Cорбция белка на поверхности макропористых полимерных гидрогелей на основе модифицированного поливинилового спирта Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

УДК 678.744.72:54-148

A.C. Сидорова, A.C. Голунова, A.A. Apтюxoв, М.И. Штильман

Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия

СОРБЦИЯ БЕЛКА НА ПОВЕРХНОСТИ МАКРОПОРИСТЫХ ПОЛИМЕРНЫХ ГИДРОГЕЛЕЙ НА ОСНОВЕ

МОДИФИЦИРОВАННОГО ПОЛИВИНИЛОВОГО СПИРТА

Макропористые полимерные гидрогели были получены путем сополимеризации акриловых производных поливинилового спирта с ^^диэтиламиноэтилметакрилатом (ДЭMAA) и акриловой кислотой в воднозамороженных системах. Исследована сорбция белка на поверхность синтезированных гидрогелей.

Macroporous polymer hydrogels have been synthesized via polymerization of acrylic derivatives of polyvinyl alcohol with N,N-diethylaminoethylmethacrylate and acrylic acid in frozen water solutions. The adsorption of protein on the surface of obtained polymer hydrogels was studied.

Введение

Гидрогели - это сшитые полимерные сетки, полученные на основе гидрофильных полимеров, способные к набуханию в воде. Благодаря ряду уникальных свойств в последнее время полимерные гидрогели нашли применение в различных областях, связанных с медициной и биотехнологией [1-2]. Особое место среди полимерных гидрогелей занимают, так называемые, макро - исуперпористые полимерные гидрогели, то есть гидрогели, обладающие системой связанных между собой пор с размерами в десятки и сотни микрометров [3].

С развитием биотехнологии и, в частности, биоинженерии появилась необходимость получения различных подложек для выращивания клеток. Многие типы гидрогелей используемые для этой цели имеют нейтральную поверхность и в силу этого достаточно инертны к прикреплению клеток. Однако путем модификации таких материалов заряженными мономерами их поверхности можно придать положительный или отрицательный заряд, что будет способствовать клеточной адгезии, одним из важных этаповкоторой является сорбция белков - природных полиэлектролитов [4].

Таким образом, в данной работе была исследована иммобилизация белка на поверхности макропористых полимерных гидрогелей на основе модифицированного поливинилового спирта, дополнительно содержащих заряженные группы.

Материалы и методы Модификация поливинилового спирта. Модификацию поливинилового спирта проводили согласно известным методикам [5]. В работе был использовае макромер, содержащий 2,5 мольн.% замещенных групп.

Синтез гидрогелей. Синтез макропористых полимерных гидрогелей проводили в тонких стеклянных пробирках объёмом 15 мл. К заранее рассчитанному объёму модифицированного поливинилового спирта

добавляли точный объем акриловой кислоты (АК) или N,N-диэтиламиноэтилметакрилатом (ДЭАЭМА). После чего систему охлаждали до температуры 0^5 0С, добавляли рассчитанное количество инициатора, а затем интенсивно перемешивали и помещали в криотермостат (JulaboF-32, США), где поддерживали заданную температуру с точностью ± 0,2 ОС в течение необходимого времени.

По завершении процесса реакционную систему быстро размораживали, образовавшиеся гидрогели промывали в горячей воде до полного исчезновения в промывных водах непрореагировавших компонентов. Качество отмывки определяли, измеряя интенсивность поглощения промывных вод в интервале длин волн 200-400 нм., при помощи спектрофотометра (Unico 2804, Япония). Отмытые гидрогели сушили лиофильно до постоянной массы.

Определение сорбции белка на поверхности. Для исследования сорбции белка на поверхности полученных макропористых полимерных гидрогелей использовали раствор бычьего сывороточного альбумина (БСА) концентрацией 10 г/л.

Навеску гидрогеля помещали в 5 мл раствора альбумина и выдерживали необходимое время.

Регистрацию количества альбумина в растворе проводили при помощи метода Бредфорд, основанного на образовании окрашенного в синий цвет комплекса красителя кумасси ярко-голубого G-25 с белком.

Емкость гидрогеля определяли по формуле:

E=(VoСо-Е(Vi - )Ci) - VCi ,

m

где V0 -начальный объем пробы, мл;

Vi - объем в измеряемый момент времени, мл;

С0 - начальная концентрация альбумина в пробе, г/мл;

Ci - концентрация альбумина в измеряемый момент времени в пробе, г/мл;

m - масса сухого образца, г.

Обсуждение результатов Объектом исследования настоящей работы являлась сорбция белка на поверхности макропористых полимерных гидрогелей на основе модифицированного поливинилового спирта, дополнительно содержащих заряженные группы. Макропористые полимерные гидрогели были получены по описанной выше методике.

Схема получения гидрогелей:

-CH2—CH-

-CH-L

i т

OHJx

V

CH?OOCfc= CH2

I

OH

I 5

CH2= ^COOCH2CH2N(C2H5)2

I 'm

0

1

CH2 I 2 HO—CH2 I 2 CH2 I 2

O—C—C=CH2 II I 2

O CH3

ПВС

CH2= CH—COOH

олигометакрилат

полиакриловая кислота Иммобилизация альбумина. В качестве модельного белка использовался бычий сывороточный альбумин, являющийся удобной и широко распространенной моделью для изучения свойств глобулярных белков.

На рис. 1 приведена зависимость величины сорбции БСА на поверхности синтезированных гидрогелей от времени.

500-1

400

L.

£

Л

i 300 i

ID Л

ч о

£ 200 3

ю

О.

о и

100

. .........................................

0 50 100 150 200 250 300 350 400

Время, мим

Рис. 1. Зависимость сорбции альбумина (мг альбумина/ г носителя) от времени.

Температура синтеза -15 °С, доля звеньев АК и ДЭАЭМА 15 мольн.%. Суммарная концентрация макромеров 0,06 г/мл

Как можно видеть, большая часть альбумина (порядка 90-95%) сорбируется в первые 5-6 часов, причем сорбция на аминосодержащем носителе протекает несколько быстрее. Существенно, что емкость полученных полимерных гидрогелей по альбумину достигает значительных величин, превышая значения 450-500 мг белка на 1 грамм носителя.

Емкость по альбумину гидрогелей поливинилового спирта, не содержащих заряженных групп, составляет ~25 мг/г., поэтому можно утверждать, что сорбция белка на синтезированных гидрогелях происходит

за счет образования ионных связей между заряженнымигруппами матрицы гидрогеля и концевыми амино- и карбоксильными группами аминокислот связывающих доменов альбумина.

500

•^400

I

ге" I

>300 й л ч ш сс

1-200 ю а о и

100

О I ■ ■ ■-■...............■........

О 2 4 б 8 10 12 14 16

Доля заряженных звеньев, мольн.%

Рис. 2. Зависимость сорбции альбумина (мг альбумина/ г носителя) от концентрации мономера. Температура синтеза -15 °С.

Суммарная концентрация макромеров 0,06 г/мл

В силу ионного связывания БСА на поверхности гидрогеля, можно было предположить, что количество связываемого альбумина будет зависеть от количества заряженных групп в составе гидрогеля. И, действительно, как можно видеть на приведенной зависимости (рис. 2) емкость по альбумину возрастает по мере роста концентрации ионогенных групп, достигая максимума при ~10 мольн.%, при этом емкость аминосодержащих гидрогелей возрастает несколько быстрей, что может объяснятся строением альбумина, являющегося «кислым белком», после чего практически не меняется. Прекращение роста величины сорбции, связано, очевидно, со стерическими затруднениями.

Концентрация ионов водорода вблизи носителя и в свободном растворе отличны друг от друга. Существует определенное распределение протонов между носителем и средой. Изменение баланса электростатических и водородных связей при ионизации способных на это групп белка при взаимодействии с полимером обусловлено природой белка и типом носителя и может сказываться на процессах иммобилизации. Как правило, сорбция белка при значениях рН близких к изоэлектирической точке выше [6]. Альбумин относится к «кислым» белкам - величина его изоэлектрической точки 4,9, поэтому можно было ожидать увеличение емкости по альбумину с ростом значения рН раствора. Подобная картина имела место в случае аминосодержащего гидрогеля (рис. 3). Однако в случае сополимера с акриловой кислотой количество иммобилизованного на геле белка возрастает по мере роста величины водородного показателя.

Рис. 3. Зависимость сорбции альбумина (мг альбумина/ г носителя)от рН раствора.

Температура синтеза -15 °С, доля звеньев АК и ДЭАЭМА 15 мольн.%. Суммарная концентрация макромеров 0,06 г/мл

Данный факт может быть объяснен тем, что снижение сорбции может нивелироваться значительным увеличением удельной поверхности вследствие роста величины набухаемости и, как следствие, существенного роста линейных размеров образцов гидрогеля при увеличении значения рН.

Таким образом, в данной работе была изучена сорбция белка на поверхности макропористых полимерных гидрогелей на основе модифицированного поливинилового спирта, дополнительно содержащих заряженные группы.

Библиографические ссылки

1. Hydrogels in Medicine and Pharmacy. Properties and applications. Ed. Peppas A.N. Boca Raton: CRC Press, 1987. V. III. 208 PP.

2. Штильман М.И. Полимеры медико-биологического назначения. М.: Академкнига, 2005. 400 c.

3. Superabsorbent polymer. Ed. Bucholz F.L., Peppas N.A. Science and technology. American Chemical Society, 1994. P. 148.

4. Yong Mei Chen, Noromi Shiraishi, Hideo Satokawa, Akira Kakyso, Tet-suharu Narita, Jian PingGrong, Yoshihito Osada, Kinuto Yamamoto, Joji Ando Gutivation of endothelial cells on adhesive protein-free synthetic polymer gels // Biomaterials, 2005. V. 26. P. 4588-4596.

5. Martens P., Anseth K.S. Characterization of hydrogel formed from acrylate modified poly(vinyl alcohol) macromers // Polymer, 2000. V. 41. P. 7715-7722.

6. Andrade J. D. Surface and Interfacial Aspects of Biomedical Polymers. Plenum Press New York and London, 1985. V. 2. 72 PP.