CC BY
38
Костяев А. А.1, Утёмов С. В.1, Андреев А. А.1, Полежаева Т. В.2, Мартусевич А. К.3, Исаева Н. В.1, Шерстнев Ф. С.1, Ветошкин К. А.1, Калинина Е. Н.1, Князев М. Г.1
1 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства», г. Киров
2 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии Коми научного центра Уральского отделения Российской академии наук, г. Сыктывкар
3 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Кировская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Киров
ЧЕТЫРЕХКЛАССНАЯ СИСТЕМАТИЗАЦИЯ БИОКРИОКОНСЕРВАНТОВ IV КЛАСС ХЛАДООГРАЖДАЮЩИХ РАСТВОРОВ — КОМБИНИРОВАННЫЕ
КРИОКОНСЕРВАНТЫ
Kostyaev A. A.1, Utyomov S. V.1, Andreev A. A.1, Polezhaeva T. V.2, Martusevich A. K.3, Isaeva N. V.1, Sherstnyov P. S.1, Vetoshkin K. A.1, Kalinina E. N.1, Knyazev M. G.1
1 Federal State Budget institution of Science «Kirov Research Institute of Hematology and Blood Transfusion of the Federal Medical and Biological Agency», Kirov
2 Federal State Budgetary Institute of Physiology of the Komi Scientific Centre of the Ural Branch of the Russian Academy of Sciences, Syktyvkar
3 Federal State Budgetary Institution of Higher Professional Education «Kirov State Medical Academy» of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation, Kirov
A FOUR CLASS SYSTEMATIZATION OF BIOCRYOCONSERVANTS. The IV class of cold preserving solutions — combined cryoconservants
Резюме. Представлены комбинированные криоконсерванты. Рецептура криоконсерван-тов IV класса базируется на основе би- (двух) криопротекторов I и II классов или I и III классов. В статье рассматривается структура, некоторые физико-химические, биологические, токсикологические и хладозащитные свойства криопротекторов комбинированного действия. Показано использование криокон-сервантов IV класса в практике низкотемпературной консервации эритроцитов, гемо-поэтических стволовых клеток (ГСК), тром-боцитных и лейкоцитных концентратов (КТ,
Кл).
Ключевые слова: криопротекторы, крио-консерванты комбинированного действия.
Summary. The combined cryoprotectants are represented. The formulation of IV class solutions is based on bi-cryoprotectants of class I and II or I and III classes. The paper highlights some of the physical and chemical, biological, toxicological and pharmacological properties of cryoprotec-tors of combined action. The use of IV class cryoconservants in practice of low temperature conservation of erythrocytes, hematopoietic stem cells (HSCs), platelets and leucocyte is shown.
Key words: cryoprotectants, cryoconservants combined action.
Введение. Предварительные результаты, полученные при замораживании безъядерных и ядерных клеток крови (ЯКК) и костного мозга (ЯККМ) под защитой криоконсер-вантов I — II и III классов, показывают, что в большинстве случаев эти вещества обеспечивают стабильный положительный протекторный результат. В результате усовершенствования этапов технологии низкотемпературного консервирования (ТНТК) различных биообъектов переливания криоконсервиро-
ванных компонентов крови и костного мозга получили широкое применение в комплексной терапии больных гемобластозами и с патологией иммунной системы. Успехи, достигнутые в трансфузионной криобиологии, стали также возможны за счет усовершенствования рецептур моно- и бикриоконсервантов, в которых основной составной частью, предупреждающих повреждение структур биологических систем живых клеток при их замораживании-отогреве, являются криопротек-
торы внутри-, внеклеточного и смешанного действия [1].
Ранее отмечалось, что эффективные («сильные») криопротекторы в абсолютном большинстве представляют собой «чуждые» для тканей человека субстанции, контакт с которыми несет риски развития либо обратимых изменений («псевдотоксический эффект»), либо более стойких повреждений на клеточном или организменном уровне физико-химической природы [2].
С целью устранения возможного отрицательного воздействия криопротекторов на клеточные структуры, повышения их защитных свойств на этапах ТНТК биологических объектов, облегчения течения репара-тивных процессов после стрессорных воздействий и восстановления функциональной активности, криобиологии посчитали перспективным направление по изучению эффективности комбинированных криокон-сервантов («коктейлей») с включением в их состав дополнительных ингредиентов из солей органических и неорганических кислот, углеводов, белков плазмы крови, биологически активных веществ и других компонентов [1, 2, 3]. Состав комбинированных криокон-сервантов по причине видоспецифичности биологического материала вариабелен: экзо-и эндоцеллюлярные криопротекторы, анти-оксиданты и стабилизаторы биологических мембран (витамин Е, глутатион восстановленный, сывороточный альбумин и др.). Кроме того, в состав раствора для замораживания IV класса вводится какой-либо антикоагулянт (например, ЭДТА №2, цитрат натрия и др.) для предотвращения необратимой агломерации клеток. В составе консервантов часто используют предшественники нуклеиновых кислот (инозин, аденин) в комбинации с фосфатами и глюкозой, которые способствуют активации восстановительных процессов [4, 5].
Целью работы явилось ознакомление широкого круга криобиологов с основными компонентами рецептурных прописей криокон-сервантов комбинированного действия для замораживания компонентов крови и костного мозга.
Комбинированный криоконсервант «Гемжел» на основе глицерина и ПВП для замораживания ГСК костного мозга при -196 °С.
Разработан в ГНЦ РАМН [6]. Криоконсервант «Гемжел» включает: высокоочищен-
ный глицерин, 66 мл; поливинилпирролидон (ПВП) с м.м. 12600 ± 2700, 70 г; динатриевая соль ЭДТА, 1 г; раствор желатина медицинского 10 % для инъекций, 200 мл; натрий цитрат трехзамещенный, 10 г; гемодез — до 1000 мл. рН раствора 7,0-7,4.
Препарат нетоксичен, апирогенен. Стерилизуют фильтрацией через Millipore с диаметром пор 0,22 мкм и асептично фасуют в стеклянные флаконы по 100-250 мл. Приготовленный «Гемжел» добавляют в костномозговую взвесь 1: 1, осторожно перемешивают, выдерживают при комнатной температуре до 30 мин, с помощью системы для переливания крови с фильтром переводят по 120 мл в криоконтейнеры емкостью 160 мл, герметизируют, паспортизируют и направляют для замораживания. Охлаждение проводят по двухступенчатой программе: на первом этапе — со скоростью 1°С/мин до 9 °С, на втором — 10 °С/мин до -185 °С, после чего переносят в хранилище с жидким азотом (-196 °С), в котором хранят более 15 лет. Процесс замораживания продолжается в течение 43-45 мин. Контейнеры с замороженной костномозговой взвесью помещают в водяную баню вместимостью 20 л с температурой 39 °С -40 °С и подвергают энергичному покачиванию в течение 1 минуты. Через 7 лет криконсервирования в этих условиях сохраняются жизнеспособными 71,4 % ЯККМ и 78,3% ГСК КМ [6].
Комбинированные криоконсерванты на основе глицерина и препаратов желатина для сохранения гранулоцитов в состоянии холодового гипобиоза (-10 °С).
Разработаны Е. П. Сведенцовым в 2004 г. в Институте физиологии Коми научного центра УрО РАН [1]. Для защиты клеток от неблагоприятных факторов холодового стресс-воздействия оптимальными показали себя рецепты №3 и № 7.
Криоконсервант № 3 включает следующие компоненты: высокоочищенный глицерин, 7 %; модежель, 85,6 %; сукцинат гидрок-симетилэтилпиридина, 0,3 %; цитрат натрия, 1,4 %; вода для инъекций до 100 мл.
Криоконсервант № 7 имеет следующий состав: высокоочищенный глицерин, 7 %; же-латиноль, 70 %; сукцинат гидроксиметилэ-тилпиридина, 0,3 %; лимонная кислота, 1 г; трилон Б, 0,1 г; вода для инъекций до 100 мл. рН раствора доводят до 7,0-7,4 10 н каплями водного гидроксида натрия.
Каждый раствор смешивают с КЛ в соотношении 1: 1, выдерживают 20 мин в контейнере «Компопласт 300» при комнатной температуре, затем переносят в ванну с 45% этиловым спиртом, охлажденным до -10 °С, на 40-45 мин (с раствором № 3) и 25-27 мин (с раствором № 7). Хранят в бытовом электрохолодильнике при -10 °С в ванне, содержащей 45 % этиловый спирт. Отогревают в 10-литровой водяной ванне с температурой теплоносителя +39 °С — +40 °С и подвергают энергичному покачиванию в течение 2-4 сек. В указанных криоконсервантах гра-нулоциты не замерзают, входят в состояние холодового гипобиоза и через 9 суток после выхода из него сохраняют высокую способность к фагоцитозу (76,7 ± 5,0 % для раствора №3 и 72,6 ± 3,8 % для раствора № 7). Значительная часть функциональной активности клеток сохраняется на уровне 75,7 и 61,4% соответственно).
Биологические испытания растворов показали, что криоконсерванты нетоксичны, апирогенны и не требуют отмывания от биообъекта [1].
Комбинированный криоконсервант на базе ГМБТОЭМ и ДМСО для замораживания лейкоцитов при -80 °С.
Разработан Е. П. Сведенцовым и соавт. в 2003 г. в Институте физиологии Коми научного центра УрО РАН [2]. Лучшая сохранность лейкоцитов по функциональным и морфологическим характеристикам после замораживания до -80 °С и отогревания клеток наблюдается после применения криозащитного раствора следующего состава: гексаметиленби-стетраоксигидроэтилмочевина (ГМБТОЭМ), 22 %; диметилсульфоксид (ДМСО), 8%;.сукци-нат ГОМЭП, 02 %, вода для инъекций до 100 мл. Криоконсервант смешивают с лейкоконцен-тратом (ЛК) в соотношении 1:1 и выдерживают 20 мин в контейнере «Компопласт 300» при комнатной температуре. Замораживают по нелинейной программе в течение 54-55 мин. Су-спезию размораживают в водяной ванне при +35 °С 35-50 сек до температуры содержимого биоконтейнера +2 — +4°С. После размораживания через сутки сохраняется 96,8 ± 4,2 % лейкоцитов, эозинорезистентных клеток — 88,6 ± 7,3 %. Фагоцитарная активность ней-трофилов составляет 75,5 ± 8,5 %. Те же показатели после размораживания ЛК спустя 180 суток составляют 89,3 ± 6,4 %, 91,0 ± 5,1 % и 76,7 ± 14,7 % соответственно.
Комбинированный криоконсервант на основе ГМБТОЭМ и а-пропиленгликоля для замораживания гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) костного мозга млекопитающих при низкой температуре.
Разработан в ФГБУН КНИИГиПК ФМБА России для замораживания ядерных клеток костного мозга (ЯККМ) с ГСК при температуре от -80 °С до -90 °С [2]. Лучшие результаты по морфологической сохранности и проли-феративной способности после размораживания ГСК получены с применением крио-защитного раствора следующего состава: ГМБТОЭМ, 30 г; а-пропиленгликоль, 1 г; дина-триевая соль ЭДТА, 0,1 г; лимонная кислота, 1 г. вода для инъекций до 100 мл, рН раствора— 7,0-7,38.
Криоконсервант смешивают с суспензией ГСК в соотношении 1: 1 при комнатной температуре, выдерживают в течение 20 мин и замораживают по 3-хступенчатой программе: на первом этапе — 1 °С/мин до -7 °С, на втором — 10°С/мин до -40 °С, на третьем — 20 °С/мин до -80 °С--90 °С. После
отогревания контейнера с костномозговой взвесью при температуре воды +39 °С в течение 20-25 сек до температуры биообъекта +2 °С сохраняется 92 % ЯККМ. Предложенный криоконсервант нетоксичен, апирогенен, не требует отмывания его от размороженных ЯККМ.
Комбинированный криоконсервант на базе Гидроксиэтилкрахмала (ГЭК) и ДМАЦ для замораживания ядерных клеток крови (ЯКК) до температуры -80 * -196 °С.
Разработан в лаборатории консервирования крови и тканей ФГБУН КНИИГиПК ФМБА России А. А. Костяевым, К. А. Ветошкиным и С. В. Утемовым в 2006 г. [2].
Криоконсервант имеет следующий состав: ДМАЦ (х. ч.), 3,5 мл; ГЭК (в составе «Инфукол ГЭК»), 46,3 мл; фосфатный буфер (ЫаИ2Р04*2И20, моль), рН раствора 6,5-7,0.
При замораживании ЯКК до температуры -80 °С и последующем отогревании обеспечивает сохранность 94,2-97,1 % функционально полноценных клеток. При замораживании до температуры -196 °С и последующем отогревании обеспечивает сохранность 92,797,8 % функционально активных клеток.
Заключение. Анализ криобиологической литературы за последние 50 лет по развитию методов длительного сохранения вне орга-
низма человека в биологически полноценном состоянии клеток крови и костного мозга показывает, что исследователям удалось найти высокоэффективное направление в решении этой проблемы. Им оказалось замораживание биологических объектов при низких и ультранизких температурах. В основу исследований были положены принципиально новые биокриотехнологии, новые способы замораживания тканей, подбор, синтез и применение органических веществ, получивших название криопротекторов разного механизма действия, их комбинации с улучшающими добавками, позволяющих оптимизировать состояние отдельных звеньев физиологических и метаболических систем, подвергнутых замораживанию и отогреву [2].
Приведенные данные показывают, что в проблеме консервирования компонентов крови и костного мозга имеются определенные успехи в основном при использовании низких и ультранизких температур. Открыт малотоксичный криопротектор смешанного
действия ГМБТОЭМ, не требующий отмывания. Предложенные учеными рецепты комбинированных криоконсервантов на основе ГБМТОЭМ вселяют у криобиологов оправданный оптимизм. Однако, несмотря на достигнутые успехи в трансфузионной криобиологии, многие ее аспекты остаются открытыми и требуют дальнейших исследований. Остается актуальным поиск универсального для различных клеток и тканей криопро-тектора, а также разработка эффективных технологий низкотемпературного консервирования биообъектов в нетоксичных кри-оконсервантах при широком диапазоне отрицательных температур. Определенные надежды в снижении рисков посттрансфузион-ных осложнений криопротекторного генеза исследователи связывают с использованием на доклиническом этапе различных методов биокристалломики с целью индивидуального подбора оптимального для больного криопротектора и рецепта криоконсерванта на его основе.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Е. П. Сведенцов. Криоконсерванты для живых клеток. — Сыктывкар, 2010. — 80 с.
2. А. М. Белоус, М. И. Шраго, Н. С. Пушкарь. Криоконсерванты. — Киев: «Наукова думка», 1979. — 198 с.
3. Е.М.Корниенко, В. А. Бондаренко. Перспективность использования комбинированных криопротекторов при замораживании компонентов крови одноступенчатым способом при температуре -196 °C // Проблемы криобиологии. 2008. Т. 18, № 2. — С. 248.
4. K. R. Diller. Intracellular freezing: effects of extracellular supercooling // Cryobiology. 1975. Vol.12, № 5. — P. 480-485.
5. J. Carrol, M. J. Wood, D. G. Whittinham. Normal fertilization and development of frozеn-thawed mouse oocytes: protective action of certain macromolecules // Biol. Reprod.1993. Vol. 48. — P. 606-612.
6. А. Г. Федотенков и др. Комбинированный ограждающий раствор, не требующий отмывания перед трансплантацией костного мозга // Материалы симпозиума по эффективности трансплантации костного мозга в клинике, актуальным вопросам гематологии и трансфузиологии. — Ташкент: «Медицина» УССР, 1973. — С. 55-57.
7. Р. В. Тюрин. Криоконсервирование костного мозга под защитой 3 % раствора диметила-цетамида. Автореф: дис. канд. мед. наук. — СПб., 1996. — 25 с.
