CC BY
42
Костяев А. А.1, Утёмов С. В.1, Андреев А. А.1, Полежаева Т. В.2, Мартусевич А. К.3, Исаева Н. В.1, Шерстнев Ф. С.1, Ветошкин К. А.1, Калинина Е. Н.1, Князев М. Г.1
1 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства» (ФГБУН КНИИГиПК ФМБА России, г. Киров
2 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии Коми научного центра Уральского отделения Российской академии наук, г. Сыктывкар
3 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Кировская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Киров
ЧЕТЫРЕХКЛАССНАЯ СИСТЕМАТИЗАЦИЯ БИОКРИОКОНСЕРВАНТОВ.
III класс хладоограждающих растворов — криоконсерванты смешанного действия
Kostyaev A. A.1, Utyomov S. V.1, Andreev A. A.1, Polezhaeva T. V.2, Martusevich A. K.3, Isaeva N. V.1, Sherstnyov P. S.1, Vetoshkin K. A.1, Kalinina E. N.1, Knyazev M. G.1
1 Federal State Budget institution of Science «Kirov Research Institute of Hematology and Blood Transfusion of the Federal Medical and Biological Agency», Kirov
2 Federal State Budgetary Institute of Physiology of the Komi Scientific Centre of the Ural Branch of the Russian Academy of Sciences, Syktyvkar
3 Federal State Budgetary Institution of Higher Professional Education «Kirov State Medical Academy» ofthe Ministry of Healthcare of the Russian Federation, Kirov
A FOUR CLASS SYSTEMATIZATION OF BIOCRYOCONSERVANTS. The III class of cold preserving solutions — cryoprotectants of mixed action
Резюме. Рассмотрен III класс хладоогра-жающих растворов — криоконсерванты смешанного действия, которые проявляют протекторные свойства снаружи и изнутри клеток одновременно. Рецептура растворов базируется на моно- (одном) или би- (двух) кри-опротекторах смешанного действия. Охарактеризованы некоторые физико-химические, биологические, токсико-фармакологические и хладозащитные свойства криоконсерван-тов смешанного действия, используемых при замораживании эритроцитов, гемопоэтиче-ских стволовых клеток (ГСК), тромбо- и лей-коконцентратов (КТ, КЛ).
Ключевые слова: криопротекторы, крио-консерванты смешанного действия.
Summary. The III class of cold preserving solutions — cryoconservants of mixed action that exhibit protective properties inside and outside cells are examined. The formulation of solutions is based on mono- (single) or bi- (two) cryopro-tectors of mixed action. We characterize some of the physico-chemical, biological, toxicological and pharmacological properties, and cold preserving properties of cryoconservants of mixed action which are used in freezing of red blood cells, hematopoietic stem cells (HSCs), platelet and leucoconsentrators (CT, CL).
Key words: cryoprotectants, biokrioconser-vants mixed action.
Введение. Важными факторами, обеспечивающими защиту клеток крови и костного мозга от повреждений на этапах замораживания-отогревания, являются состав и свойства криозащитной среды, к основным компонентам которой относятся крио-протекторы. Наряду с положительными защитными функциями криопротекторы проявляют разнообразные побочные действия на клеточном и организменном уровне,
что негативно отражается на результатах трансфузионной терапии с использованием защитных агентов у пациентов с заболеваниями системы крови [1-5]. Поэтому до настоящего времени одной из задач при совершенствовании методов криоконсер-вирования различных трансфузионных сред является поиск новых эффективных криопротекторов и криоконсервантов на их основе.
Целью настоящей работы явилось изучение особенностей криопротекторов и крио-консервантов смешанного действия, а также перспективность их использования для крио-консервирования компонентов крови и костного мозга, применяемых с лечебной целью.
Материалы и методы. В настоящей работе приведены данные о некоторых физико-химических, биологических, токсико-фарма-кологических и хладозащитных свойствах криоконсервантов смешанного действия, используемых при замораживании эритроцитов, гемопоэтических стволовых клеток (ГСК), тромбо- и лейкоконцентратов (КТ, КЛ).
III класс криоконсервантов смешанного хладоограждающего действия образуют органические вещества, которые проявляют на замораживаемые суспензии эффекты проникающих и непроникающих в клетки криопротекторов. Такие свойства впервые были выявлены С. Glauser и T. Talbot у образцов полимеров окиси этилена с м. м. от 400 до 8 000, положительно проявивших себя при замораживании эритроцитов [6]. В дальнейшем полимерные соединения на основе окиси этилена получили название полиэти-леноксиды (ПЭО). На рубеже ХХ и XXI столетий д. м.н. проф. Е. П. Сведенцов (ФГБУН КНИ-ИГиПК ФМБА России) совместно с учеными гг. Казани и Кирово-Чепецка синтезировали гексаметиленбистетрагидроксиэтилмоче-вину (ГМБТОЭМ) — вещество, обладающее свойствами криопротектора смешанного действия на клетки [1].
Хладоограждающие растворы III класса содержат по одному (моно-) или два (би-) крио-консерванта смешанного действия.
Монокриоконсерванты смешанного действия. К настоящему времени из числа монокриозащитных веществ 3 класса наибольшую известность получили полиэ-тиленоксид-400 (ПЭО-400), полиэтиленок-сид-1500 (ПЭ0-150) и ГМБТОЭМ.
Общие сведения о ПЭО. Химическая формула: НОСН2-(СН2-СН2-О-)п-СН2-ОН. В молекуле ПЭО представлены два типа реакционных групп: оксиэтильные (-СН2-СН2-О-) и гидрок-сильные (-ОН) [2]. Олигомеры ПЭО с м. м. от 300 до 6 000 используются как лечебные препараты. ПЭО-400 и ПЭО-1500 нашли применение в качестве протекторов клеток костного мозга, крови и других биологических объектов [2, 4, 5].
Монокриоконсерванты смешанного действия на основе ПЭО-400 для замораживания эритроцитов, лейкоцитов и ядросо-держащих клеток костного мозга (ЯСККМ).
Состав криоконсерванта: ПЭО-400, 15 %; №С1, 1 %; вода для инъекций — до 100 мл. рН раствора доводят трис-буфером до 7,0-7,2. Криозащитная эффективность данного мо-нокриоконсерванта обнаружена для эритроцитов, лейкоцитов, клеток костного мозга мышей и клеток донорского костного мозга человека (сохранность клеток достигает 9092%). Время эквилибрации в криоконсер-ванте достигает порядка 15-30 мин. Замораживали по двухэтапной программе до -196оС. Размораживали в водяной ванне при +42оС. Отмывание ПЭО-400 не требовалось из-за отсутствия токсичности у 15-20% растворов вещества [3].
М. И. Шраго и соавт. [6] установили, что механизм криозащитного действия ПЭО зависит от молекулярной массы полимера: ПЭО с м. м. до 400 обладают эндоцеллюлярным действием, а пробы высокомолекулярных ПЭО — свойствами экзоцеллюлярных крио-протекторов. Это позволило в дальнейшем Н. С. Пушкарю и соавт. [3] ввести ПЭ0-400 в группу хладоограждающих соединений, обладающих смешанным (эндо- и экзоцел-люлярным) действием. М. М. Брук и соавт. [7], Л.А. Гайсенюк [8] выяснили, что ПЭО при парентеральном введении является малотоксичным веществом, а при однократном в/в введении животным в дозе 5 мл/кг не приводит в их организме к каким-либо изменениям токсического характера. Существует возможность негативного влияния ПЭО на плазматические мембраны при температурах +18 °С и выше во время удаления его из деконсер-вированных клеток. Если контакт клеток с криопротектором проводится в условиях гипотермии (0^+4 °С), негативного действия ПЭО-400 на форменные элементы крови не наблюдается. Выяснено, что 20-40 % растворы ПЭО-1000 ПЭО-4000 обеспечивают сохранность 80-98 % клеток. Однако эритроциты, восстановленные после размораживания, все же имеют различные повреждения [8]. Показатели ЛД50 для ПЭО-400 не установлены.
Криозащитный эффект ПЭО заключается в его способности стабилизировать молекулы воды. Он может способствовать сохранению структуры биополимеров мембран в процес-
се замораживания — отогревания, изменять характер кристаллизации водного раствора с образованием аморфного льда.
Монокриоконсервант смешанного действия на основе ГМБТОЭМ для замораживания ЯККМ.
Химическая формула ГМБТОЭМ — (НОСН2СН2)2NСОNН(СН2)6. Синтез ГМБТОЭМ впервые осуществил в 1974 г. В. П. Архиреев с соавт. (А.с. №419617) [1]. Криопротектор-ные свойства ГМБТОЭМ (рабочее название А-378), имеющего м.м. 378, открыл Е.П.Све-денцов (патент РФ № 3016824 [2]. Установлена ЛД50, равная 15,5 ± 0,6 г/кг массы белой лабораторной мыши, что значительно ниже, чем у других известных криопротекторов. На базе ГМБТОЭМ разработан криоконсер-вант смешанного действия.
Состав монокриоконсерванта: ГМБТОЭМ, 40 г; лимонная кислота, 1 г; динатриевая соль ЭДТА, 0,1 г; бидистиллированная вода — 100 мл. Стерилизуют автоклавированием 30 мин при 120 оС и 1,2 атм. рН криозащитного раствора 7,0-7,4.
Монокриоконсервант смешивают с концентратом ЯККМ 1:1. Экспозиция при +4оС составляет 20 мин. Суспензию замораживают по 3-хэтапной программе: на первом этапе со скоростью 1оС/мин до -8оС, на втором — 10оС/мин до -40 оС, на третьем — 20оС/мин до -140 оС и затем переносят в хранилище с жидким азотом. Число сохранившихся ЯККМ составляет 91,5 ± 1,8 %, из которых эозиноре-зистентых—80,3 ±4,4%. При в/в введении вещество не требует отмывания от размороженной клеточной суспензии.
Дальнейшие исследования свойств крио-консерванта на основе ГМБТОЭМ были продолжены учениками Е. П. Сведенцова [1]. Так, в лаборатории консервирования крови и тканей ФГБУН КНИИГиПК ФМБА России и лаборатории криофизиологии крови Коми научного центра Уральского отделения Российской академии наук (Коми НЦ УрО РАН) были синтезированы криоконсерванты «Гекмолит», «Кримолит», «Кримолит-М», «Кримолит-Ф» и другие, в которых хладоограждающим веществом представлен самый малотоксичный из известных хладозащитных веществ крио-протектор ГМБТОЭМ, ЛД50 которого составляет 15,5 ± 0,6 г/кг мыши [1].
Монокриоконсервант смешанного действия «Кримолит» на основе ГМБТОЭМ для замораживания тромбоцитов при -196 оС.
Название криоконсерванта «Кримолит» утверждено приказом Минздрава № 1509 [9]. Согласно Патенту России № 1561227, в состав раствора включены: ГМБТОЭМ, 10 %; лимонная кислота, 1,1 %; динатриевая соль ЭДТА, 0,1 %; вода для инъекций до 100 мл. рН раствора 4,5-5,5. Стерилизуют автоклавированием при 120 °С и 1,2 атм 30 мин. Срок хранения при +4°С составляет 2 года. Смешивают с тромбоцитным концентратом (ТК) 1: 1. Замораживают по линейной программе до -196 °С. После размораживания в водяной ванне при +36 — +38 °С в течение 10 сек сохраняется 85-95 % кровяных пластинок, у 47,2-95 % сохраняется функциональная полноценность. Клинические испытания проведены с положительными результатами в ФГБУН КНИИГиПК ФМБА России, ФГБУ Рос-НИИГТ ФМБА России и ВМА им.С.М. Кирова.
Монокриоконсервант смешанного действия «Кримолит-М» на основе ГМБТО-ЭМ для замораживания тромбоцитов при -80 °С.
Раствор «Кримолит-М» включает:
ГМБТОЭМ безводная х. ч., 10 г; лимонная кислота, безводная х.ч., 1,1 %; динатриевая соль ЭДТА, 0,1 %; вода для инъекций до 100 мл, рН раствора 4,5-5,5. Стерилизуют автоклавированием при 120 °С и 1,2 атм 30 мин. Срок хранения при +4 °С составляет 2 года. Смешивают с ТК 1: 1. Замораживают до -80 °С по линейной или экспоненциальной программе в двух электроморозильниках последовательно на -30 °С и -80 °С. После размораживания в водяной ванне при +38 °С в течение 44-60 сек до +2 — +4 °С сохраняется 83-94 % кровяных пластинок, у 48,2-93 % сохраняется функциональная полноценность.
Усовершенствованный криоконсервант «Кримолит-Ф» на основе ГМБТОЭМ и фу-марата натрия для замораживания тромбоцитов при -40 °С.
Для повышения эффективности криокон-серванта за счет быстрого восстановления энергетических процессов в тромбоцитах, снижения токсичности в раствор были введены антигипоксант фумарат натрия и антикоагулянт лимонная кислота. В итоге состав раствора «Кримолит-Ф» стал следующим: ГМБТОЭМ, 10%; фумарат натрия, 1,9%; лимонная кислота, 1,0 %; вода для инъекций до 100 мл, рН раствора 5,5-6,5. Стерилизуют автоклавированием при 1,2 атм 30 мин. ТК смешивают с «Кримолит-Ф» 1:1 в пластикат-
ном контейнере «Компопласт 300». Эквили-брация при комнатной температуре не превышает 20 мин, после чего клетки погружают в спиртовую ванну, охлажденную до -28 °С на 15 мин, а затем в камеру электроморозильника на срок до 4 мес при температуре -40 °С. Метод обеспечивает сохранность 87,4% тромбоцитов. Переливание аутологичных размороженных ТК подопытным животным не вызывало у них каких-либо посттрансфу-зионных реакций или осложнений.
Монокриоконсервант смешанного действия на основе ГМБТОЭМ для замораживания концентрата лейкоцитов при -80 °С.
Монокриоконсервант создан в ФГБУН Кировский НИИГиПК ФМБА России С. В. Утемо-вым [10]. Наилучшие результаты получены при использовании раствора следующего состава: ГМБТОЭМ, 30 %; лимонная кислота, 0,75 %; бидистиллированная вода до 100 мл, рН раствора 7,2. Стерилизуют автокла-вированием при 120 °С и 1,2 атм 30 мин. Срок хранения при +4°С составляет 2 года. Смешивают с КЛ 1: 1. Замораживают по экспоненциальной программе: первоначально выдерживают в течение 25 мин при температуре адаптации -28 ± 2 °С, затем переносят в электроморозильник на -80 °С на хранение до 12 мес. Разработанный криоконсервант обеспечивает высокую морфологическую (87,3 ± 3,3 %) и выраженную функциональную (52,5 ± 10,2 %) сохранность лейкоцитов, которые не требовали отмывания от ГМБТО-ЭМ.
В результате проведенных биологических исследований установлено, что разработанный монокриоконсервант для лейкоцитов стабилен в процессе замораживания-отогревания и безвреден для реципиента.
Монокриоконсервант смешанного действия на основе ГМБТОЭМ и фумарата натрия при замораживании лейкоцитов при -40 °С.
Состав криоконсерванта: ГМБТОЭМ, 30 %; фумарат натрия, 2,8 %; лимонная кислота, 0,06 %; бидистиллированная вода-остальное, рН раствора 7,0-7,4.
Смешивают с ЛК 1: 1, выдерживают при комнатной температуре в «Компопласт 300» до 20 мин. Замораживают в 3 этапа: на первом этапе — со скоростью 7-8°С/мин до точки кристаллизации, на втором- 1-2 °С/мин до температуры -28 °С, на третьем — 3-4 °С/ мин до -40 °С. Лейкоциты хранят в электро-
морозильнике фирмы Derby (Дания) в течение 30 суток. Клеточную взвесь размораживают в водяной ванне при +38 °С в течение 45-60 сек при интенсивном покачивании биоконтейнера до температуры суспензии +2 — +4 °С. К данному времени сохраняется 87,3 % лейкоцитов, из которых 61,9 % имеют неповрежденную мембрану, 94,5 % нейтрофилов проявляют фагоцитарную активность и имеют высокий (в 3,5 раза выше исходного уровня) окислительно-восстановительный метаболизм.
Биологические исследования криоконсерванта не выявили морфологических и функциональных изменений у подопытных лабораторных животных и показали перспективность данного метода криоконсервирования лейкоцитов.
Монокриоконсервант смешанного действия на основе ГМБТОЭМ и сукцината 3-окси-6-метил-2-этиленпиридина (ГОИ-ПЭП) для замораживания лейкоцитов при -20 °С.
Впервые в криобиологической практике для биологических и медицинских лабораторий создан метод сохранения лейкоцитов в полноценном состоянии при -20 °С. Оптимальным определен следующий состав криоконсерванта: ГМБТОЭМ, 28 %; сукцинат ГО-МЭП, 0,15 %, вода для инъекций до 100 мл, рН раствора 7,0-7,4 [2].
Лейкоциты получали из крови доноров-добровольцев. В выделенные концентраты лейкоцитов (ЛК) вносили указанный монокриоконсервант в соотношении 1: 1, выдерживали при комнатной температуре в пластиковом контейнере «Компопласт 300» до 20 мин. Клеточную взвесь замораживали до -20 °С, после чего переносили в электроморозильник фирмы Derby (Дания) для хранения на протяжении до 90 суток. Клеточную взвесь размораживают в водяной ванне при +38 °С в течение 45-60 сек при интенсивном покачивании биоконтейнера до температуры суспензии +2 — +4°С. В размороженной суспензии сохраняется 88,5 % лейкоцитов, из которых 62,9 % имеют неповрежденную мембрану, 93,9% нейтрофилов проявляют фагоцитарную активность и окислительно-восстановительный метаболизм. Биологические исследования криоконсерванта не выявили морфологических и функциональных изменений у подопытных лабораторных животных и показали перспективность данного метода криоконсервирования лейкоцитов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Сведенцов Е. П. Криоконсерванты для живых клеток. — Сыктывкар, 2010. — 80 с.
2. Пушкарь Н. С., Белоус А. М. Введение в криобиологию. — Киев: «Наукова думка», 1975. — 343 с.
3. Пушкарь Н. С., Шраго М. И., Белоус А. М. и др. Криопротекторы. Киев: «Наукова думка», 1978. — 204 с.
4. Шраго М. И., Гучок, В. М., Калугина Ю. И., Калинина Л. А. О некоторых путях создания кри-опротекторов // Пробл.гематологии и трансфузиологии.— 1981. — Т. 26.— № 3.— С. 8-12.
5. Glauser C., Talbot T. R. Some studies on freezing and thawing of human erythrocytes. — Amer. J. Sci., 1956, 231, № 1005, p.75-82.
6. Шраго М. И., Тимченко В. Г., Бредихина Л. П. и др. Низкотемпературное консервирование эритроцитов с криоконсервантом полиэтиленоксидом // Механизмы криоповреждения и криозащиты биологических культур. — Киев: «Наукова думка», 1977. — С. 47-48.
7. Брук М. Н., Пушкарь Н. С., Шкурко В. К. К влиянию полиэтиленоксида на организм животных // Научные труды Харьковского мед. института, 1968. — Вып. 78. — С. 18-22.
8. ГайсенюкЛ.А. Изучение полиэтиленоксида-400 при низкотемпературном консервировании и трансплантации костного мозга в онкологической клинике: Автореф. дис. канд. мед. наук. — Харьков, 1972. — 17 с.
9. Приказ Минздрава СССР от 30.12.1983 № 1509 «О дальнейших мерах по совершенствованию порядка оформления разрешения к медицинскому применению и передачи для промышленного производства новых лекарственных средств». И. — 1983.
10. Утемов С. В. Низкотемпературное (-80°С) консервирование лейкоцитных концентратов (экспериментальное исследование): Автореф. дисс. канд. мед. наук. — СПб., 2005. — 23 с.
