CC BY
33
УДК 579.242; 579.841.3
ОБРАЗОВАНИЕ ЦИСТОПОДОБНЫХ ПОКОЯЩИХСЯ ФОРМ
зтоитговтим меыьоп Р221 под влиянием
АЛКИЛОКСИБЕНЗОЛА А.Ю. ПОГОРЕЛОВА, Н.Г. ЛОЙКО*, А.А. ВАНЬКОВА (Кафедра микробиологии)
Установлено, что внесение химического аналога микробных аутоиндукторов анабиоза — алкилоксибензола С12-АОБ — в концентрациях 5х10'4 — 5х10'5 М в клеточные суспензии неспорообразующих симбиотрофных бактерий 81погЫгоЫит теШоИ на предстационарной фазе роста вызывает образование цистоподобных покоящихся клеток (ЦПК), предназначенных для выживания в неблагоприятных и стрессовых условиях. ЦПК характеризовались длительным сохранением жизнеспособности, снижением метаболической активности, устойчивостью к повреждающим воздействиям (терморезистентность), особенностями ультраструк-турной организации. Длительно хранившиеся ЦПК при прорастании сохраняли подвижность в полужидкой среде. Внесение С12-АОБ в концентрации 10'3М индуцировало образование мумифицированных клеток, теряющих жизнеспособность при сохранении интактности. Показано, что АОБ играют значительную роль в адаптации микроорганизмов к неблагоприятным условиям окружающей среды.
Ключевые слова: БтотЫгоШит теШоИ, цистоподобные покоящиеся клетки, алкилоксибензолы, аутоиндокторы анабиоза, рефрактерность, подвижность.
Важным адаптационным свойством почвенных микроорганизмов, в т.ч. неспорообразующих, является формирование покоящихся клеток, предназначенных для переживания неблагоприятных для роста или стрессовых условий. У ризобиальных бактерий эти процессы усложнены тем, что кроме стадии свободноживущих гетеротрофных клеток в их жизненном цикле присутствует стадия симбиотического взаимодействия с бобовыми растениями. Благодаря интенсивным исследованиям последних лет начинает накапливаться информация о том, какие факторы обеспечивают выживание ризо-бий в почве и их конкуренцию за об-
разование клубеньков [10]. Результаты таких исследований имеют важное значение для создания высокоэффективных бактериальных препаратов, позволяющих снижать потребность в азотных удобрениях и улучшать качество почв. Эффект от применения симбиотрофных азотфиксаторов, заменяющих внесение минерального азота (по подсчетам экономистов США) составляет 45-210 долл. на 1 га (в зависимости от вида растения) [9]. Поэтому первоочередной задачей становится создание бактериальных препаратов, содержащих клетки ризобиальных бактерий, выживающих в стрессовых условиях и способных к эффек-
* Институт микробиологии имени С.Н. Виноградского РАН, г. Москва. Работа выполнена при поддержке РФФИ, грант № 07-04-01011.
тивным симбиотрофным взаимоотношениям с растениями. Такими клетками могут быть покоящиеся формы, высокоустойчивые к повреждающим воздействиям и сохраняющие способность к возобновлению роста.
В ранее проведенных исследованиях было обнаружено, что микроорганизмы различных таксономических групп (Басскаготусез сегеу18гае, Мгс-гососсиэ ЬШеив, ТЫоа1ка1ШЪг1о 'оегзиЫэ) при действии внеклеточных аутоиндукторов анабиоза формируют цистоподобные покоящиеся клетки (ЦПК), обладающие всеми характеристиками покоящихся форм [3, 4]. Механизм действия аутоиндукторов анабиоза, по своей химической природе относящихся к алкилоксибензолам (АОБ), основан на их способности к комплексооб-разованию с мембранными липидами и клеточными биополимерами за счет слабых физико-химических взаимодействий [1]. При повышении концентрации АОБ в клетках изменяются структурное состояние и функциональная активность мембран, наблюдаются дегидратация клеточного протопласта, изменение каталитической активности ферментных белков на фоне повышения их функциональной стабильности, изменяется топология ДНК [1, 2, 8]. В результате клетка приобретает состояние покоя, сопряженное с повышенной устойчивостью к повреждающим факторам внешней среды, не теряя при этом способности к возобновлению метаболической активности. Целью данной работы было изучение образования покоящихся клеток симбиотроф-ной бактерии БшогЫгоЫит тгШоЫ Dangeard при действии повышающихся концентраций химического аналога микробных аутоиндукторов анабиоза.
Материалы и методы
Почвенные симбиотрофные бактерии ЗтогЫгоЫит теШоИ Р221 (получены из коллекции ИБФРМ РАН, Саратов; выделены из корневой зоны тростника южного) выращивали на маннитной пи-
тательной среде следующего состава (г/л): дрожжевой экстракт — 1,0; ман-нит — 2,0; К2НР04 — 0,2; КН2Р04 — 0,2; MgS04 — 0,2; СаС12 — 0,02. Ино-кулят — культуру стационарной фазы роста — вносили в количестве, дающем начальную оптическую плотность (ОП) клеточной суспензии 0.1 (X = = 650 нм, 1 = 10 мм, «БресогсЬ, Германия). Культивирование проводили в колбах на 250 мл (50 мл среды) на качалке (140-160 об/мин) при 28°С.
Покоящиеся формы бактерий получали при внесении в культуры фазы замедленного роста химического аналога аутоиндукторов анабиоза микроорганизмов С12-АОБ в виде этаноль-ных растворов до конечных концентраций 5хЮ"5 - 10'3М при содержании этанола не более 5%. В контрольных вариантах в культуры бактерий вносили эквивалентное количество этанола. Жизнеспособность клеток 5. теЫоН определяли по числу колониеобразующих единиц (КОЕ) при высеве соответствующих разведений на агаризо-ванные среды (концентрация агара 2%). Термоустойчивость бактерий определяли по числу КОЕ после прогревания клеточных суспензий в ультратермостате 11-10 при температуре 50 и 60°С в течение 10 мин. Эндогенное дыхание клеток определяли по методу Шоль-ца — Островского на полярографе ЬР7Е в кислородной ячейке объемом 1 мл [7]. Микроскопические наблюдения производили при помощи микроскопа «АтрПуаЬ (ГДР) с фазово-контраст-ным устройством. Коллективную подвижность ризобий оценивали по образованию колоний через 5 сут после высева клеток уколом бактериальной петлей в полужидкую агаризованную среду (концентрация агара 0,4%).
Эксперименты проводили в 2-4 сериях с 5-кратной повторностью измерений в каждой. Статистическую обработку данных вели с расчетом среднеквадратичных отклонений при использовании ^критерия Стьюдента для уровня достоверности Р>0,95.
Результаты и их обсуждение
Как было отмечено ранее, повышение в среде роста бактерий уровня аутоиндукторов анабиоза приводит к образованию цистоподобных покоящихся форм, обладающих рядом характеристик: длительным сохранением жизнеспособности; изменениями в морфологии и ультраструктурной организации клеток развитием рефрактер-ности; отсутствием экспериментально определяемого уровня эндогенного дыхания; повышенной устойчивостью к повреждающим воздействиям.
В наших экспериментах образование покоящихся форм *5. тгШоЫ индуцировали внесением химического аналога факторов анабиоза С12-АОБ в предстационарную культуру бактерий (40 ч) до конечных концентраций 10"3, 5хЮ'4, 10'4, 5хЮ'5М. Воздействие ауторегулятора оказалось дозозависимым, а также развивалось во времени (табл. 1). Так, через 30 мин экспозиции бактерии, подвергнутые воздействию самой высокой из исследуемых концентраций С12-АОБ (10‘3 М), теряли способность к колониеобразованию (КОЕ). При фазово-контрастном микроскопировании наблюдали уменьшение клеток в размерах и приобретение ими рефрактер-ности. В суспензиях клеток с С12-АОБ
в концентрации 5х10'4М через 30 мин и 5 сут инкубации жизнеспособность бактерий снижалась на 3,5 порядка, а через месяц не выявлялась совсем, при этом 90% бактерий приобретали рефрактерность (рис. 1). Внесение в бактериальную суспензию £. теШоИ С12-АОБ в наименьшей концентрации — 5х10*5 М вначале (30 мин) не сказывалось на численности КОЕ. Однако при длительной инкубации (5 сут — 1 мес) число клеток, способных образовывать колонии на агаризованной среде было на 39 и 83% соответственно выше, чем в контроле. Микроскопические наблюдения показали, что клетки становились более мелкими, рефрактерность развивалась у ~6~7% бактерий (в контрольных суспензиях — У 1-з%).
В дальнейших экспериментах было установлено, что клетки в длительно хранящихся опытных образцах не обладали экспериментально выявляемым уровнем эндогенного дыхания, что свидетельствовало об ингибировании их метаболической активности.
Полученные переживающие клетки опытных вариантов 5х10-4 М — 5x10'5 М обладали терморезистентностью. После обработки бактериальных суспензий при 50°С в течение 10 мин число жизнеспособных (КОЕ) клеток
Таблица 1
Число колониеобразующих клеток в клеточных суспензиях Э. теШоН после внесения С12-АОБ
Концентрация С12-АОБ, М Время хранения
численность, КОЕ/мл (% от контроля)
30 мин 5 сут 1 мес
Контроль (6,9±0,2) х 109 (100) (2,3±0,1) х 109 (100) (4,2±0,2) х (100) 108
10'3 0 (0) 0 (0) 0 (0)
5Х 10"4 (1,0±0,1) х106 (6±0,4) х105 0
(0.02) (0.03) (0)
Ю^4 (5,9±0,2) х 109 (2,1 ±0,1) х 108 СП |+ о ы X 107
(85,5) (9,1) (11,9)
5X10'5 (6,7±0,3) х 109 (3,2±0,2) х109 (7,7±0,5) х 108
(97,1) (139,1) (183,3)
а) б)
Рис. 1. Клетки Э. теШоН. Микроскопирование в фазовом контрасте: а — клетки стационарной фазы роста (48 ч); б — клетки при воздействии С12-АОБ в концентрации 5x10'4 М (1 мес)
в опытных образцах было в 4~5 раз больше, чем в контрольных. Воздействие температуры 60°С в течение 5 мин оказалось губительным как для контрольной, так и для опытных клеточных суспензий. Однако оно способствовало реактивации покоящихся некуль-тивируемых клеток, полученных в экспериментах с экзогенным внесением С12-АОБ в концентрации 5х10~4М, жизнеспособность которых не выявлялась в стандартных условиях после рассева на агаризованную среду.
Так как бактерии S. meliloti являются представителями симбиотрофных микроорганизмов, то необходимой частью исследования было изучение коллективной подвижности клеток (оценивают визуально) в популяциях, вырастающих при рассеве покоящихся форм в полужидкий агар (рис. 2). Вегетативные клетки S. meliloti скоординированно распространялись из точки инокуляции с образованием регулярных кольцевых структур — роились (Swa+ фенотип, от англ. swarming —
Рис. 2. Коллективная подвижность в полужидкой агаризованной среде (0,4%) клеток в. теШоН, выросших из покоящихся форм, полученных при действии С12-АОБ (5 сут): а — контроль: б — концентрация 10‘4М; в — концентрация 5x10 5 М
роение). На фоне роения наблюдалось распространение клеток с образованием микроколоний (Gri+ фенотип, от англ. granular inclusions) [6]. При рассеве покоящихся форм в полужидкий
агар тип их подвижности сохранялся (смешанный 8ша+Оп+), а скорость движения была на уровне контроля (варианты 5хЮ"5М, 5х10‘4 М) или выше (вариант 10'4М) (табл. 3).
Таблица 2
Термостабильность клеток 5. теШоН, подвергнутых воздействию С12-АОБ (хранившихся в течение месяца)
Вариант Число жизнеспособных клеток, КОЕ/мл (% от КОЕ до термообработки)
до термообработки 55°С, 10 мин 60°С, 5 мин
Контроль (4,2±0,24) х 108 (100) (4,5±0,48) х 104 (0,01) 0
10'3 0 0 0
5х104 0 0 (6,7±0,53) х 103
1СҐ (5.1 ±0,34) х 107 (2,2±0,1) х 104 0
(100) (0,04)
5х 10'5 (7,7±0,5) х 108 (4.0±0,32) х 105 0
(100) (0,05)
Таблица 3
Социальная подвижность клеток S. meliloti, подвергнутых воздействию С12-АОБ
Время
инкуба-
Концентрация С12-АОБ, М
диаметр зон распространения, мм
ции контроль 10‘3 5x10'4 10'4 5x10'5
30 мин 19,75 0 15 25 15
5 сут 15 0 15 19,5 14
1 мес 11 0 0 15 11
Таким образом, впервые для сим-биотрофных ризобий £. теШоЫ было показано, что они, как и другие неспорообразующие бактерии, способны в условиях повышения уровня аутоиндукторов анабиоза формировать цистоподобные покоящиеся клетки, обладающие всеми необходимыми характеристиками покоящихся форм бактерий (микроорганизмов). Численность и свойства образующихся покоящихся клеток зависели от концентрации ауто-
регулятора и времени хранения покоящихся клеток. Действие высоких концентраций С12-АОБ (выше 5хЮ~4 М) приводит к необратимым последствиям, вызывая полную потерю клетками колониеобразующей способности (при сохранении интактности). Такие клетки можно отнести к описанным ранее мумифицированным формам [5]. Умеренные дозы ауторегулятора, напротив, способствуют поддержанию численности жизнеспособных клеток на более высоком по сравнению с контрольным уровне, а образующиеся переживающие формы обладают повышенной терморезистентностью и сохраняют способность к колониеобразова-нию и свойство подвижности. Полученные результаты могут быть использованы при создании бактериальных препаратов нового поколения, основой которых станут цистоподобные покоящиеся клетки бактерий, длительно сохраняющие жизнеспособность и устойчивость к повреждающим воздействиям.
Бухарин О.В., Гинцбург A.JI., Романова Ю.М., Элъ-Регистан Г.И. Механизмы выживания бактерий. М.: Медицина, 2005.
Давыдова O.K., Дерябин Д.Г., Элъ-Регистан Г.И. Влияние химических аналогов микробных ауторегуляторов на чувствительность ДНК к УФ-облучению // Микробиология, 2006. Т. 75. № 5. С. 654—661.
Лойко Н.Г., Соина B.C., Сорокин Д.Ю., Митюшина Л.Л., Элъ-Регистан Г.И. Образование покоящихся форм у грамотрицательных хемолитоавтотрофных бактерий Thioalkalivibrio versutus и Thioalkalimicrobium aerophilum // Микробиология, 2003. Т.72, №3. С. 328-337.
Мулюкин АЛ., Jlycma К.А., Грязнова М.Н., Козлова А. Н., Дужа М.В., Дуда В.И., Элъ-Регистан Г.И. Образование покоящихся форм Bacillus cereus и Micrococcus luteus // Микробиология, 1996. Т. 65. № 6. С. 782-789.
Сузина Н.Е., Мулюкин А.Л., Лойко Н.Г., Козлова А. Н., Дмитриев В.В., Шорохо-ва А.П., Горленко В.М., Дуда В.И., Элъ-Регистан Г.И. Тонкая структура мумифицированных клеток микроорганизмов, образующихся под влиянием химического аналога аутоиндуктора анабиоза // Микробиология, 2001. Т. 70. № 5. С. 1-11.
Шелудъко А. В., Кацы Е. И. Образование на клетке Azospirillum brasilense полярного пучка пилей и поведение бактерий в полужидком агаре // Микробиология. 2001. Т. 70. № 5. С. 1-6.
Шолъц К. Ф., Островский Д. Н. Ячейка для амперометрического определения кислорода // Методы современной биохимии. М.: Наука, 1975. С. 52-58.
Элъ-Регистан Г.И., Мулюкин АЛ., Николаев Ю.А., Сузина Н.Е., Гальченко В.Ф., Дуда В.И. Адаптогенные функции внеклеточных ауторегуляторов микроорганизмов // Микробиология, 2006. Т. 75. № 4. С. 446-456.
Peterson Т.A., Russel М.Р. // J. Soil Water Conserv, 1991. V. 46. P. 229-233.
Spaink. H.P, Kondorosi. A., Hooykaas. P.J.J. // The Rhizobiaceae. Molecular Biology of Model plant-Associated Bacteria. Dordrecht. Boston. London. Kluwer Academic Publishers, 1998.
Рецензент — к. б. н. А.Н. Смирнов
SUMMARY
It was revealed that the addition of chemical analogue of microbial anabiosis — inducing factors — alkylhydroxybenzene Ci2-AHB — to suspensions of non-spore-forming nitrogen-fixing bacteria Sinorhizobium meliloti in concentrations 5xl0"4 — 5хЮ'5 M led to formation of dormant cyst-like cells intended for survival under adverse and stressful conditions. These dormant cells possessed the long-term maintenance of viability, the reduced or undetectable metabolic activity, the stability to damaging factors (heat-resistance), specific ultrastructure. After prolonged incubation, dormant cyst-like cells preserved the mobility in the semiliquid medium after germination and entering new development cycle. The addition of Ci2-AHB at the high concentration 10"3M resulted in the formation of mummified forms that lost viability, being morphologically intact, the obtained data show a significant role of AHB in the adaptation of microorganisms to adverse environmental conditions.
