CC BY
18
Научни трудове на Съюза на учените в България-Пловдив, Серия Г. Медицина, фармация и дентална медицина т. XIX. ISSN 1311-9427 юни 2016. Scientific works of the Union of Scientists in Bulgaria-Plovdiv, series G. Medicine, Pharmacy and Dental medicine, Vol. XIX, ISSN 1311-9427 Medicine and Dental medicine June 2016.
HPLC - МЕТОД ЗА КОЛИЧЕСТВЕНО ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ОРГАНИЧНИ КИСЕЛИНИ В КУЛТУРАЛНА СРЕДА НА
ДРОЖДИ
K. Георгиева1, С. Димитрова2, M. Кацарова2, K. Павлова1
1Лаборатория по приложни биотехнологии,
Институт по микробиология, Българска Академия на Науките, бул. „Руски" 139, Пловдив
2 Медицински университет-Пловдив, Фармацевтичен факултет,
катедра „Химия и биохимия", бул. „В. Априлов"15А, Пловдив
HPLC METHOD FOR DETERMINATION OF ORGANIC ACIDS IN
YEAST CULTURE MEDIUM
K. Georgieva1, S. Dimitrova2, М. Katsarova2, K. Pavloval
1 Laboratory of Applied Biotechnologies, Institute of Microbiology,
Bulgarian Academy of Sciences, 139 Ruski Blvd., Plovdiv
2 Department of Chemistry and Biochemistry, Faculty of Pharmacy,
Medical University, 15A V. Aprilov Blvd, Plovdiv
Abstract
Reliable HPLC method has been developed for quantifying determination of formic, acetic, lactic, malic, propionic, citric and fumaric acids synthesized biotechnologically by mesophilic and psychrophilic yeasts. Separation have been carried out on a reversed phase Hitachi C18AQ (250mm, 4mm, 5^m) column with a mobile H2O (pH 2.8) and detection at 210 nm. The method has been applied for screening of active yeast producers for synthesis of organic acids.
Key words: HPLC, yeasts, organic acids
Увод
Органичните киселини се използват широко в хранителната, козметичната и фармацевтичната индустрии (Takahashi et al., 2003, Dean 1985). За производството на органични киселини основно се използват два метода - химичен или ферментационен синтез (Ghaffar et al., 2014). От екологична гледна точка вторият е за предпочитане, тъй като
продуктите от ферментация са безопасни. Дрождите са обект на изследвания на учени от цял свят и интересът към тях като продуцента на органични киселини е голям (Kotani et al., 2004, By et al., 1991, Kamzolova et al., 2011). Толерантността им за развитие при ниски стойности на рН е предимство, което осигурява стерилност на процеса и дава възможност за синтез без неутрализация на ферментационната среда (Ghaffar et al., 2014). Изключително важно е използването на прецизен метод за анализ на органични киселини в различни обекти (Nollet 2000). Чрез HPLC с UV детектор са определени шестнадесет органични киселини в бира чрез вариране температурата на колоната с цел по-доброто им разделяне (By et al., 1991). Винена, ябълчена, оцетна, млечна, лимонена и янтарна киселини са установени в бели вина (Rodriguez-Bernaldo et al., 2009). Други автори използват HPLC метод за анализ на оцетна и левулинова киселина на колона Aminex HPX-87H при оптимална температура 45°С (Xie et al., 2011). HPLC методите са удобни за рутинна работа, осигуряват прецизност и възпроизводимост на резултатите.
Целта на настоящата работа е разработване на HPLC метод за определяне на органични киселини, синтезирани в културална среда на мезофилни и психрофилни дрожди.
Материали и методи
Проведена е предварителна селекция на 158 щама дрожди на твърда хранителна среда (Kamzolova et al., 2011) и на база получените лизисни зони са подбрани мезофилните щамове Candida utilis 2632, Candida mycoderma 2553 и Saccharomyces cerevisiae 513 и психрофилните Sporobolomyces salmonicolor AL1 и Cryptococcus laurentii AL62. Изследваните щамове са от колекцията на Лабораторията по приложни биотехнологии в Института по микробиология при БАН.
Дълбочинното култивиране на щамовете за синтез на органични киселини се извършва в колби от 500 mL на клатачка при 220 r/min. Мезофилните се развиват при температура 28 °С, а психрофилните при 22 ° С в продължение на 216 часа. Хранителната среда съдържа в (g/L): захароза - 40, MgSO4-7H2O - 0.7, KH2PO4 - 1.0, NaCl 0.5, CaCl2, дрождев екстракт -1.0. След завършване на ферментацията чрез центрофугиране при 5000 r/min се осъществява разделяне на биомасата от културалната течност, в която се намират синтезираните органични киселини. Работните проби преди инжектиране в хроматографа се филтруват през микрофилтър с големина на порите 0.2 ^m.
Използвана е HPLC-система Varian ProStar с колона Hitachi C18AQ (250mm, 4mm, 5^m), подвижна фаза вода с pH 2.8 (0.2% H3PO4 к-на ) в изократичен режим и детекция при 210 nm. Киселините са идентифицирани по времената на задържане на стандартните такива. Използвани са концентрационни интервали oт 10.0 до 150.0 ^g/ml за мравчена и лимонена, от 10.0 до 200.0 ^g/ml за пропанова, от 5.0 до 100.0 ^g/ml за оцетна, млечна и ябълчна и от 0.1 до 1.5 ^g/ml за фумарова. Количественото определяне се осъществява по метода на абсолютната калибровка. За обработка на данните е използван софтуер Star Chromatography Workstation Version 6.30 (build 5).
Резултати и дискусия
Разработен е HPLC-метод за определяне на мравчена, оцетна, млечна, ябълчна, прошнова, лимонена и фумарова киселини. При посочените в „Материали и методи" избрани условия за провеждане на анализа времената на задържане на киселините са съответно (min): мравчена - 6.79, оцетна - 8.26, млечна - 8.92, ябълчна - 9.93, прошнова - 21.01, лимонена - 23.09 и фумарова - 24.16 (фиг. 1). Това предполага добро разделяне и коректно идентифициране на изследваните вещества като се има пред вид, че абсорбционните им спектри са идентични.
Анализирани са три серии стандартни разтвори на чистите вещества при посочените условия и е установено, че в избраните концентрационни интервали съществува линейна зависимост между концентрация (х) и площ (у) на хроматографския пик (г2=0.9587^0.9996).
Фигура 1. Хроматограма на моделна смес от мравчена, оцетна, млечна, ябълчена, пропанова, лимонена и фумарова киселини
Това показва, че разработеният метод може да се използва за количествено определяне на изследваните киселини. Регресионните уравнения на стандартните им прави, корелационните коефициенти (г2) и коефициентите на вариация(RSD) са посочени в табл. 1.
Таблица 1. Регресионни уравнения, корелационни коефициенти и коефициенти на вариация на стандартни прави за количествено определяне на органични киселини
Анализирана киселина Регресионни уравнения на стандартните прави г2 КЖ, %
мравчена у=9.5683е+003х 0.9994 8.793
оцетна у=6.5565е+005х 0.9979 4.503
млечна у=7.0084е+003х 0.9990 4.716
ябълчна у=1.1061е+004х 0.9996 1.630
пропионова у=6.2534е+003х 0.9970 8.318
лимонена у=6.7095е+002х 0.9587 7.558
фумарова у=1.5311е+006х 0.9969 4.309
Проведен еекспериментза надеждност на методачрез определянена възпроизводимостта на резултатите. За целта е анализирана по една проба с позната концентрация за всяка от киселините. Резултатите за намерената концентрация са осреднени от три измервания и са дадени в табл. 2. Постигнатата възпроизводимост в граници от 96.9 до 100.6%, както и корелационни коефициенти между 1.6 и 8.7 % са показатели за точността на метода.
Киселини Параметри Мрав-чена Оцет-на Млеч-на Ябълчна Пропа-нова Лимонена Фумарова
Реална конц., Mg/ml 120 75 75 75 150 120 1.2
Намерена конц., Mg/ml 120.24 72.90 74.87 74.50 145.35 120.81 1.18
Възпроизводи-мост, %±0.1 100.2 97.2 99.8 99.3 96.9 100.6 98.0
Разработеният хроматографски метод е приложен за определяне на органични киселини в културалната течност на щамове Saccharomyces cerevisiae 513, Сandida utilis 2632, Сandida mycoderma 2553, Sporobolomyces salmonicolor AL1 и Cryptococcus laurentii AL62. Хроматограма на проба от културална среда на S. cerevisiae 513 е показана на фиг. 2.
Фигура 2 Хроматограма на проба от културална среда на щам Saccharomyces
cerevisiae 513
Селекционираните щамове са култивирани дълбочинно на хранителна среда с въглероден източник захароза, при което в културалната течност се натрупват мравчена, оцетна, млечна, ябълчна и фумарова киселини. Количествените стойности на синтезираните органични киселини са посочени в табл. 3. При щам S. сerevisiae 513 се отчитат най-големи количества от изброените киселини. Психрофилните S. salmonicolor AL1 и C. laurentii AL62 не синтезират мравчена, ябълчна и фумарова. Според Coote и Kirsop естеството и концентрацията на органични киселини, синтезирани от дрожди по време на ферментацията зависят от метаболитните състояния на клетката и наличните хранителни вещества (Coote and Kirsop, 1974). Получените резултати дават основание да бъде избран щам S. сerevisiae 513 като продуцент на млечна киселина, тъй като той показва най-изявена способност за нейния биосинтез. HPLC-методът ще бъде използван за проследяване на количествата изследвани органични киселини при оптимизиране на условията на култивиране на микроорганизмите.
Таблица 3 Количества органични киселини в културалната среда на мезофилни и
психрофилни дрожди
Киселини, mg/L ТТТямове Мравчена Оцетна Млечна Ябълчна Фумарова
C. utilis 2632 11.8±0.6 3.2±0,5 - 20.6±0.6 3.4±0.3
C. mycoderma 2553 6.1±0.04 22.8±0.6 16.6±0,5 5.5±0.02 0.8±0.04
S. cerevisiae 513 10.4±0.4 42.5±0.6 46.5±0.6 39.8±0.5 3.2±0.06
S.salmonicolor AL1 - 2.1±0.03 4.6±0.02 - 0.32±0.04
C. laurentii AL62 8.8±0.3 15.0±0.2 4.0±0.04 39.9±0.6 -
Разработен е подходящ метод за определяне на органични киселини в културална среда на дрожди. Селекционирани са пет щама активни продуценти на органични киселини от родове Candida, Saccharomyces, Sporobolomyces, Cryptococcus. Щам Saccharomyces cerevisiae 513 представлява научен интерес, тъй като притежава биологичен потенциал за синтез на органични киселини в значими количества, особено млечна киселина (46.5 mg/L). Това е от значение за продължаване на проучванията върху щама като подходящ продуцент на тази киселина, която е перспективен източник за получаване на биоразградим полимерен продукт.
Литература
By D, Bell J, Blake J, Prazak M, Rowelland D, Wilson P. Studies on yeast differentiation using organic acid metabolites part 1. Development of methodology using high performance liquid chromatography. J Inst Brew, 1991, 97, 297-305.
Coote N, Kirsop B. The content of some organic acids in beer and other fermented media. Journal of the Institute of Brewing, 1974, 80, 474-483.
Dean J. Lange's Handbook of Chemistry. 1985, McGraw-Hill Book Co., New York
Ghaffar T, Irshad M, Anwar Z, Aqil T, Zulifqar Z, Tariq A, Kamran M, Ehsan N, Mehmood S. Recent trends in lactic acid biotechnology: A brief review on production to purification. Journal of Radiation Research and Applied Sciences. 2014, 7, 222-229.
Kamzolova S, Fatykhova A, Dedyukhina E, Anastassiadis S, Golovchenko N, Morgunov I. Citric Acid Production by Yeast Grown on Glycerol-Containing Waste from Biodiesel Industry. Food Technol Biotechnol. 2011, 49, 65-74.
Kotani A, Miyaguchi Y, Tomita E, Takamura K, Kusu F. Determination of organic acids by high-performance liquid chromatography with electrochemical detection during wine brewing. J Agric Food Chem, 2004, 24,52-56.
Nollet L. Food Analysis by HPLC. 2000, Marcel Dekker, Inc., Basel
Rodriguez-Bernaldo de Qunys A, Lage-Yusty M, Lуpez-Herndez J. HPLC analysis of organic acids using a novel stationary phase. Elsevier Talanta, 2009, 78, 643-646.
Takahashi H, Ohba K, Kikuchi K. Sorption of mono-carboxylic acids by an anion-exchange membrane. Biochem Eng J, 2003, 16, 311-315.
Xie R, Tu M, Wu Y, Adhikari S. Improvement in HPLC separation of acetic acid and levulinic acid in the profiling of biomass hydrolysate. Bioresource Technology. 2011, 102, 4938-4942.
