-mail: [email protected].
Бородулин Владимир Борисович - доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой биохимии, Саратовский государственный медицинский университет, ул. Б. Казачья, 112, г. Саратов, 410012, e-mail: [email protected].
Димидов Дмитрий Павлович - аспирант, кафедра биохимии, Саратовский государственный медицинский университет, ул. Б. Казачья, 112, г. Саратов, 410012, e-mail: [email protected].
Бородулин Ярослав Владимирович - студент, лечебный факультет, кафедра биохимии, Саратовский государственный медицинский университет, ул. Б. Казачья, 112, г. Саратов, 410012, e-mail: [email protected].
Borodulin Vladimir Borisovich - Doctor of Biological Science, Professor, Head of Biochemistry Department, Saratov State Medical University, B. Kazachia St., 112, Saratov, 410012, e-mail: [email protected].
Dimidov Dmitriy Pavlovich - Post-Graduate Student, Department of Biochemistry, Saratov State Medical University, B. Kazachia St., 112, Saratov, 410012, e-mail: [email protected].
Borodulin Yaroslav Vladimirovich - Student, Medical Faculty, Saratov State Medical University, B. Kazachia St., 112, Saratov, 410012, e-mail: [email protected].
Изучена антибактериальная активность двух селеноорганических соединений (1,5-дифенил-3-селенапентандион-1,5 и 1,5-ди-(п-хлорофенил)-3-селенапентандион-1,5) на клинические штаммы синегнойной палочки. Соединения обладают значительным антибактериальным действием в отношении синегнойной палочки при инкубации от 60 до 150мин в концентрациях от 1 до 0,001 мг/мл.
Ключевые слова: антибактериальная активность, селен, синегнойная палочка, клинический штамм.
Antibacterial activity of two selenorganic compounds (1,5-difenil-3-selenapentandion-1,5 and 1,5-di-(p-chlorophenil)-3-selenapentandion-1,5) on the clinical strains of Pseudomonas aeruginosa is studied. Compounds possessed considerable antibacterial action on Pseudomonas aeruginosa from 60 to 150 minutes incubation in concentration from 1 to 0,001 mg/ml.
Keywords: antibacterial activity, selenium, Pseudomonas aeruginosa, clinical strain.
Повсеместно увеличивается число инфекций, вызванных патогенными резистентными бактериями. Низкая активность лекарственных препаратов (или полное ее отсутствие) к грамотрицательным бактериям обусловлена развитием лекарственной устойчивости к синтетическим антибиотикам или препаратам, полученным из лекарственных растений. В связи с этим синтез и изучение биологической активности новых антимикробных агентов, к которым бы не развивалась лекарственная устойчивость, являются чрезвычайно актуальными вопросами современной медицины и биологии.
На протяжении последнего 10-летия обнаружена антибактериальная активность нескольких классов се-ленорганических соединений (4Н-селенопиранов и солей селенопирилия, селеноксантенов, селеноцикло-гексанов, бензоселенохроменов, бензисоселеназолов, селенадиазолов и др.) против широкого спектра грам-положительных и грамотрицательных бактерий, а также различных грибов и вирусов [1-5]. Активность некоторых селеноорганических соединений намного выше, чем у стандартных химиотерапевтических препаратов, таких как ципрофлоксацин и флюконазол [6].
В отечественном животноводстве, птицеводстве и ветеринарии применяется селеноорганический препарат диацетофенонилселенид (ДАФС-25), который действует как иммунностимулятор, антиоксидант и антитоксикант, приводит к увеличению яичной и мясной продукции [7].
Ранее описано антибактериальное действие хлор-содержащего производного соединения ДАФС - 1,5-ди-(п-хлорфенил)-3-селенапентандион-1,5 - в концентрациях 0,001^10 мг/мл на клинические штаммы Escherichia coli и Klebsiella oxitoca, которое выражалось в снижении количества микробных колоний, выросших на мясо-пептонном агаре, после инкубации с данным препаратом [8].
Цель нашей работы - изучение антибактериальной активности селеноорганического соединения ди-
ацетофенонилселенид и его хлорпроизводного на клинические штаммы Pseudomonas aeruginosa.
Материалы и методы
В эксперименте использовали препараты: 1,5-ди-фенил-3 -селенапентандион-1, 5 - ДАФС-25 (соединение
1) и 1,5-ди-(п-хлорфенил)-3-селенапентандион-1,5 -хлорпроизводное соединение ДАФС-25 (соединение
2) в различных концентрациях (рисунок).
Соединение 1
Соединение 2
Структурные формулы исследуемых препаратов: соединение 1 - 1,5-дифенил-3-селенапентандион-1,5; соединение 2 - 1,5-ди-(п-хлорофенил)-3-селенапентандион-1,5
Препараты синтезированы под руководством профессора, д.х.н. Б.И. Древко.
Эксперимент проводили на 10 таксономически идентичных клинических штаммах Pseudomonas aeruginosa, выделенных от больных с гнойными осложнениями, находящихся на лечении в травмато-лого-ортопедическом стационаре Саратовского научно-исследовательского института травматологии и ортопедии (СарНИИТО) и обладающих резистентностью к пяти и более профильным антибиотикам.
Суспензию бактерий готовили по стандарту мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича путем последовательных разведений до конечной концентрации бактерий - 3 105 клеток в 1 мл.
Для этого 1 мг соединения растворяли в 100 мкл ДМФА (диметилформамида), добавляли 900 мкл 0,9%-го NaCl - проба 1 (1 мг/мл). В качестве контроля использовали 1 мл ДМФА +9 мл 0,9%-го NaCl. Затем из пробы 1 отбирали 100 мкл, добавляли 900 мкл из контрольной пробирки, получая пробу 2 (0,1 мг/мл). Из пробы 2 отбирали 100 мкл содержимого, добавля-
ли 900 мкл из контроля, получая пробу 3 (0,01 мг/мл). Из пробы 3 отбирали 100 мкл раствора, добавляли 900 мкл из контроля, получая пробу 4 (0,001 мг/мл). В пробирки с разведениями препарата добавляли по 100 мкл конечной суспензии (3 105 КОЕ/мл) микроорганизмов, встряхивали и инкубировали в течение 30, 60, 90, 120, 150 мин при комнатной температуре.
В качестве контроля использовали такие же количества бактериальной взвеси, разведенные в аналогичных пропорциях с контролем (ДМФА с 0,9%-м NaCl) и также выдержанные в течение тех же промежутков времени. После этого бактериальные взвеси из каждой пробирки в количестве 100 мкл высевали на чашки Петри с твердой питательной средой (мясо-пептонный агар), которые затем помещали в термостат на 24 ч при 37°С. Подсчет колоний производили на следующий день.
Статистическую обработку полученных данных осуществляли при помощи пакета программ Statistica 6.0. Проверяли гипотезы о виде распределений (критерий Шапиро-Уилкса). Большинство данных не соответствуют закону нормального распределения, поэтому для сравнения значений использовался U-критерий Манна-Уитни, на основании которого рассчитывался Z-критерий Фишера и показатель достоверности p. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез в данном исследовании принимали равным 0,05.
Результаты и их обсуждение
Установлено, что характер влияния соединения на рост клинических штаммов и выраженность антибактериального эффекта зависят от концентрации препарата и времени воздействия на бактериальную взвесь (табл. 1, 2).
Соединение 1 оказывало антимикробное действие на клинические штаммы Pseudomonas aeruginosa (Ps. aeruginosa), что выражалось в уменьшении числа колоний после инкубации с данным препаратом по сравнению с контролем (табл. 1). Это соединение до-
Антибактериальное действие соединения 1 на
стоверно уменьшало число колоний синегнойной палочки на 27,03 % (р<0,05) при низкой концентрации 0,001 мг/мл и минимальной инкубации 30 мин. При увеличении времени инкубации 90^150 мин наблюдалось снижение роста бактерий на 31,33 и 12,39 % (р<0,05). Соединение 1 в концентрации 0,01 мг/мл эффективно подавляло рост колоний на 26,73 % при инкубации 30 мин и на 21,25 % при инкубации 150 мин (р<0,05). Данная концентрация соединения 1 была неэффективна при инкубации 60, 90 и 120 мин.
Антибактериальная активность соединения 1 в концентрации 0,1 мг/мл была достоверна при инкубации 90, 120, 150 мин, что выражалось в уменьшении числа клеток на 10,48, 27,96 и 45,91 % соответственно по сравнению с контролем (р<0,05).
Таким образом, антибактериальная активность соединения 1 на клетки штамма Ps. aeruginosa возрастала с увеличением концентрации препарата и времени инкубации. При этом максимальная антимикробная активность этого соединения наблюдалась в концентрации 1 мг/мл при инкубации 150 мин (табл. 1).
Соединение 2 также проявляло антимикробную активность в отношении клинических штаммов сине-гнойной палочки в широком диапазоне концентраций и времени инкубации, достоверную (р<0,05) - в концентрации 0,001 мг/мл, подавляя рост бактерий на 30,11 (60 мин), 66,26 (90 мин), 61,22 (120 мин), 71,35 % (150 мин) по сравнению с контролем (табл. 2).
Более выраженную антибактериальную активность соединение 2 проявляло в концентрации 0,01 мг/мл. Число колоний синегнойной палочки достоверно снижалось по сравнению с контролем при инкубации 30, 60, 90, 120 и 150 мин на 17,57 %, 24,78, 83,97, 79,11, 97,93 % (р<0,05).
В концентрации 0,1 мг/мл соединение 2 эффективно уменьшало число колоний Ps. aeruginosa при инкубации от 30 до 150 минут на 22,47 %, 41,11, 75,16, 92,89, 97,81 % (р<0,05) по сравнению с контролем.
Таблица 1
клинические штаммы Pseudomonas aeruginosa
Время воздействия, мин Количество колоний на твердых питательных средах
Контроль (ДМФА и физ. раствор) Опытные группы, концентрация вещества, мг/мл
1 0,1 0,01 0,001
30 1332 (986;1456) 985(867;1189)* гк=2,04; рк=0,041252 1021(937;1176) гк=1,62; рк=0,104111 976(896;1071) гк=2,19; рк=0,028366 972(956;1004) гк=2,07; рк=0,037636
60 1156 (896;1256) 1059(765;1167) 7к=0,9800; рк=0,325752 971(877;1267) гк=0,45; рк=0,650148 966(876;1067) гк=1,05; рк=0,289919 983(869;1178) гк=0,86; рк=0,384674
90 983 (876;1123) 676(634;890) гк=3,09; рк=0,001940 880(789;898) гк=2,19; рк=0,028366 828(781;967) гк=1,81; рк=0,069643 675(563;970) гк=2,38; рк=0,017258
120 912 (754;1056) 389(167;496) гк=3,78; рк=0,000157 657(542;954) гк=2,11; рк=0,034294 882(784;1063) гк=0,60; рк=0,545350 915(819;971) гк=0,68; рк=0,496292
150 880 (854;984) 158(67;215) гк=3,78; рк=0,000157 476(342;782) гк=2,94; рк=0,003197 693(674;841) гк=2,49; рк=0,012612 771(587;856) гк=2,31; рк=0,021135
* - в каждом случае приведены средняя величина (медиана - Ме), нижний и верхний квартили (25;75 %). 2к, рк - различия по сравнению с группой контроля.
Таблица 2
Антибактериальное действие соединения 2 на клинические штаммы Pseudomonas aeruginosa
Время воздействия, мин Количество колоний на твердых питательных средах
Контроль (ДМФА и физ. р-р) Опытные группы, концентрация вещества, мг/мл
1 0,1 0,01 0,001
30 939 (890;1104) 563(464;817)* ZK=3,09; рк=0,001940 728(560;876) ZK=2,26; рк=0,023343 774(451;896) ZK=2,64; рк=0,008127 750(671;1168) ZK=1,32; рк=0,185878
60 900 (870;984) 350(312;417) ZK=3,40; рк=0,000670 530(447;786) ZK=3,36; рк=0,000769 677(432;816) ZK=2,79; рк=0,005159 629(439;956) ZK=2,11; рк=0,034294
90 1067 (874;1151) 118(89;381) ZK=3,77; рк=0,000157 265(106;380) ZK=3,40; рк=0,000670 171(45;371) ZK=3,77; рк=0,000157 360(289;544) ZK=3,55; рк=0,000381
120 900 (789;914) 15(0;67) ZK=3,77; рк=0,000157 64(9;320) ZK=3,77; рк=0,000157 188(3;345) ZK=3,55; рк=0,000381 349(156;562) ZK=3,02; рк=0,002497
150 869 (781;934) 0(0;0) ZK=3,77; рк=0,000157 19(0;121) ZK=3,77; рк=0,000157 18(4;271) ZK=3,77; рк=0,000157 249(61;549) ZK=3,47; рк=0,000507
* - в каждом случае приведены средняя величина (медиана - Ме), нижний и верхний квартили (25 %;75). 2к, рк - различия по сравнению с группой контроля.
Наибольшую антимикробную активность соединение 2 проявляло в максимальной концентрации 1 мг/мл. В зависимости от времени инкубации рост бактерий снижался на 40,04 % (30 мин) (р<0,05), 61,11 (60 мин), 88,94 (90 мин), 98,33 (120 мин), а при инкубации 150 мин препарат 2 полностью подавлял рост бактериальных клеток синегнойной палочки (р<0,001) (табл. 2).
Следовательно, соединение 2 обладает значительным антибактериальным действием в отношении сине-гнойной палочки при инкубации от 60 до 150 мин в концентрациях Н0,001 мг/мл. Следует отметить увеличение антибактериального действия соединения 2 с увеличением времени инкубации и концентрации препарата.
Полученные данные демонстрируют более выраженную антибактериальную активность соединения 2 по сравнению с соединением 1. Вероятно, сравнительно большая антибактериальная активность соединения 2 объясняется наличием в его структуре 2 атомов хлора (см. рисунок), которые проявляют окислительные свойства. Кроме того, исследованные нами соединения являются низкомолекулярными гидрофобными веществами, которые, вероятно, могут легко проникать через ли-пополисахаридный слой внешней мембраны грамотри-цательных бактерий Pseudomonas aeruginosa.
Полученные данные позволяют предполагать перспективность использования соединения 2 как антибактериального средства в отношении антибиотико-резистентных штаммов синегнойной палочки.
Литература
1. Nozawa R., Yokota T., Fujimoto T. Susceptibility of methi-cillin-resistant Staphylococcus aureus to the selenium-contai-
ning compound 2-phenyl-1,2-benzoisoselenazol-3(2H)-one (PZ51) // Antimicrob. Agents Chemother. 1989. Vol. 33, № 8. P. 1388 - 1390.
2. Bien M., Blaszczyk B., Kalinowska K., Mlochowski J., Inglot A.D. Antifungal activity of 2-(4-chlorophenyl)-1,2-benzisoselenazol-3(2H)-one, the analog of Ebselen // Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz). 1999. Vol. 47, № 3. P. 185 - 193.
3. Wojtowicz H., Kloc K., Maliszewska I., Mlochowski J., Pietka M., Piasecki E. Azaanalogues of ebselen as antimicrobial and antiviral agents: synthesis and properties // Farmaco. 2004. Vol. 59, № 11. P. 863 - 868.
4. Chan G., HardejD., SantoroM., Lau-Cam C., BillackB. Evaluation of the antimicrobial activity of ebselen: role of the yeast plasma membrane H+-ATPase // J. Biochem. Mol. Toxicol. 2007. Vol. 21, № 5. P. 252 - 264.
5. Pietka-Ottlik M., Wojtowicz-Mlochowska H., Kolodziejczyk K., Piasecki E., Mlochowski J. New orga-noselenium compounds active against pathogenic bacteria, fungi and viruses // Chem. Pharm. Bull. (Tokyo). 2008. Vol. 56, № 10. P. 1423 - 1427.
6. Gopalakrishnan M., Sureshkumar P., Thanusu J., Kana-garajan V. Design, synthesis, characterization, antibacterial and antifungal activities of a novel class of 5,7-diaryl-4,4-dimethyl-4,5,6,7-tetrahydropyridino[3,4-d]-1,2,3-selenadiazoles // J. Enzyme Inhib. Med. Chem. 2008. Vol. 23, № 3. P. 347 - 351.
7. Пат. № 2051681 РФ. Средство для лечения и профилактики болезней, вызываемых недостаточностью селена в организме сельскохозяйственных животных и птиц / Бюл. изобрет. 1996. № 1.
8. Бабушкина И.В., Мольченкова А.Н., Власова С.П., Меркулова Е.П., Горошинская И.А., Мартьянова В.А., Боро-дулин В.Б. Действие селеноорганических соединений на грамотрицательные микроорганизмы // Изв. вузов. Сев.-Кавк. регион. Естеств. науки. 2010. № 3. С. 75 - 77.
Поступила в редакцию_16 февраля 2012 г.
