CC BY
44
© СТРОЗЕНКО Л. А., ГОРДЕЕВ В. В., ЛОБАНОВ Ю. Ф., МОМОТ А. П., КОЛЕСНИКОВА М.А., СНИГИРЬ О.А. УДК 616-053.7-616-079.3
ЧАСТОТА НОСИТЕЛЬСТВА ПОЛИМОРФНЫХ ВАРИАНТОВ ГЕНОВ ФАКТОРОВ СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ У ПОДРОСТКОВ ГОРОДА БАРНАУЛА
Л. А. Строзенко1, В. В. Гордеев1, Ю. Ф. Лобанов1, А. П. Момот2, М. А. Колесникова3, О. А. Снигирь3 1ГБОУ ВПО Алтайский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения РФ, ректор - д. м. н., проф. И. П. Салдан; кафедра педиатрии № 2, зав. - д. м. н., проф. Ю. Ф. Лобанов; 2Алтайский филиал Федерального государственного бюджетного учреждения «Гематологический научный центр», Министерства здравоохранения РФ, директор - д. м. н., проф. А. П. Момот; 3КГБУЗ Алтайская краевая клиническая детская больница, гл. врач - к. м. н., К. В. Смирнов.
Цель исследования. Установить частоту носительства полиморфных аллельных вариантов генов факторов свертывания крови у подростков г. Барнаула.
Материалы и методы. Материалом послужили образцы ДНК 1306 подростков (580 мальчиков и 726 девочек) в возрасте 15-16 лет. В основе анализа лежал метод полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (Real-Time PCR) с использованием конкурирующих TagMan зондов.
Результаты. Установлено, что частоты минорных аллелей А 20210 гена FII и аллеля С1565 GРШа были выше у девочек. Заключение. Популяция подростков характеризуется высокой гетерозиготностью по полиморфным вариантам трех генов факторов свертывания крови: G(-455)A гена FGB, G226A гена FXIII и 4G(-675)5G гена PAI-1. Высоко информативным маркером генного разнообразия полиморфных вариантов генов факторов свертывания крови является ген ингибитора активатора плазминогена (PAI-1).
Ключевые слова: однонуклеотидные полиморфизмы, генетика, факторы свертывания, подростки, гетерозиготность, генное разнообразие.
FREQUENCY OF CARRIAGE OF THE POLYMORPHIC GENE VARIANTS OF CLOTTING FACTORS IN ADOLESCENTS IN BARNAUL
L. A. Strozenko1, V. V. Gordeev1, Y. F. Lobanov1, A. P. Momot2, M. A. Kolesnikova3, O. A. Snigir3 'GBOU Altai State Medical University Ministry of Health; 2Altaysky branch of the Federal State Organization Research Center for Hematology, the Ministry of Health; 3KGBUZ Altai Regional Clinical Children's Hospital.
The aim of the research. To set the carrier frequency of polymorphic alleles variants at genes of clotting factors in adolescents in Barnaul.
Materials and methods. Material was the DNA samples of 1306 adolescents (580 boys and 726 girls) aged 15-16 years old. The analysis was based on the polymerase chain reaction in real time (Real-Time PCR) using competing TagMan probes. Results. It was found that the frequency of the minor allele A 20210 of the gene FII and allele C1565 GRIIIa were higher in girls. Conclusion. The population of adolescents is characterized by high heterozygosity on polymorphic variants of three genes of clotting factors: G (-455) A gene FGB, G226A gene FXIII and 4G (-675) 5G PAI-1 gene. The highly informative marker of gene diversity of polymorphic gene variants of clotting factors is a gene of inhibitor plasminogen activator (PAI-1). Key words: one nucleotide polymorphisms, genetics, clotting factors, adolescents, heterozygosity, genetic diversity.
Введение
Одной из главных задач предиктивной медицины является изучение молекулярно-генетических основ многофакторных заболеваний. Важное место среди многофакторных нозологий человека занимают тромбоз-ассоциированные заболевания, в развитии которых существенную роль играет наследственная предрасположенность, обусловленная мутациями и полиморфными вариантами генов системы гемостаза [6]. Генотипирование позволяет решать вопросы ранней диагностики, своевременного назначения адекватной терапии, дает возможность разработки более эффективных схем первичной профилактики. Важно выявить
предрасположенность к заболеванию в детском возрасте, когда существует вероятность проведения первичной профилактики, и установление факторов, способствующих реализации генетических программ [2,4]. Генетические факторы риска тромбозов изучены недостаточно, сведения о генетической предрасположенности к ним противоречивы [5].
В литературе имеется мало данных, описывающих роль наследственных факторов риска в развитии тромбозов у детей. Однако проблема ранних тромботических эпизодов стала встречаться в детском и подростковом возрасте достаточно часто [6,7]. В то же время, достоверные сведения о носительстве протромботических полиморфных вариантов
генов в различных регионах России крайне малочисленны. Подобные исследования в Алтайском крае не проводились.
Работа выполнена в рамках Протокола ведения Всероссийского регистра «Генетические факторы риска тромбоза у жителей, проживающих на территории РФ, клиническое фенотипирование и тромбопрофилактика тромбоэмболических осложнений в онтогенезе». Научно-исследовательский проект был утвержден 29.10.2010-го (протокол № 12) и соответствовал этическим стандартам Локального биоэтического комитета при Алтайском государственном медицинском университете [3]. Все лица подписали информированное согласие на участие в исследовании.
Цель исследования: установить частоту но-сительства полиморфных аллельных вариантов генов факторов свертывания крови у подростков г. Барнаула.
Материалы и методы В качестве материала для проведения молеку-лярно-генетического исследования на носитель-ство полиморфных вариантов генов факторов свертывания крови и генов фолатного метаболизма использованы образцы ДНК 1306 подростков (580 мальчиков и 726 девочек) в возрасте 15-16 лет, отобранных методом случайной выборки.
Определение аллельных вариантов генов осуществлялась в группе фармакогеномики Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (г. Новосибирск). В основе анализа лежал метод полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (Real-Time PCR) с использованием конкурирующих TagMan зондов. Проведено генетическое исследование семи протромботических полиморфных маркеров генов-кандидатов: фактора II протромбина (G20210A); фактора VЛейден (Arg506Gln); фактора VII свертывания крови (Arg353Gln); фактора XIIIсвертывания крови (Val134Leu); фибриногена G(-455)A; тромбоцитарного рецептора фибриногена - ITGB3-b интегрин (П565С) GPIIIa; ингибитора активатора плазминогена PAI-1 4G(-675)5.
Статистическая обработка результатов исследования проводилась с помощью пакета программ Statist^ v. 6.1. Попарное сравнение частот аллелей и генотипических групп в разных популяциях проводили посредством точного критерия Фишера (ТКФ) и критерия х2
Соответствие распределения генотипических частот равновесию Харди-Вайнберга проверяли посредством критерия х2, используя при этом онлайн калькулятор.
Состояние генного разнообразия оценивали вычислением: индекса относительного отклонения (D) наблюдаемой гетерозиготности от ожидаемой и показателя информационного содержания полиморфизма (PIC). Различие сравниваемых величин считали статистически значимыми при p<0,05.
Таблица 1
Характеристика исследованных генов и число обследованных подростков с учетом половых различий
Ген Белковый продукт Полиморфизм/ мутация Мальчики (абс. ч.) Девочки (абс. ч.) Всего (абс. ч.)
Гены факторов свертывания крови
FII Коагуляционный фактор 2/ протромбин G20210A 580 726 1306
FV Коагуляционный фактор 5 A506G 580 726 1306
F VII Коагуляционный фактор 7 G10976A 103 177 280
F XIII Фибриназа G9T 149 281 430
FGB Р-фибриноген G(-455)A 89 150 239
PAI-1 Ингибитор активатора плазминогена 1-го типа 4G(- 675)5G 580 726 1306
ITGB3-b Гликопротеин 3а ^РШа) Т1565С 121 326 447
Таблица 2
Распределение частот аллелей генов факторов свертывания крови в популяции подростков г. Барнаула
Локус Аллели Мальчики (%) Девочки (%) Всего (%) Х2 / Р
FII G20210.4 G A 1151 (99,2) 9 (0,79) 1426 (98,2) 26 (1,8) 2577 (98,7) 35 (1,3) 4,285 0,038
FV G1691A G A 1141 (98,4) 19 (1,64) 1429 (98,4) 23 (1,6) 2570 (98,4) 42 (1,6) 0,002 0,962
FVII G10976A G A 178 (86,4) 28 (13,6) 323 (91,2) 31 (8,8) 501 (89,5) 59 (10,5) 2,737 0,098
FXIII G226A G A 229 (76,8) 69 (23,2) 427 (76,0) 135 (24,0) 656 (76,3) 204 (23,7) 0,040 0,841
FGB G(-455)A G A 140 (78,6) 38 (21,4) 233 (77,7) 67 (22,3) 373 (78,0) 105 (22,0) 0,019 0,891
GPIIIa T1565C Т С 225 (93,0) 17 (7,0) 569 (87,3) 83 (12,7) 794 (88,8) 100 (11,2) 5,223 0,022
PAI-1 4G (-675)5G 5G 4G 489 (42,2) 671 (57,8) 651 (44,8) 801 (55,2) 1140 (43,6) 1472 (56,4) 1,775 0,183
Примечание: р -критерий%2 ;в скобках - %
Результаты и обсуждение
Исследованные гены-кандидаты предрасположенности к повышенному тромбообразованию и количество обследованных подростков с учетом половых различий представлены в табл. 1.
Из табл. 1 следует, что среди обследованных подростков было 580 (44,4%) мальчиков и 726 (55,6%) девочек.
В ходе исследования популяции подростков, рассчитаны частоты аллелей, изученных полиморфных вариантов генов системы свертывания крови (табл.2).
Результаты генотипирования выявили, что частота но-сительства минорного аллеля А 20210 гена FII (р = 0,038) и минорного аллеля С 1565 гена GPШа (р=0,022) в популяции девочек статистически значимо больше по сравнению с мальчиками. Носительство минорного аллеля 4G (-675) гена PAI-1 статистически значимо чаще определялось у мальчиков (р = 0,027), а носительство мажорного аллеля 56 (-675) гена (РЛ1-1 ) с большой частотой выявлялось у девочек (р = 0,044). По остальным частотам аллелей в исследованных полиморфных вариантах генов факторов свертывания статистически значимых различий не наблюдалось (р>0,05).
Таблица 3
Гендерные особенности распределения частот генотипов генов факторов свертывания крови у подростков г. Барнаула
Ген Генотип Мальчики (%) Девочки (%) Всего (%) P
FII 20210 GG 20210 GA 20210 AA 571 (98,4) 9 (1,6) 0 n=580 700 (96,4) 26 (3,6) 0 n=726 1271 (97,3) 35 (2,7) 0 n=1306 0,025 0,025
FV 1691 GG 1691 GA 1691 AA 561 (96,7) 19 (3,3) 0 n=580 703 (96,8) 23 (3,2) 0 n=726 1264 (96,8) 42 (3,2) 0 n=1306 1,00 1,00
FVII 10976 GG 10976 GA 10976 AA 78 (75,7) 22 (21,4) 3 (2,9) n=103 151 (85,3) 21 (11,4) 5 (2,8) n=177 229 (81,8) 43 (15,3) 8 (2,9) n=280 0,037 0,036 1,00
FXIII 226 GG 226 GA 226 AA 90 (60,4) 49 (32,9) 10 (6,7) n=149 164 (58,4) 99 (35,2) 18 (6,4) n=281 254 (59,1) 148 (34,4) 28 (6,5) n=430 0,681 0,597 1,00
FGB (-455) GG (-455) GA (-455) AA 55 (61,8) 30 (37,7) 4 (4,5) n=89 94 (62,7) 45 (30,0) 11 (7,3) n=150 149 (62,3) 75 (31,4) 15 (6,3) n=239 1,00 0,567 0,422
GPIIIA 1565 TT 1565 TC 1565 CC 104 (86,0) 17 (14,0) 0 n=121 248 (76,1) 73 (22,4) 5 (1,5) n=326 352 (78,7) 90 (20,2) 5(1,1) n=447 0,027 0,063 0,330
PAI-1 (-675) 5G/5G (-675) 4G/5G (-675) 4G/4G 115 (19,8) 259 (44,7) 206 (35,5) n=580 154 (21,2) 343 (47,3) 229 (31,5) n=726 269 (20,6) 602 (46,1) 435 (33,3) n=1306 0,582 0,372 0,140
Примечание: р - точный критерий Фишера (ТКФ); в скобках - %.
При анализе частоты носительства мутаций и аллельных вариантов протромботических генов с учетом половых различий определено (табл. 3), что гомозиготный генотип 20210 GG гена FII с большей частотой фиксировался у мальчиков-подростков (р = 0,025), гетерозиготный генотип имел место преимущественно у девочек (р=0,025). В то же время, у мальчиков отмечена большая частота гетерозиготного генотипа 10976 GA гена фактора VII (р =0,036). Полиморфизм G1691A гена FV Leiden, мутация G(-455)A гена FGB, полиморфизм 4G(-675)5G гена PAI-1 выявлялись с одинаковой частотой у мальчиков и девочек подросткового возраста (р>0,05). Гомозиготный генотип 10976 GG фактора VII статистически значимо чаще встречался у девочек (р =0,037), а у мальчиков отмечена большая частота носительства гетерозиготного генотипа 10976 GA гена фактора VII (р = 0,036).
Проверка распределения частоты носительства аллелей и генотипов изученных генов факторов свертывания крови показала соответствие каноническому равновесию Харди-Вайнберга пяти генотипов генов системы гемостаза (табл. 4).
Установлено, что наблюдаемое распределение генотипа G20210A гена FII, генотипа G1691A гена FV и других протромботических генов согласуется с ожидаемыми частотами распределения. Фактическое распределение генотипа 10976 GA гена FVII достоверно снижено по сравнению с теоретическим, а наблюдаемое распределение генотипа
10976AA гена FVII повышено. Фактическое распределение гетерозиготного (4G/5G) и гомозиготного (4G/4G) генотипов 4G(-675)5G гена PAI-1 статистически значимо выше по сравнению с теоретическим за счет избытка гетерозигот, коэффициент относительного отклонения (D) колебался от (-0,022) до (-0,384).
Выявленные отклонения по распределению генов факторов свертывания крови в популяции подростков, можно рассматривать как возникшие в силу стохастических (случайных) причин. Однако, достоверное отклонение распределения от ожидаемого может быть обусловлено смещением выборки по каким-либо показателям важным для реализации функциональной значимости данных полиморфных вариантов [1].
Исследование генного разнообразия в популяции подростков, выявило высокий уровень ожидаемой гетерозиготности по полиморфным вариантам генов факторов свертывания крови: G(-455)A гена FGB (0,343); G226A гена FXIII (0,362); 4G(-675)5G гена PAI-1 (0,492). Ге-терозиготность, обусловливает высокую жизнеспособность организмов, хорошую приспособляемость к изменяющимся условиям среды и имеет большое значение для экологической пластичности популяции.
Другой показатель генного разнообразия -PIC (информационное содержание полиморфизма) дает представление, насколько информативен выбранный маркер. Генетические маркеры генов факторов свертывающей системы крови оказались умеренно информативными: G(-455)A FGB (0,375); G226A FXIII (0,380). Высокую информативность показал генетический маркер 4G(-675)5G гена PAI-1 (0,488), что согласуется с очень высокой степенью теоретической гетерозиготности по этому гену (0,492). Остальные изученные нами генетические маркеры факторов свертывания крови оказались мало информативными, что согласовалось с низкой степенью ожидаемой гетерозиготности (от 0,027 до 0,199).
Заключение
Таким образом, выявлено, что частоты носительства минорных аллелей А 20210 гена FII и аллеля С 1565 GPIIIa были статистически значимо выше в популяции девочек. Напротив частота носительства аллеля 4G гена PAI-1 фиксировалась статистически значимо чаще у мальчиков. Установлено отклонение от равновесия Харди-Вайнберга в популяции подростков по частотам носительства генотипов A10976G гена FVII и 4G(-675) 5G гена PAI-1. Популяция подростков характеризуется высокой гетерозиготностью по полиморфным аллельным вариантам трех генов факторов свертывания крови: G(-455)A гена FGB, G226A гена FXIII и 4G(-675)5G гена PAI-1. Высоко информативным маркером генного разнообразия полиморфных аллельных вариантов генов факторов свертывания крови является ген ингибитора активатора плазминогена (Ho = 0,461; He = 0,492).
Таблица 4
Распределение генотипов и аллелей генов факторов свертывания крови в популяции подростков г. Барнаула
Локус Генотип N.O. % N.E. % X2 d.f.=1 Частота аллеля Ho±s.e. He±s.e. D
FII G20210A (n-1306) GG 97,3 97,3 0,241 p=0,624 G=0,987 A=0,013 Ho=0,027±0,004 He=0,027±0,004 0
GA 2,7 2,7
AA 0 0
FV G1691A (n-1306) GG 96,8 96,8 0,349 p=0,555 G=0,984 A=0,016 Ho=0,032±0,005 He=0,032±0,005 0
GA 3,2 3,2
AA 0 0
FVII G10976A (n-280) GG 81,8 80,1 9,620 p=0,002 G=0,895 A=0,105 Ho=0,154±0,021 He=0,188±0,023 -0,181
GA 15,4 18,8
AA 2,8 1,1
FXIII G226A (n=430) GG 59,1 58,2 1,028 p=0,311 G=0,762 A=0,237 Ho=0,344±0,021 He=0,362±0,021 -0,050
GA 34,4 36,2
AA 6,5 5,6
FGB G(-455)A (n-239) GG 62,2 60,9 1,712 p=0,191 G=0,780 A=0,220 Ho=0,314±0,030 He=0,343±0,031 -0,085
GA 31,4 34,3
AA 6,3 4,8
GPIIIa T1565C (n-447) TT 78,7 78,9 0,079 p=0,777 1=0,888 C=0,112 Ho=0,201±0,019 He=0,199±0,019 +0,010
TC 20,1 19,9
CC 1,1 1,2
PAI-1 4G (-675)5G (n-1306) 5G/5G 20,6 19,0 5,177 p=0,023 5G=0,436 4G=0,564 Ho=0,461±0,014 He=0,492±0,014 -0,063
4G/5G 46,1 42,2
4G/4G 33,3 31,8
Примечание: N.0. - наблюдаемые частоты генотипов; И.Б. - ожидаемые частоты генотипов; критерийх2 использован для оценки соответствия наблюдаемого распределения генотипов ожидаемому, исходя из равновесия Харди-Вайнберга; й!. - число степеней свободы; Ио±з.е. и Ие±з.е. - соответственно наблюдаемая и ожидаемая гетерозиготность с ошибкой; О - относительное отклонение наблюдаемой гетерозиготности от ожидаемой.
Литература
1. Косянкова Т. В., Пузырёв К. В. Полиморфизм генов синтаз оксида азота: исследование в сибирских популяциях и у больных с сердечно-сосудистой патологией // Бюллетень СО РАМН. - 2003. - № 1. - С. 6-11.
2. Момот А.П., Строзенко Л.А., Цывкина Л.П., Ройтман Е.В., Клименко О.В., Сердюк Г.В. Первичная тромбопро-филактика у детей Алтайского края на основе выявления и модификации постоянных и временных факторов тромбо-генного риска: методические рекомендации. - Барнаул: Изд-во АГМУ, 2013. - С. 83.
3. Момот А.П., Ройтман Е.В., Елыкомов В.А. Протокол ведения Всероссийского регистра «Генетические факторы риска тромбоза у жителей, проживающих на территории РФ, клиническое фенотипирование и тромбопрофилак-тика тромбоэмболических осложнений в онтогенезе» //Тромбоз, гемостаз и реология. - 2010а. - № 3. - С. 30-78.
4. Строзенко Л.А., Момот А.П., Лобанов Ю.Ф., Тара-ненко И.А., Сердюк Г.В. Факторы тромбогенного риска и состояние здоровья подростков г. Барнаула // Медицина и образование в Сибири. - 2012. - № 2. [Электронный ресурс]. - Режим доступа: http:// ngmu.ru./cozo/mos.
5. Kenet G., Lutkhoff L.K., Albisetti M., Bernard T., Brandao M., Chabrier S., Chan A., deVeber G., Fiedler B., Fullerton H.S., Goldenberg N.A. Impact of thrombophilia on risk of arterial ischemic stroke or cerebral sinonenosus thrombosis in neonates and children: a systematic review and meta-analysis of observational studies // Circulation. - 2010. -Vol. 121, № 16. - P. 1838-1847.
6. Nowak-Gottl U., Kurnik K., Krumpel A. Thrombophilia in the young // Haemostaseolo-gie. - 2008. - Vol. 28, № 1. - P. 16-20.
7. Young G., Albisetti M., Bonduel M. , Brandao L., Chan A., Friedrichs F., Neil A. Goldenberg N. A., Grabowski E., Heller C., Nowak-Göttl U. Impact of inherited thrombophilia on venous thromboembolism in children: a systematic review and meta-analysis of observational studies // Circulation. - 2008. -Vol. 118, № 13. - P. 1373-1382.
References
1. Kosyankova T.V., Puzyrev K.V. Polymorphism of genes of nitric oxide synthase: a study in the Siberian populations and in patients with cardiovascular disease // Bulletin SB RAMS. -2003. - № 1. - P. 6-11.
2. Momoth A.P., Strozenko L.A., Tsyvkina L.P., Roitman E.V., Klimenko O.V., Serdyuk G.V. Primary thromboprophylaxis in children of Altai Region on the basis of the identification and modification of permanent and temporary thrombogenic risk factors: guidelines. - Barnaul: Publishing house ASMU, 2013. - P. 83.
3. Momoth A.P., Roitman E.V., Elykomov V.A. Minutes conducting of All-Russian register "Genetic risk factors for thrombosis among residents living in the territory of the Russian Federation, the clinical phenotyping and thromboprophylaxis of
thromboembolic complications in ontogenesis" // Thrombosis, Hemostasis and Rheology. - 2010. - № 3. - P. 30-78.
4. Strozenko L.A., Momoth A.P. Lobanov Yu.F., Taranenko I.A., Serdyuk G.V. Thrombogenic risk factors and health status of adolescents in Barnaul // Health and Education in Siberia. - 2012. - № 2. [Electronic Resource]. - Mode of access: http: // ngmu.ru. / cozo / mos.
5. Kenet G., Lutkhoff L.K., Albisetti M., Bernard T., Brandao M., Chabrier S., Chan A., deVeber G., Fiedler B., Fullerton H.S., Goldenberg N.A. Impact of thrombophilia on risk of arterial ischemic stroke or cerebral sinonenosus thrombosis in neonates and children: a systematic review and meta-analysis of observational studies // Circulation. - 2010. - Vol. 121, № 16. - P. 1838-1847.
6. Nowak-Gottl U., Kurnik K., Krumpel A. Thrombophilia in the young // Haemostaseologie. - 2008. - Vol. 28, № 1. - P. 16-20.
7. Young G., Albisetti M., Bonduel M. , Brandao L., Chan A., Friedrichs F., Neil A. Goldenberg N. A., Grabowski E., Heller C., Nowak-Göttl U. Impact of inherited thrombophilia on venous thromboembolism in children: a systematic review and meta-analysis of observational studies // Circulation. -2008. - Vol.118, № 13. - P. 1373-1382.
