CC BY
284
Известия Тульского государственного университета Естественные науки. 2013. Вып. 2. Ч.1. С. 289-297
Химия :
УДК 602.4:628.35:664
БПК-биосенсор на основе дрожжей ПеЪатуатусев Наивеигг и медиатора
и и и ^
нейтральный красный
Н. Ю. Юдина, А. С. Зайцева, Т. Н. Козлова, В. А. Арляпов
Аннотация. Сформирован медиаторный сенсор на основе дрожжей БеЪагуотуеев Иапвепп для оценки биохимического потребления кислорода (БПК). Для создания биосенсора использовался растворимый медиатор — нейтральный красный. В работе выявлены рабочие параметры функционирования медиаторного биосенсора на основе микроорганизмов Бв-baryamyces НаиэвиИ, а также определены аналитические и метрологические характеристики данного сенсора. Диапазон определяемых концентраций БПК для биосенсора на основе медиатора нейтрального красного составляет 5,1-53 мг/дм3.
Ключевые слова: биосенсор, медиатор, биохимическое
потребление кислорода, БПК, дрожжи БвЬагуоту^ НатвиИ
Введение
Показателем качества воды, характеризующим суммарное содержание в воде органических веществ, является биохимическое потребление кислорода (БПК). Классический метод определения БПК требует 5-дневного инкубирования пробы воды, что неприемлемо в ряде случаев. Для быстрого и простого анализа разрабатываются методы оценки БПК, основанные на использовании биосенсорных анализаторов. Большее внимание уделяется созданию амперометрических биосенсоров на основе соединений, способных к переносу электронов от активных центров ферментов на электрод — медиаторов электронного транспорта [1].
Медиаторы способны взаимодействовать не только с выделенными ферментами, но и с ферментами в составе клеток дрожжей. Однако
* Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (проект № 13-05-97513), ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 годы», соглашение № 14.B37.21.1231, гранта Президента Российской Федерации для государственной поддержки молодых российских ученых — кандидатов наук, договор № 16.120.11.4341-МК.
трудность создания медиаторных биосенсоров на основе дрожжевых клеток заключается в том, что их ферментные системы локализованы внутри клетки (в цитоплазме), что затрудняет взаимодействие с медиаторами переноса электронов. В то же время, применение дрожжей в качестве биокатализаторов является более предпочтительным, чем применение бактериальных клеток, поскольку эукариоты более устойчивы к негативным факторам окружающей среды и могут функционировать длительное время [2]. Согласно литературным данным дрожжевой штамм ВеЪатуашусез Наивеигг способен окислять широкий спектр органических соединений и устойчив к высоким концентрациям солей, что позволяет применять его для оценки суммарного содержания биоразлагаемых органических веществ в пробе воды (БПК) [3, 4].
Целью данной работы является разработка и определение характеристик медиаторного биосенсора на основе дрожжей БеЪатуашусев Наивеигг для экспресс-определения БПК.
Материалы и методы
Биосенсорные измерения. Исследования проводились с помощью гальванопотенциостата «1РС-ш1сго» (ЗАО «Вольта», Россия), интегрированного с персональным компьютером, что позволяло производить непрерывную регистрацию сигнала. В качестве медиаторов были использованы: дихлорфенолиндофенол (ДХФИФ), тионин, нейтральный красный, гексацианоферрат калия и метиленовый синий. Для регистрации ответов сенсора использовали двухэлектродную систему. В качестве рабочего электрода использовали угольно-пастовый электрод с иммобилизованными микроорганизмами. Электродом сравнения служил насыщенный хлоридсеребряный электрод (Ag/AgCl), относительно которого задавались значения потенциалов. Измеряемым параметром сигнала сенсора явилась амплитуда изменения силы тока (мкА), определяемая как разность между конечным и начальным значениями токов до и после введения субстрата в измерительную кювету.
Культивирование клеток микроорганизмов. Клетки штамма Бе-Ъатуашусев Наивеигг ВКМ У-2482 выращивали на богатой минеральной среде (жидкая глюкозо-пептонная питательная среда) согласно методике, описанной в [4].
Определение БПК5 стандартным методом разбавления. В
качестве референтного метода для определения БПК5 был использован метод разбавления. Анализ проводили в соответствии с методикой, указанной в ПНД Ф 14. 1:2:3:4. 123-97 [5]. Определение содержания растворенного кислорода в исследуемых пробах выполняли йодометрическим методом Винклера в соответствии со стандартной методикой.
Результаты и обсуждение
Создание медиаторного биосенсора на основе дрожжей Ов-Ьагуатусвв Напввпп. Согласно имеющимся данным дрожжи БеЪатуошусев Наивеигг способны окислять многие спирты, углеводы, аминокислоты и другие органические вещества, а также устойчивы к негативным факторам окружающей среды [3]. Известно также, что дрожжи Б. Наивеигг применялись для создания БПК-биосенсора на основе кислородного электрода [4]. Представленные особенности позволяют предположить, что эти микроорганизмы могут быть эффективно использованы для разработки БПК-биосенсора медиаторного типа. Преимуществом использования медиаторных сенсоров является то, что результаты измерений не зависят от парциального давления кислорода в среде, а также то, что они нечувствительны к изменениям рН среды.
Возможность применения растворимых медиаторов в системе с дрожжевыми клетками БеЪатуашусев Наивеигг изучали методом вольтамперометрии. Циклические вольтамперограммы регистрировали при скорости наложения потенциала 50 мВ/с. Вольтамперограммы, соответствующие медиатору, использовали для расчетов рабочего потенциала. Для нейтрального красного рабочий потенциал составил — 330 мВ, для ДХФИФ — 416 мВ, для тионина — 830 мВ, для гексацианноферрата калия — 288 мВ. Затем поверхность электрода изменяли нанесением суспензии клеток. О взаимодействии медиатора с дрожжевыми клетками судили по изменению вольтамперограммы при внесении субстрата. Отклики биосенсора на добавления субстрата были получены только при использовании медиатора нейтрального красного. Этот медиатор был использован в дальнейшей работе для формирования БПК-биосенсора.
Рабочие параметры медиаторного биосенсора на основе дрожжей О. Напввпгг. При разработке биосенсоров важным этапом является определение рабочих параметров. Величина тока, генерируемого биосенсором в присутствии определяемого вещества, может изменяться в зависимости от концентрации медиатора, при которой проводятся измерения. Высокая концентрация медиатора увеличивает ток, генерируемый биосенсором, но в то, же время, может оказывать токсическое действие на клетки. Очевидно, что для создания эффективного медиаторного биосенсора на основе целых клеток дрожжей Б. Наивеигг необходимо подобрать рабочие условия, при которых генерируемый сенсором ток будет максимальным.
Проведено определение рабочей концентрации медиатора нейтрального красного. Измерения проводили при постоянной массе дрожжей в биорецепторном элементе — 1 мг. Зависимость ответа сенсора от
концентрации медиатора имеет пикообразный вид, наибольший ответ сенсора достигается при концентрации нейтрального красного в кювете 0,244 ммоль/л (100 мкл 0,1 М раствора нейтрального красного на 4
мл буферного раствора). При дальнейшем увеличении концентрации медиатора происходит снижение ответов сенсора, что может быть объяснено возможным токсическим действием данного медиатора на клетки при высоких концентрациях.
Таким образом, при создании биосенсора на основе дрожжей Бе-Ьатуотусев Напвепп и растворимого медиатора нейтрального красного выбранная концентрация медиатора в кювете составила 0,244 ммоль/л.
Выбор рабочей массы дрожжей БеЬатуотусев Напвепп является важной задачей, т.к. содержание биоматериала влияет на чувствительность сенсора. Для определения рабочей массы клеток в биорецепторном элементе изготовлено 6 электродов с массой дрожжей от 0,4 до 2 мг (концентрация медиатора нейтрального красного постоянна и составляет 0,244 ммоль/л).
Наибольшие ответы сенсора зафиксированы при иммобилизации на электрод от 1 до 1,33 мг биомассы дрожжей БеЬатуотусев Напвепп (рис. 1). Но наибольшая сходимость ответов сенсора наблюдается при иммобилизации 1 мг биомассы.
0,025 < 0,02 *
5
£ 0,015 о
0
1 0,01
6 со
5 0,005
о
0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50
Масса клеток, мг
Рис. 1. Зависимость ответа сенсора от массы клеток ВеЬатуотусев
Напвепп
Для дальнейшей работы целесообразно использовать электроды с массой дрожжей БеЬатуотусев Напвепп 1 мг.
Аналитические и метрологические характеристики медиаторно-го биосенсора на основе дрожжей О. Напвепп. При мониторинге окружающей среды, для измерения величины БПК используют рецепторные элементы с широкой субстратной специфичностью, так как это приводит к повышению правильности результатов анализа.
В работе проведена оценка субстратной специфичности дрожжей БеЬатуатусев Напвепп в условиях электрокаталитического окисления субстратов в присутствии медиатора нейтрального красного по 24 субстратам, относящимся к разным классам органических соединений (рис. 2). В качестве субстратов были выбраны органические вещества, наиболее часто встречающиеся в бытовых стоках и стоках пищевых производств.
Рис. 2. Субстратная специфичность дрожжей БеЬатуатусез Напвепіі в медиаторной системе и системе на основе кислородного электрода
Наибольший ответ сенсора на основе дрожжей БеЬатуатусев Напвепіі в присутствии медиатора нейтрального красного, получен на галактозу, ответ на нее был принят за 100 %. Для сенсора на основе кислородного электрода наибольший ответ был получен на этанол [3]. Изменение портера субстратной специфичности может быть связано с разной доступностью ферментных систем дрожжей.
В медиаторной системе величины откликов на спирты варьируются от 5 до 85 % и увеличиваются по мере увеличения углеводородного радикала, но при переходе от первичных спиртов к вторичным и третичным ответ сенсора снижается. Такая картина субстратной специфичности согласуется с данными описанными в литературе для вида дрожжей БеЬатуатусев Напвепіі [2]. В целом отклики, полученные на спирты в медиаторной системе меньше, чем отклики, полученные в системе с кислородным электродом. Вероятно, взаимодействие медиатора нейтрального красного с ферментативными системами окисления спиртов дрожжей БеЬатуатусев Напвепіі затруднено.
Величины откликов на углеводы уменьшаются при переходе от альдоз (глюкоза) к кетозам (фруктоза). Окисление дисахаридов не наблюдалось (сахароза) или проходило менее интенсивно (лактоза), чем моносахаридов.
Ценным с практической точки зрения является факт наличия ответов на додецилсульфат (ДДС) натрия (компонент моющих средств), а также отсутствие токсического действия данного субстрата при кратковременном воздействии на клетки БеЬатуатусев Напвепіі в составе биорецептора.
Таким образом, клетки БеЬатуатусев Напвепіі, в условиях электроката-литического окисления субстратов в присутствии медиатора нейтрального красного, способны окислять широкий круг субстратов, которые могут быть обнаружены в сточных водах, что является перспективными с точки зрения возможности их использования для оценки БПК.
Для определения операционной стабильности было проведено 15 последовательных измерений ответа сенсора (амплитуда силы тока) на
вводимый объем раствора глюкозо-глутаматной смеси (ГГС). Использование ГГС в качестве стандарта для определения БПК рекомендовано ПНДФ [5].
Ответ сенсора на основе штамма ОеЬатуатусев катеті оставался стабильным на протяжение всех 15 измерений, относительное стандартное отклонение не превышает 2 % (рис. 3.).
Долговременная стабильность характеризует устойчивость работы сенсора в течение длительного периода времени. За время стабильной работы рецепторного элемента принимается время, в течение которого величина сигнала составляла не менее 50 % от первоначальной активности. Долговременную стабильность определяли путём ежедневного измерения величины ответа сенсора на одну и ту же концентрацию раствора глюкозо-глутаматной смеси. Между измерениями сенсор хранился в буферном растворе при комнатной температуре.
В первые пять дней после формирования биорецепторного элемента наблюдается увеличение дыхательной активности дрожжей БеЬагуатусев катеті в условиях электрокаталитического окисления ГГС в присутствии медиатора нейтрального красного. На седьмые сутки происходит снижение активности клеток и достигает 50 % величины от первоначальной на 16 день. Невысокая долговременная стабильность сенсора может быть объяснена возможным токсическим действием медиатора нейтрального красного на дрожжи В. катеті.
Для измерения БПК в реальных образцах используют раствор 3 г/дм3 глюкозо-глутаматной смеси (ГГС). Концентрация ГГС с показателем БПК связана следующим выражением:
БПК = 0, 68 • С(ГГС).
По полученным экспериментальным данным были построены градуировочные зависимости отклика биосенсора от концентрации ГГС в измерительной кювете.
0 50 100 150 200
БПК, мг/дм^
Рис. 3. Зависимость ответа сенсора от БПК на основе медиатора нейтрального красного
Зависимость ответа сенсора от БПК имеет гиперболический вид, для снижения ошибок анализа часто ограничиваются использованием линейного участка градуировочной кривой. Параметры калибровочных зависимостей представлены в табл. 1. Численное значение верхней границы определяемых концентраций равно константе Михаэлиса, Км.
Таблица 1
Основные коэффициенты для калибровочной зависимости ответа биосенсора от БПК
Параметры Значения
Эффективная константа Михаэлиса КМ, мг/дм3 53± 5
Максимальная скорость потребления кислорода Ктах, мкА 0,062 ± 0,002
Коэффициент чувствительности, мкАдм3/мг 0,0004 ± 0,0001
Снизу линейный участок ограничен нижней границей определяемых концентраций. Данная характеристика определяется расчетным методом и для сенсора на основе медиатора нейтрального красного она составила 5,1 мг/дм3. Такое значение нижней границы определяемых концентраций БПК не позволяет анализировать пробы с низким содержанием кислорода, например, делать анализ водопроводной воды или сточных вод, прошедших через очистных сооружения, где значение БПК колеблется в пределах 0,5—1,9 мг/дм3. Однако возможно экспресс-определение БПК загрязненных водоемов, а также полупродуктов брожения, где значение БПК больше 5 мг/дм3.
Анализ образцов воды и полупродуктов брожения. Проведен сравнительный анализ образцов речной, болотной, технологической воды и полупродуктов брожения с использованием разработанного макета БПК-биосенсора и стандартным методом разбавления. Определение БПК5 образцов воды стандартным методом разбавления проводилось согласно действующим в РФ нормативным документам [5]. Содержание растворенного кислорода до и после пятидневной инкубации определялось с помощью анализатора жидкости «Эксперт - 001». Результаты измерения БПК анализируемых образцов с использованием медиаторного биосенсора на основе дрожжей ВвЬагуатусвз Ьапзвпгг представлены в табл. 2.
Значения БПК, определенные с помощью биосенсора на основе дрожжевого штамма ВвЬагуатусвз Ьапзвпгг показывают хорошую корреляцию со стандартной методикой (К = 0,9977). Статистическая обработка полученных данных показывает, что результаты анализа стандартным методом разбавления и методом с использованием биосенсора незначимо различаются между собой.
Разработанный медиаторный биосенсор на основе дрожжей ВвЬагуатусвз Ьапзвпгг можно использовать для анализа образцов воды и полупродуктов брожения.
Таблица 2
Значения БПК анализируемых образцов
Анализируемые образцы полупродуктов брожения, болотной, талой и речной воды БПК, измеренное с помощью биосенсора, мг/дм3 БПК5, измеренное стандартным методом, мг/дм3
ЗАО «Индустрия сервис» Талые воды 10,5±0,6 11±2
ЗАО «Водоканал» 66±3 60±10
Болотная вода г. Белев 18±1 22±6
Болотная вода пос. Озерный 20±1 18±3
Вода из р. Упа 7,0±0,5 7,6±0,8
Образец №1 15800±400 16000±1000
Образец №2 20800±400 20000±1000
Образец №3 31100±800 32000±2000
Образец №4 26900±800 30000±2000
Выводы
В работе оценены рабочие параметры функционирования медиаторного биосенсора на основе микроорганизмов Debaryamyces hansenii: концентрация нейтрального красного в кювете 0,244 ммоль/дм3, масса клеток на электроде 1 мг. Определены аналитические и метрологические характеристики БПК-биосенсора: долговременная стабильность — 16 дней, Диапазон определяемых концентраций БПК — 5,1-53 мг/дм3. Проведено определение БПК воды и полупродуктов брожения, показано, что использование медиаторного биосенсора на основе дрожжевых клеток Debaryamyces hansenii для определения БПК позволяет получать данные с высокой корреляцией к стандартному методу.
Список литературы
1. Микробные биосенсоры для определения биологического потребления кислорода (обзор) / О.Н. Понаморева [и др.] // Прикладная биохимия и микробиология. 2011. Т. 47. № 1. С. 5-15.
2. Mechanisms underlying the halotolerant way of Debaryomyces hansenii / C. Prista [et al.] // FEMS Yeast Res 5lya. 2005. P. 693-701.
3. Biosensor analyzer for bod index express control on the basis of the yeast microorganisms Candida maltosa , Candida blankii , and Debaryomyces hansenii / V. Arlyapov [et al.] // Enzyme and Microbial Technology. 2012. Т. 50. № 4-5. С. 215-220.
4. BOD Biosensor Based on the Yeast Debaryomyces hansenii Immobilized in Poly(vinyl Alcohol) Modified by N-Vinylpyrrolidone / V.A. Arlyapov [et al.] // Enzyme and Microbial Technology. 2013. V. 53. P. 257-262
5. ПНДФ 14. 1:2:3:4. 123-97. Методика выполнения измерений биохимической
потребности в кислороде в пресных, подземных, питьевых, сточных и
очищенных сточных водах. М., 1997. 25 с.
Юдина Наталья Юрьевна ([email protected]), аспирант, кафедра химии, Тульский государственный университет.
Зайцева Анна Сергеевна, студент, кафедра химии, Тульский государственный университет.
Козлова Татьяна Николаевна, студент, кафедра биотехнологии, Тульский государственный университет.
Арляпов Вячеслав Алексеевич ([email protected]), к.х.н., доцент, кафедра химии, Тульский государственный университет.
BOD biosensor yeast-based Debaryamyces hansenii and mediator neutral red
N. Yu. Yudina, A. S. Zaitseva, T. N. Kozlova, V. A. Arlyapov
Abstract. The work formed mediator sensors based on yeast Debaryomyces hansenii to assess the biochemical oxygen demand (BOD). To create a biosensor used a soluble mediator — a neutral red. The paper identified the operating parameters of function mediator biosensor based on microorganisms Debaryamyces hansenii, and defined the analytical and metrological characteristics of the sensor data. Sensor based on Debaryamyces hansenii yeast has a high operational stability. The range of detectable concentrations of BOD biosensor for the mediator is neutral red Б,1-Б3 dm3. For the first time the possibility of using the system pick-Debaryamyces hansenii yeast to determine the biochemical oxygen demand.
Keywords: biosensor, the mediator, biochemical oxygen demand, BOD, yeast Debaryomyces hansenii.
Yudina Natal’ya ([email protected]), postgraduate student, department of chemistry, Tula State University.
Zaitseva Anna, student, department of chemistry, Tula State University.
Kozlova Tatiana, student, department of biotechnology, Tula State University.
Arlyapov Vyacheslav ([email protected]), candidate of chemical sciences, assistant professor, department of chemistry, Tula State University.
Поступила 23.05.2013
