CC BY
26
УДК 633.358:631,44S.2S:631.461 :S76.8
Численность микроорганизмов в ризосфере у сортов гороха посевного при формировании азотфиксирующего симбиоза
С.Н. ПЕТРОВА, доктор сельскохозяйственных наук В.А. ДЕНЩИКОВ
Орловский государственный аграрный университет E-mail: [email protected]
Дана количественная оценка основных эколого-трофических групп микроорганизмов в ризосфере у гороха посевного. Установлено увеличение количества диазотрофов в ризосфере у сортов, формирующих активные симбиотичес-кие системы. Показана взаимосвязь между численностью диазотрофов и нит-рогеназной активностью корней гороха.
Ключевые слова: микробные сообщества, диазотрофы, растительно-микробные системы, горох посевной, сорт, ПЦР в реальном времени.
Особенности микробного сообщества почвы - крайне высокая численность (до нескольких миллиардов микроорганизмов в I г почвы) и исключительное генетическое разнообразие, достигающее нескольких тысяч таксономических групп. Большинство из этих микроорганизмов некультивируемые и мало известны науке. Микробное сообщество почвы и его генетическая структура очень точно и быстро отзывается на любой внешний фактор, в том числе на антропогенное воздействие. Последние достижения молекулярной экологии микроорганизмов продемонстрировали гораздо более высокое разнообразие микробиоты почвы, чем предполагалось ранее [I- 3]. Однако несмотря на постоянный интерес к оценке азотфиксирующей активности почв в агроценозах, количество и состав азотфиксирующих микробных сообществ недостаточно изучено, а существующие сведения основаны, главным образом, на результатах использования традиционных методов культивирования [4, S].
С появлением современных мо-лекулярно-биологических подходов значительно расширились возможности изучения почвенных диазотроф-ных сообществ. Мы исследовали влияние микробиологического препарата, изготовленного на основе произ-
3 Земледелие № 5
водственного штамма p. Rhizobium, на изменение численности прокариот-ного сообщества темно-серой лесной почвы, в том числе диазотрофов, в посевах гороха посевного.
Почва была отобрана в агроценозах сортов Спартак, Темп и Фараон в период максимальной экссудации растений (6-7 листьев). ДНК выделяли из навески массой 0,S г, которую отбирали в пластиковую пробирку (2 мл) с завинчивающейся крышкой. К каждой навеске добавляли 7S0 мкл буфера I (СТАВ 2 %; TRIS-HCI 0,1 М; EDTA20 мМ; NaCI 1,4 М; pH 8,5) и 0,5 г стеклянных шариков (0,35 мм). Пробы прогревали 30 мин при 65 °С. Разрушение пробы проводили в гомогенизаторе FastPrep 24 («М.Р. Biomedicals») в течение 1 мин при максимальной интенсивности встряхивания (6,5 м/с). Затем прогревание повторяли. Пробу дважды экстрагировали хлороформом, суммарную ДНК осаждали изопропанолом, растворяли в 100 мкл буфера ТЕ (TRIS-HCI 10 мМ; EDTA 1 мМ) и смешивали со 100 мкл расплавленной 2 % легкоплавкой агарозы («Sigma»). После застывания агарозные блоки отмывали в 2 мл буфера ТЕ (3 раза по 3 ч). Далее агарозу расплавляли при 65 °С, добавляли ацетат натрия до конечной концентрации 0,3 М, дважды экстрагировали фенолом, один раз фенол-хлороформом (1:1), один
раз хлороформом и мкл водной фазы. ДНК осаждали изо-пропанолом, промывали 70 % этанолом, подсушивали и растворяли в S0 мкл воды [6]. Выход ДНК составлял не менее 2 мкг ДНК на I г почвы.
Определение численности основных групп микроорганизмов проводили с использованием ПЦР с детекцией в реальном времени. В качестве контроля использовали клониро-
отбирали 350
ванные фрагменты таксономически значимых генов: 16S рРНК Escherichia coli - для бактерий, 16S рРНК штамма FG-07 Halobacterium salinarum - для архей, ITS штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae Meyen 1В-D1606 - для грибов. Праймеры Eub338/EubS18, arc91Sf/arc10S9r, ITS1f/S.8s применяли соответственно для количественного определения бактерий, архей и грибов со следующим температурным профилем: 94 °С - 10 с ; 63 °С - 10 с; 72 °С - 30 с; детекцию флюоресценции проводили при 72 °С. Во всех случаях использовали Taq-полимеразу («Хели-кон») - 2 ед. на реакцию. В реакционную смесь добавляли SYBR-green («Amresco») до конечной концентрации 0,3х и изотиоцианат флюоресце-ина (конечная концентрация 10 нм). ПЦР с детекцией в реальном времени осуществляли в амплификаторе ¡Cycler в трех повторностях. Для обработки результатов использовали программное обеспечение, прилагающееся к прибору ¡Cycler. Количественные характеристики выражали в числе копий РНК-оперонов.
Для количественной оценки азотфиксирующего прокариотного сообщества почвы была проведена амплификация гена nifH, кодирующего Fe-белок нитрогеназы и служащего маркером азотфиксации. Амплификацию фрагмента гена nifH проводили с использованием пары вырожденных праймеров F1-R6 [7]. Продукты амплификации подвергали электрофорезу в 1 % агарозном геле и окрашивали бромистым этидием. В качестве электрофоретического буфера использовали 0S трис-ацетат-ный буфер (ТАЕ буфер). После элек-трофоретического разделения полосы ДНК визуализировали в проходящем ультрафиолетовом свете.
Объем реакционной смеси для
3,0х10г-2,5 х 10" -
2,0 xjtf- -Щ
^Н ^И i
1,0x1а5-
I i I i I
С парт
Фара
] контроль
Л
Теми штамм 2636
Рис. 1. Количество архей в ризосфере у сортов гороха посевного в фазе 6-7 настоящих листьев (в среднем за 2009-2010 гг.)
U ф
2 ä
<в
<в ä s а
z
IO
а p
о ^
со
17
Ieíaí0íaéá.p65
23.06.2013, 0:20
17
м
1,8* 10°-1 1,6*10*1,4» 10й-
1,0*10*-8,0Х10!-6,0* 10;-4,0хЮ;-2,0хЮ;-0-
а
Спартак
*
ЛШ.
Фараон 1смп
"2 контроль штамм 2636
Спартак
Фараон
] контроль
Темп
штамм 2636
Рис. 2. Количество грибов (а) и бактерий (б) в ризосфере у сортов гороха посевного в фазе 6-7 настоящих листьев (среднее за 2009-2010 гг.) * Различия достоверны при Р < 0,05
терий 2636 количество грибов увеличивалось на 36 % в ризосфере сорта Спартак и на 4S % в ризосфере сорта Фараон (рис. 2). Поскольку грибы служат активными деструкторами, увеличение бактериальной биомассы способствует созданию благоприятных условий для
ПЦР в реальном времени составлял 2S мкл. В каждый образец добавляли 2 ед. Тар-полимеразы и ЭУВВ-дгееп. Температурно-временной профиль ПЦР был следующим: первый цикл - 94 °С, 3 мин; S0 °С, 3 мин и 72 °С, 3 мин; последующие S циклов -94 °С, 30 с; S0 °С, 2 мин и 72 °С, 30 с; последние 30 циклов - 94 °С, 30 с; 40 °С, 30 с и 72 °С, 30 с; окончательная полимеризация - 72 °С, 7 мин.
Значительную часть микробного сообщества темно-серой лесной почвы составляли бактерии. Их количество в 10 раз превышало аналогичный показатель для архей и грибов (рис. 1-3). На археи приходилось около 3 % от микробного сообщества почвы. Ни сорт гороха, ни интродукция производственного штамма р. ^¡гоЫит не повлияли на количественные характеристики архейно-го сообщества (рис. 1). Это согласуется с данными литературы, которые свидетельствуют о распространении архей главным образом в экстремальных условиях среды [8, 9].
Численность грибной микрофлоры в темно-серой лесной почве не изменялась в зависимости от сорта растений, тогда как в варианте с внесением штамма клубеньковых бак-
питания и размножения грибной микрофлоры.
Существенной разницы между сортами по количеству бактерий в их ризосфере не было (рис. 2). Однако по абсолютному значению бактериальное сообщество в посевах сорта Темп оказалось многочисленнее, чем в посевах сорта Фараон, в 1,4 раза, Спартак - в 1,7 раза. Это можно объяснить повышенной экссудацией гороха Темп в связи с высокой скоростью линейного роста корня [10]. Данные литературы подтверждают, что формирование ризосферной микрофлоры и обеспечение азотфиксации зависит от корневых выделений растений [11, 12].
При инокуляции семян гороха производственным штаммом И. 1едит1-повагит 263б численность бактериального сообщества в ризосфере у сортов Спартак и Фараон увеличилась соответственно в 2,2 и 1,8 раза, что связано с улучшением азот-фиксирующей деятельности посевов. Количество бактерий в почвенных пробах, отобранных под горохом Темп, не изменялось.
ПЦР-реакция суммарной почвенной ДНК с праймерами на ген нитрогеназы показала увеличение количества ди-азотрофов в ризосфере у сортов Спартак и Фараон в 2,7
раза (рис. 3). Очевидно, И. 1едит1-повагит служит для этих генотипов гороха активным, вирулентным и специфичным и не является комплементарным для сорта Темп. Однако следует отметить, что по сравнению с изученными сортами ризосфера ли-сточкового сорта Темп была в 1,61,7 раза богаче диазотрофами, абсолютное количество которых доходило до 1,09-109 кл/г почвы.
Корреляционный анализ показал наличие сильной положительной связи между количеством диазотрофов в почве и нитрогензной активностью корней - коэффициент г = +0,97.
Улучшение условий симбиотроф-ного питания растений оказывало положительное влияние на сбор зерна гороха с 1 га [13]. Так, в среднем за годы исследований за счет интродукции в ризосферу гороха производственного штамма клубеньковых бактерий удалось добиться прибавки продуктивности сорта Спартак на 42 %, Фараон - на s0 %. В посевах листочкового генотипа штамм не был эффективен.
Таким образом, подбор комплементарной пары макро- и микросимбионта для азотфиксирующего симбиоза не только способствует росту зерновой продуктивности гороха посевного, но и стимулирует микробиологическую активность почвы за счет увеличения численности микроорганизмов из основных эколого-трофических групп, в том числе ди-азотрофов.
Литература
I. Сэги Й. Микробиологические методы исследования. - М.: Агропромиздат, 1983. - 156 с.
□
I 2636
Рис. 3. Количество РНК-оперонов т/Н-гена в ризосфере у сортов гороха посвного (среднее за 2009-2010 гг.) * Различия достоверны при Р < 0,05
1ёТаТбТаеа.р65
23.06.2013, 0:21
18
2. Андронов Е.Е., Петрова С.Н., Чижевская Е.П. и др. Влияние внесения генетически модифицированного штамма Sinorhizobium meliloti АСН-5 на структуру почвенного сообщества микроорганиз-мов//Микробиология, 2009. - Т. 78. -№ 4. - С. 1-10.
3. Петрова С.Н., Андронов Е.Е., Пина-ев А.Г. и др. Перспективы использования методов молекулярно-генетического анализа в почвенной экологии//Вестник ОрелГАУ, 2010. - № 5(10). - С. 45-48.
4. Задорина Е.В. Биоразнообразие диазотрофов почв с различной антропогенной нагрузкой/Автореф. дис. ...канд. биол. наук. - М., 2008. - 26 с.
5. Кизилова А.К., Титова Л.В., Кравченко И.К. и др. Молекулярный анализ микробных сообществ в ризосфере сои/ Актуальные аспекты современной микробиологии. - М., 2010. - С. 105-107.
6. Ausubel F.M., Brent R., Kingston R.E. et al. Current protocols in Molecular Biology. - NY: John Wiley and Sons, 1994. - 52 р.
7. Марусина А.И., Булыгина Е.С., Кузнецов Б.Б. и др. Разработка системы олигонуклеотидных праймеров для амплификации генов nifH различных таксономических групп прокариот//Микро-биология, 2001. - № 1. - С. 86-91.
8. Nicol G.W., Glover LA., Prosser J.I.
Spatial analysis of archaeal community structure in grassland soil//Appl. Environ. Microbiol., 2003. - V. 69. - № 12. - P. 7420-7429.
9. Schleper C., Jurgens G., Jonuscheit M. Genomic studies of uncultivated Archaea/ /Nat. Rev. Microbiol. 2005. - V. 3. - P. 470-488.
10. Новикова H.E., Уваров B.H., Кон-дыков И.В. Использование в селекции гороха нового способа отбора по показателям роста растений на раннем этапе онтогенеза [Скорость линейного роста зародышевого корня и стебля у высоко- и низкоурожайных генотипов]//Вестник РАСХН, 2007. - № 6. - С. 43-45.
11. Звягинцев Д.Г., Добровольская Т.Г., Бабьева И.П. и др. Роль микроорганизмов в биоценотических функциях почв/Структурно-функциональная роль почвы в биосфере. - М., 1999. - С. 113121.
12. Свистова И.Д., Фролова Л.О., Щербаков А.П. Формирование комплекса микроорганизмов чернозема выщелоченного в зависимости от типа агрофи-тоценоза//Сельскохозяйственная биология, 2003. - № 5. - С. 55-61.
13. Парахин Н.В., Кузмичева Ю.В., Петрова С.Н. Энергетическая эффективность создания растительно-микробных
систем в агроценозах гороха посевного// Земледелие, 2010. - № 8. - С. 28-30.
Статья поступила в редакцию 22.03.2013
Quantity of microorganisms in rhizosphere of pea varieties during the formation of nitrogen-fixing symbiosis
S.N. Petrova, V.A. Denshikov
Quantitative assessment of the main ecologo-trophic groups of microorganisms in a rhizosphere of peas sowing is given. Increasing in quantity of nitrogen-fixing microorganisms in rhizosphere of the varieties that form active symbiotic systems was established. The interrelation between quantity nitrogen-fixing microorganisms and nitrogenase activity in the roots of peas was shown. Keywords: microbial communities, nitrogen-fixing microorganisms, pea, variety, real-time PCR.
Современные
проблемы
эрозиоведения
Ф.Н. Лисецкий,
A.A. Светличный, С.Г. Черный
Белгород: Константа, 2012. - 456 с.
Одна из главных причин сокращения почвенных ресурсов - эрозия почвы, в результате которой площадь пашни в мире сокращается ежегодно на 0,4 % (Кирюхина, Пацукевич, 2004). Эрозиоведение, как направление в естественных науках, должно соответствовать требованиям решения жизненно важной проблемы рационального использования оставшихся почвенных ресурсов.
В данной монографии приводится критический анализ существующих представлений о проблемах эрозии почвы и подходах к их решению. Монография состоит из 10 глав, содержание которых можно разделить на следующие части: причины и последствия эрозии; методология экспериментальных исследований; разработка математических моделей; образование гумусового горизонта; допустимые эро-
зионные потери почвы; проектирование противоэрозионных мероприятий с использованием методов ГИС-технологий.
Разработка методологии экспериментальных исследований в эрозио-ведении представляет собой весьма сложную проблему и находится в начальной стадии развития. В качестве экспериментального метода для оценки противоэрозионной стойкости почвы авторы использовали методику дождевания стоковых площадок, предложенную Г.И. Швебсом.
Разработка математических моделей относится к теории эрозионных процессов. Их потребность все время возрастает, поскольку без количественной оценки потерь почвы уже невозможно выбирать мероприятия. В этом направлении произошел наибольший прогресс. Приводится обзор подходов к разработке моделей и самих моделей, разработанных в разное время и в разных странах. К сожалению, не приводится погрешность моделей и возможность применения их для других почвенно-климатических условий.
В книге дается анализ подходов к оценке допустимых эрозионных потерь почвы в разных странах и в разное время. Авторы предлагают за допустимые потери почвы принять
скорость образования гумусового горизонта. С этим можно согласиться, если экономические условия дают такую возможность, поскольку с уменьшением допустимых потерь резко возрастают затраты на противоэрозионные мероприятия.
Проектирование противоэрози-онных мероприятий с использованием методов ГИС-технологий предлагается проводить с помощью компьютерной системы "Агроланд-шафт", разработанной на кафедре физической географии и природопользования Одесского национального университета им. И.И. Мечникова. В этой системе кроме выбора противоэрозионных мероприятий решаются и другие задачи, например, оптимизация использования эрозионно опасных земель. Отсутствие примера конкретного проекта (или его фрагмента) не позволяет наглядно оценить полученное решение.
Изложенный в монографии ма- " териал интересен специалистам, | занимающимся проблемами эрозии ®
почвы.
Ю.П. СУХАНОВСКИЙ, доктор z сельскохозяйственных наук g
ВНИИЗиЗПЭ p
E-mail: [email protected] S
w
lëîäîÔîäèâ.p65
23.06.2013, 0:21
19
