CC BY
12
Научни трудове на Съюза на учените в България-Пловдив. Серия В. Техника и технологии, естествен ии хуманитарни науки, том XVI., Съюз на учените сесия "Международна конференция на младите учени" 13-15 юни 2013. Scientific research of the Union of Scientists in Bulgaria-Plovdiv, series C. Natural Sciences and Humanities, Vol. XVI, ISSN 1311-9192, Union of Scientists, International Conference of Young Scientists, 13 - 15 June 2013, Plovdiv.
ОПРЕДЕЛЯНЕ НА АЕРОТОЛЕРАНСА И NADH - ОКСИДАЗНАТА АКТИВНОСТ НА БИФИДОБАКТЕРИИ С ЧОВЕшКИ ПРОИЗХОД
доц. д-р Светлана Минкова, Какухеи Исава* „Ел Би Булгарикум" ЕАД - ЦНРП, София *Научно-изследователски институт на Мейджи Токио, Япония
DETERMINATION OF AEROTOLERANCE AND NADH -OXIDASE ACTIVITY OF BIFIDOBACTERIA OF HUMAN ORIGIN
Aerobic conditions are present during the process of manufacture and storage of functional foods. Tolerance to oxygen is of paramount importance for a microorganisms intended to be used in functional food products, since this property may guarantee for probiotic strains stability and viability in end products (1). The deleterious effects of oxygen in bacterial physiology are essentially due to oxidative damage, induced by the formation of the so-called reactive oxygen species(1,3). In Bifidobacteria, aerotolerance seems to be dependent on the presence of certain NADH oxidases and peroxidases, capable of detoxifying the cells (4,5). Usually, aerotolerance displays a high species-to-species variation in Bifidobacterium, and several species show an aerotolerant phenotype if a reducing agent, such as L-cysteine, is included in the liquid media (2,6).
In the present work the aerotolerance and NADH oxidase activity of Bifidobacteria with human origine were estimated and the strains with highest aerotolerance were selected.
Аеробните условия, присъстват по време на процеса на производство и съхранение на функционални храни. Кислородния толеранс е от първостепенно значение за микроорганизмите, предназначени за използване във функционални хранителни продукта, тъй като това свойство гарантира за пробиотичните щамове стабилност и жизнеспособност в крайни продукта (1). Вредните ефекти на кислорода върху бактериална физиология се дължат основно окислително увреждане, на клетката, водещо до нейната смърт(1,3). При Бифидобактериите аеротолеранса е в зависимост от наличието на определени NADH - оксидази и пероксидази, способни да детоксикират клетките (4, 5). Обикновено Аеротолеранса показва големи различия в зависимост от видовете и щамовете Бифидобактерии, като в отделни случаи се постига аеротолерантност ако редуциращо средство, като например L-цистеин, е включен в среда за култивиране (2,6).
В настоящата работа бяха оценени аеротолеранса и NADH - оксидазната активност на Бифидобактерии с човешки произход и бяха избрани щамовете с най-висок аеротолеранс.
Материали и методи
За целите на опита бяха използвани 50 щама Бифидобактерии, изолирани от здрави добраволци и съхланявани в микробната колекция на „Ел Би Булгарикум" ЕАД. За определяне на аеротолеранса им същите бяха подложени на три теста - култивиране в
млечна среда с 0,1% BYE, култивиране на твърда хранителна среда /BL агар/ с добавки на добре познати стимулатори на растежа като дефибринирана овча кръв и 1-Hydroxy-2-naphtoic acid и опредеране на NADH-оксидазната активност на тестванте микроорганизми.
Култивирането в млечна среда бе при аеробни условия и 37оС. Отчиташе се наличието или отсъствието на коагулация на млякото за 24часа. Средата за култивиране бе бъзстановено стерилно микробиорогично мляко/Merck/ с добавка на 0,1%BYE.
За определяне на растежа на твърда хранителна среда бе използван BL агар /WAKO, Japan/. Култивирането се извършваше при 37оС за 72h, в аеробна среда без добавки в агаровата следа и в аеробна среда с добавка на 5%^^)дефибринирана овча кръв или 1%(v/v) разтвор на 1-Hydroxy-2-naphtoic acid 200^g/ml EtON и култивиране без добавки към средата в анаеробани условия.
Определянето на NADH-оксидазната активност се извършваше след двукратното култивиране на Бифидобактериите в течна хранителна среда на TPY, сонификацията им и получаването на клетъчен екстракт. Протеиновата компонента се определяше по метода на Lowry, след което се извършваше спектрофотометрично определяне на NADH-оксидазната активност/Shimatsu/, като се определяше и влиянието на pH на средата върху изследвания параметър.
Резултати и обсъждане
В резултат на проведените първоначарни експерименти Бифидобактериите бяха раздерени на две групи - такива с относитерно висок аеротолеранс и такива с ниска устойчивост в кислородна среда- Табл.1 и Табл.2. Очаквано групата на аеротолерантните микроорганизми е значително по-малка от тази на анаеротолерантните. Беше наблюдаван по-силен стимулаторен ефект от дефибринираната овча кръв в сравнение с 1-Hydroxy-2-naphtoic acid, като не бе установена видова зависимост.
От тестваните 4 вида Бифидобактерии Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve и Bifidobacterium longum и единствено представители на Bifidobacterium infantis не показаха устойчивост кьм токсичното действие на кислорода. Някои от представителите на този вид Бифидобактерии коагулираха млякото за 24ч, но не образуваха колонии на твърда хранитерна среда, поради което не са включени в табл.1.
Резултатите от проведените анализи върху NADH-оксидазната активност са в унисон с резултатите поручени от други изсредователи. Според Talwalkar и Kailasapathy въпреки, че тези микроорганизми се считат за силно податливи на кислорода, съществуват значителни различия в тяхното кислородна толерантност.
NADH-оксидазна ативност на аеротолерантни Бифидобактерии
Табл.1
Щам NADH оксидазна активност nmol/min/mg prot
1/2 B.bifidum 72,744
3/16 B.bifidum 7,880
6/2 B.longum 371,006
8/6 B.breve 73,200
8/9 B.breve 32,364
11/11 B.breve 7,850
11/19 B.breve 12,830
10/2 B.longum 584,495
NADH-оксвдазна ативност на анаеротолерантни Бифидобактерии
Табл.2
Щам NADH оксидазна активност nmol/min/mg prot
1/1 B.bifidum 89,436
1/4 B.bifidum 129,080
1/6 B.bifidum 92,020
3/8 B.bifidum 137,010
10/15 B.bifidum 576,212
3/15 Б.т/апйв 491,964
9/4 Б.т/апИ' 31,039
6/7 Б.ЬгвУв 25,243
6/8 Б.ЬгвУв 14,527
6/9 Б.ЬгвУв 87,094
6/18 Б.ЬгвУв 94,805
10/3 Б.ЬгвУв 403,006
10/22 Б.ЬгвУв 66,100
10/29 Б.ЬгвУв 91,384
12/7 Б.ЬгвУв 994,886
7/2 Б.¡ongыш 207,224
7/13 Б.¡ongыш 580,547
2/14 Б.¡ongыш 176,889
10/12 Б.¡ongыш 52,619
13/15 Б.¡ongыш 477,341
14/1 Б.¡ongыш 304,272
Биохимията на окислителната реакция при тези бактерии предполага серия от сложни механизми, които действат в синхрон за защита на клетките от кислородната токсичност. Действието на NADH-оксидазата е критично в окислителните реакции в Бифидобактериите и се влияе от стойностите на рН на средата. Както е известно ферментиралите млека се характеризират с относитерно ниски стойности на рН и за да могат пробиотичните бактерии да окажат балаготворното си действие е необходимо те не само да оцелеят, но и да са в достатъчно количество. Както е видно от Граф.1и Граф.2 отговорът на никите стойности на рН са строго щамово специфичен. Докато за щам 8/6 при рН 5се наблюдава най-голяма устойчивост на токсичното влияние на кислорода, то за щам 11/19 това е най-неблагоприятната стойност на рН. Прави впечатление, че и двата тиствани микроорганизма са представители на Б.ЬгвУв, но демонстрират противоположен отговор на комбинираното вредно влияние на кислорода и ниското рН, което още веднъж докозва важността на пълното щамово охорактеризиране преди изплзването им в пранитерни продукти.
От друга страна на този етап не могат да бъдат обяснени приблизително еднаквите стойности на NADH-оксидазна активност, но различната степен на аеротолеранс изразена члез коагулацията на млякото и растежа на твърда хранителна среда - например Б. ¡о^ыш 10/2, представител на групата на аеротолерантните Бифидобактерии и Б. ¡о^ыш 7/13 от групата на анаеротолерантните претежават относително еднаква NADH - оксидазна активност 584,495 nmol/min/mg prot и 580,547 nmol/min/mg prot съответно. Тези резултати
определят необходимостта от по-нататъчни задъбочени проучвания на механизмите не само на клетъчно, но и на молекулно ниво.
Граф.1
Граф.2
Библиография:
1. Андриантсоанира В., 2013: Andriantsoanirina V,et al Tolerance of Bifidobacterium human isolates to bile, acid and oxygen. Anaerobe. 2013 Jun;21:39-42. Doi:10.1016/j. anaerobe.2013.04.005. Epub 2013 Apr 15.
2. Лорена Руиз 2011: Lorena Ruiz et al. Molecular clues to understand the aerotolerant phenotype of Bifidobacterium animalis subsp. lactis Appl. Environ. Microbiol. doi:10.1128/ AEM.05455-11 AEM, 18 November 2011
3. Ли 2010: Li, Qingqing; et.al Isolation and characterisation of an oxygen, acid and bile resistant Bifidobacterium animalis subsp. lactis Qq08 Journal of the Science of Food and Agriculture, Volume 90, Number 8, June 2010 , pp. 1340-1346(7)
4. Фрийман М.,2009: Marlena C. Freeman et al, Survival of Bifidobacterium animalis ssp. lactis DSMZ 10140 and Bifidobacterium animalis ssp. animalis ATCC 25527 during manufacture and storage of ice cream. College of Agriculture, Pennsylvania State University, Summer 2009
5. Шинджи Кавасаки 2006: Shinji Kawasaki et al., Response of the Microaerophilic Bifidobacterium Species, B. boum and B. thermophilum, to Oxygen Appl. Environ. Microbiol. October 2006 vol. 72 no. 10 6854-6858
6. Талвалкар 2004; Akshat Talwalkar and Kaila Kailasapathy The Role of Oxygen in the Viability of Probiotic Bacteria with Reference to L. Acidophilus and Bifidobacterium spp. Curr. Issues Intest. Microbiol. (2004) 5:
7. Биренс 2000: Beerens, H., F. Gavini, and C. Neut. 2000. Effect of exposure to air on 84 strains of Bifidobacteria. Anaerobe 6:65-67.
