CC BY
26
^особы защиты пивоваренных дрожжей от теплового шока
И.А. Конаныхина, Е.Ф. Шаненко
Московский государственный университет пищевых производств Г.И. Эль-Регистан, Ю.А. Николаев
Институт микробиологии РАН (Москва)
Известно, что во время технологических процессов дрожжи часто находятся в неоптимальных для роста и брожения условиях (воздействие температур и рН, отклоняющихся от оптимальных), что вызывает в клетках чрезвычайное напряжение адаптационных механизмов — стресс [1]. Основной стрессовый фактор в технологических процессах — температура, которая существенно влияет на скорость биохимических реакций, на скорость роста и размножение микроорганизмов. Влияние повышения температуры на любую реакцию выражается в увеличении ее скорости. Однако с повышением температуры возрастает вероятность денатурации клеточных белков и дезорганизации компонентов клетки [2]. Поэтому при возрастающем повышении температуры выше оптимальной рост микробной культуры замедляется или временно приостанавливается, а при температуре выше максимально переносимой — прекращается совсем, что сопровождается начинающейся гибелью клеток. В результате стрессовых воздействий дрожжи теряют свои технологические свойства (бродильную активность, способность к флокуляции). Одна из важнейших задач в технологиях бродильных производств — разработка способов повышения устойчивости пивоваренных дрожжей к тепловому шоку. Особенно
актуально повышение терморезистентности клеток для технологии получения сушеных дрожжей.
В последнее время большое внимание уделяется изучению внеклеточных ауторегуляторных факторов d1 дифференцированных клеток. У ряда бактерий и дрожжей факторы d1 представлены алкилоксибензолами (АОБ) [3, 4, 5]. АОБ обеспечивают межклеточную коммуникацию при формировании стрессового ответа клеток в микробной культуре: повышение их концентрации при экзогенном внесении протестировало бактерии Micrococcus luteus от теплового шока [6]. Было сделано предположение, что повышение концентрации АОБ в культуре дрожжей за счет дополнительного внесения химических аналогов микробных ауторе-гуляторов С7-АОБ или С12-АОБ будет способствовать защите клеток от последующего стрессового воздействия температуры. С другой стороны, для повышения устойчивости клеток к термическому шоку можно использовать явление предадаптации, когда предварительное (этому шоку) воздействие стрессора, например окислителя, обусловливает развитие защитных реакций клетки [7]. Оба эти повода были использованы для разработки способов защиты пивоваренных дрожжей от теплового шока.
В качестве объекта исследования были взяты эукариотические микроорганизмы — дрожжи Saccharomyces cerevisiae, так как, во-первых, представители этого вида имеют большое практическое значение, во-вторых, для них была установлена способность синтезировать аутоиндукторы анабиоза.
В первой серии экспериментов для повышения терморезистентности клеток дрожжей использовали химические аналоги факторов d1: С7-АОБ в концентрациях 0,1-1 г/дм3 и С12-АОБ в концентрациях 1-60 г/дм3, которые вносили в культуру дрожжей фазы логарифмического роста за 2 ч до температурного воздействия (30 мин при 45 °С). В культуре дрожжей до и после стрессового воздействия определяли число жизнеспособных клеток (КОЕ) методом высева десятичных разведений культуры на плотную среду. Количество стрессоустойчивых клеток рассчитывали как отношение числа жизнеспособных клеток после термообработки к числу жизнеспособных клеток до обработки (%). Полученные данные, представленные на рис. 1, показали, что все концентрации С7-АОБ оказывали протекторное действие на клетки дрожжей. Оптимальной была концентрация 0,5 г/дм3, при добавлении которой количество жизнеспособных клеток дрожжей после термообработки было в 2 раза больше, чем в контроле (без добавления С7-АОБ). Таким образом, увеличение концентрации С7-АОБ в дрожжевой культуре за счет их экзогенного введения повышает устойчивость клеток к термическому воздействию. Дополнительное внесение С12-АОБ перед тепловым шоком не приводило к повышению терморезистентности дрожжевых клеток (рис. 2). Наоборот, гибель клеток наблюдали даже при использовании минимальной из выбранных концентраций С12-АОБ (1 мг/дм3). Концентрация С12-АОБ 60 мг/дм3 вызывала полную гибель культуры. Таким
Концентрация С7-АОБ, г/дм:
Концентрация С12-АОБ, мг/дм3
50
45- 44
40- П
35-
30-
25-
20- 18,3
15- ■
10- 5,6
5- 0,7 П 1
0 И Контроль 30 100 150
Концентрация H2O2, мМ
Рис. 1. Влияние предынкубации
культуры дрожжей S. cerevisiae с С7-АОБ к воздействию температуры (45 °С, 30 мин)
Рис. 2. Влияние предынкубации
культуры дрожжей S. cerevisiae с С12-АОБ к воздействию температуры (45 °С, 30 мин)
Рис. 3. Влияние предынкубации Н2О2 на устойчивость дрожжей S. cerevisiae к воздействию температуры (45 °С, 30 мин)
2007
18
образом, два гомолога микробных алкил-оксибензолов С7- и С12-АОБ оказывают различное действие на развитие адаптогенных реакций клеток дрожжей: если предобработка С7-АОБ индуцирует защитную систему клеток, приобретающих устойчивость к тепловому шоку, то предварительное внесение С12-АОБ, напротив, потенцирует и обусловливает гибель клеток.
Другим возможным путем повышения термоустойчивости дрожжей была их предадаптация при применении другого стрессора — пероксида водорода Н2О2. При изучении возможности использования окислительного стресса Н2О2 для предадаптации дрожжей к тепловому шоку в культуру фазы логарифмического роста вносили Н2О2 в концентрациях 30-150 мМ за 2 ч до температурного воздействия (при 30 мин 45 °С). О жизнеспособности клеток судили по численности (КОЕ), определяя ее до и после теплового шока (рис. 3). В предварительных опытах было установлено, что Н2О2 в установленных концентрациях не вызывал гибели более 20 % клеток дрожжей. Как видно из рис. 3, в варианте предварительного внесения в культу-
ру 30 мМ Н2О2 доля выживших после термического шока клеток увеличивается в 2 раза по сравнению с контрольным вариантом (без Н2О2), при внесении 100 мМ Н2О2 — в 40 раз, при 150 мМ — в 18 раз. Во всех этих вариантах сублетальные концентрации пероксида повышали устойчивость клеток дрожжей к последующему действию температуры, вызывающей термический шок.
Таким образом, полученные данные показали, что стресс, не вызывающий гибели клеток, способствует созданию защитной системы дрожжей перокси-дом водорода. Н2О2 в концентрации 100 мМ может быть использован для предадаптации культуры пивоваренных дрожжей к тепловому шоку.
Полученные результаты по протекторному действию С7-АОБ и Н2О2 против теплового воздействия на дрожжи могут быть применены для совершенствования технологических процессов бродильных производств и способов получения сушеных дрожжей.
ЛИТЕРАТУРА
1. Баснакьян И.А. Стресс у бактерий — М.: Медицина, 2003.
2. Piper P. W. Molecular events associated with acquisition of heat tolerance by the yeast Sacchar-omyces cerevisiae//FEMS Microbiol. Rev. 1993. V. 11. № 4. P. 339-355.
3. ОсиповГ.А., Эль-РегистанГ.И., СветличныйВ.А., Козлова А.Н., Дуда В.И., Капрельянц А.С., По-мазанов В.В. О химической природе ауторе-гуляторного фактора d1 Pseudomonas carbo-xydoflava // Микробиология. 1985. Т. 54. № 2. С. 184-190.
4. БатраковС.Г, Эль-РегистанГ.И, ПридачинаН.Н, Ненашева В.А., Козлова А.Н., Грязнова М.Н., Золотарева И.Н. Тирозол — ауторегуляторный фактор d1 Saccharomyces cerevisiae//Микробио-логия. 1993. Т. 62. № . 4. С. 633-638.
5. Мулюкин А.Л., Козлова А.Н., Капрельянц А.С., Эль-Регистан Г.И. Обнаружение и изучение динамики накопления ауторегуляторно-го фактора d1 в культуральной жидкости и клетках Micrococcus luteusZ/Микробиология. 1996 (a). Т. 65. № 1. С. 20-25.
6. СтепаненкоИ.Ю., Мулюкин А.Л., Козлова А.Н., Николаев Ю.А., Эль-Регистан Г.И. Роль алки-локсибензолов в адаптации Micrococcus luteus к температурному шоку // Микробиология. 2005. Т. 74. № 1. С. 26-33.
7. Андреищева Е.Н., Звягильская Р.А. Адаптация дрожжей к солевому стрессу // Прикл. биохимия и микробиология. 1999. Т. 35. № 3. С. 243-256. &
КОНГРЕСС «ТОПЛИВНЫЙ БИОЭТАНОЛ - 2007»
Российская биотопливная ассоциация совместно с подразделением «Гененкор» компании «Даниско» объявила о проведении I в России Второго конгресса «Топливный биоэтанол-2007». Он пройдет 17-18 апреля 2007 г. в Москве в «Ренессанс-отеле». Ведущие эксперты индустрии топливного этанола из Европы, США и России выступят на различные темы, включая: мировой рынок этанола; политика государства по стимулированию производства биотоплива; позиция нефтяных и автомобильных компаний по использованию биоэтанола; новые ферментные технологии; рынок этанола и вторичных продуктов; как производителям зерна получить добавочную прибыль от производства биоэтанола; финансирование проектов.
Конгресс проводится при поддержке Государственной Думы РФ, Министерства сельского хозяйства РФ, Министерства промышленности и энергетики РФ, Министерства экономического развития РФ, Российского Зернового Союза, Общества биотехнологов России, Ассоциации «Деналко», Научного центра «Агро-ЭкоПрогноз».
Дополнительную информацию можно получить по электронной почте [email protected], по телефону +7 (495) 585-5167 и на сайте www.bioethanol.ru
Российская биотопливная ассоциация (РБА) объединяет производителей возобновляемого топлива (биоэтанола и биодизеля) и продвигает использование возобновляемых топлив в России. Главная цель РБА — обеспечить наилучшие законодательные, коммерческие и другие условия для расширения производства и применения возобновляемого биотоплива в России. Сайт в Интернете: www.biotoplivo.ru
Подразделение «Гененкор» компании «Даниско» — ведущая компания промышленных биотехнологий, разрабатывает и поставляет инновационные ферменты и биопрепараты для производства новых промышленных продуктов и для уменьшения вредного влияния на окружающую среду.
г
1 • 2007
9
