CC BY
16
УДК 547.244: 547.963.4; 541.49; 542.422
БОРИРОВАННЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ ПРОТОГЕМИНА IX И L-АМИНОКИСЛОТ КАК ПОТЕНЦИАЛЬНЫЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЕ ПРЕПАРАТЫ
А.Н. Савченко, В.А. Ольшевская, В.Н. Калинин, А.А. Штиль*
(,Институт элементадргатtческих соединений им. АН. Несмеянова РАН. Москва: a-mail: [email protected])
Впервые получены копъшгаты протогемпна IX с анионным 1-карба-клозо-додскаборатным полиэдром с L-аминокислотами, в которых аминокислоты L-ряда связаны порфирнновым .макроцнк,юм амплной п.hi сложнозфирнойсвязью. Показана высокая противоопухолевая активность новых водорастворимых аминокислотпых производных борнроваиного протогс-мина IX на культурах опухолевых клеток человека.
Способность порфиринов селективно накапливаться и долгое время сохраняться в опухолевых клетках обусловила интерес к синтезу борированных производных природных и синтетических аналогов порфиринов для исследования их в борнейтроноза-хватной терапии рака (БНЗТ) 111. БНЗТ является одним из перспективных методов лечения злокачественных опухолей человека. В основе метода лежит ядерная реакция взаимодействия стабильного изотопа 10В с тепловыми нейтронами. Образующие-ся в результате реакции частицы ядра гелия В {п. а) и ядра отдачи Li обладают высокой энергией и небольшим суммарным пробегом, сопоставимым с диаметром клетки (10 мкм), что приводит к избирательному радиационному эффекту на клеточном уровне [2].
Несмотря на высокую эффективность ряда синтезирован ньгч карбораиилпорфиринов вопрос о снижении их токсичности оставался открытым, поскольку большинство из разработанных препаратов при введении их в организм способствовали проявлению нежелательных эффектов, вызывая образование тромбов в крови и понижение концентрации эритроцитов еще до того, как достигалась необходимая терапевтическая концентрация бора в опухоли [3].
Требования, предъявляемые к препаратам, следующие: растворимость в воде, низкая темновая токсичность для неопухолевых клеток, химическая стабильность in vivo и преимущественное накопление в опухоли (градиенты концентраций опухоль: мозг и опухоль: кровь должны составлять > 4:!). Мы предпо-
ложили, что всем трем условиям будет отвечать основная химическая модификация: конъюгаты природного протогемина IX с анионным 1-карба-клозо-доде-каборатом (монокарбораном) и природными аминокислотами, расположенными на периферии макроцикла. Введение аминокислоты должно оптимизировать селективность накопления соединения в быстро про-лиферирующих клетках и увеличить его растворимость в воде. Ранее были получены борированные порфирины с нейтральными и анионными борными полиэдрами. Среди синтезированных соединений водорастворимый 1,3,5,8-тетраметил-2,4-дивинил-6(7)-12-(клозо-монокарборан-1 "-ил) метилоксикарбонил-Этил]-7(6)-(2'-карбоксиэтил) порфиринат железа (III) (1) оказался нетоксичным в диапазоне 100 мг/кг и активным фототоксическим агентом in vivo [4]. Исследования внутриклеточного распределения соединения 1 показало, что оно накапливается в цитоплазме и не связывается с двухцепочечной ДНК.
С целью оптимизации противоопухолевых характеристик соединения 1 были разработаны методы конъюгирования аминокислот L-ряда с карбоксильной группой борированного порфирина 1 - соединения, проявившего биологическую активность in vivo.
Были получены два типа аминокислотных производных на основе порфирина 1. В первом типе аминокислоты L-ряда связаны со свободной карбоксильной группой монокарборанилпорфирина 1 амидной связью, во втором - сложноэфирной.
Производные первого типа получали с помощью реакции метиловых эфиров серина. ватина, фенилала-нина, тирозина и триптофана. Активацию карбоксиль-
* Российский онкологический научный центр им. М,М. Блохина РАМП. Москва).
г
а х
и
2 ВМУ7 № 5
ной группы проводили с помощью Вос20 (схема !). Полученные соединения представляют собой кристаллы темно-красного цвета, растворимые в СН2С12. СНС13, МеОН и ТГФ.
Следующий тип веществ получали в результате реакции монокарборанилпорфирина с оксоазобороли-диновыми производными Ь-серина (7) и Ь-треонина (8), имеющими свободную гид роке ильную группу (схема 2). Активацию проводили способом, аналогичным представленному на схеме ! Промежуточные соединения не выделяли, так как они легко гид-ролизуются водой, образуя конечные продукты. Эти порфирины интересны тем, что содержат в аминокислотном фрагменте свободные амино- и гидро-ксильную группы, что увеличивает гидрофильность этих соединений. Полученные соединения представляют собой кристаллы темно-красного цвета, растворимые в СН2С12, СНСЦ, МеОН, ТГФ Их строение было подтверждено методами электронной, ИК- и масс-сп ектрометри и.
Далее был проведен ряд биологических исследований на противоопухолевую активность. С помощью спектрофотометрического метода было установлено натичие взаимодействия между ДНК и соединениями 2 и 3, тогда как исходный монокарборанилпорфи-рин I не связывайся с ДНК. Об образовании молекулярного комплекса судили по изменениям характера спектра вещества (рисунок) после добавления к нему ДНК. Чтобы исключить вклад поглощения ДНК, при регистрации спектра реакционной смеси в качестве раствора сравнения использовали водный раствор ДНК такой же концентрации.
Затем провели сравнение активности полученных соединений по отношению к опухолевым клеткам линии К.562 (лейкемия). Клетки инкубировали с 0— 50 цМ каждого агента в течение 72 ч с последующим восстановлением клетками !-(4,5-диметилтиа-зол-2-ил)-3,5-дифенилформазана (МТТ-тест). Результаты показали, что серинсодержащее производное 3 было наиболее токсичным (1С?0 ~ 5 цМ). Аналогичное валинсодержащее производное 2 было значительно менее активным (1С50 ~ 35 цМ), а карбора-нилпорфирины с ароматическими аминокислотами (4-6) инертны. Такую же активность серинового карборанилпорфирина обнаружили по отношению к клеткам линии МСР-7 (карцинома молочной железы), ОаО\ (карцинома яичника) и НСТП6 (аденокар-цинома толстой кишки).
Сравнение цитотоксичносги монокарбакарборанил-порфирина 1 и его серинового производного 3 показа-
А
X, нм
Спектры поглощения водных растворов: 1 - ЛНК , 2 - ДНК.
шжубиропшшой с порфиритом 2, 3- ДНК, шпеубиропшпгой с порфирином 3
ло, что именно введение серина делает комплексы цитотоксичными.
На основе полученных данных мы исследовали способность серинсодержащего карборанилпорфирина преодолевать множественную лекарственную устойчивость различных опухолевых клеточных линий, Использовали две молекулярные детерминанты, а именно трансмембранный белок Р-гликопротеин и делецию проапопотического белка р53. Эти данные показали, что новые аминокислотные производные борированного порфирина не транспортируются Р-гли-ко протеи ном. Кроме того, серинсодержащий карбора-нилпорфирин вызывал гибель клеток рака толстой кишки человека (НСТ116) с интактным (диким типом) р53 в тех же концентрациях, что и в случае изо-генных клеток с делецией обоих аллелей (НСТ!16р53). Соединение 3 было активно даже при низких микромолярных концентрациях. Чтобы выявить механизмы цитотоксичносги серинового карборанилпорфирина, мы проверили, инициирует ли это соединение выработку свободных форм кислорода. В качестве хелатора свободных радикатов кислорода использовали N-ацетилцисгеин (NAC). Однако при-сутствие NAC не влияло на токсичность серинсодержащего карборанилпорфирина. Мы сделали вывод, что радикалы кислорода не участвуют в клеточной гибели под действием серинсодержащего карборанилпорфирина. Эти данные позволяют предположить, что клетки, устойчивые к "кислородному взрыву", ока-
жутся чувствительны к серии содержащем}" карбора-нилпорфирину.
Фрагментация геномной ДНК является важным признаком ano птоза. Нас интересовало, связана ли клеточная смерть с фрагментацией ДНК при действии серинсодержащего карборанилпорфирина. Клетки К562. обработанные серинсодержащим карбора-нилпорфирином, лизировати в буфере, содержащем иодид пропидия для связывания этого флуорохрома с ДНК, и подвергли анализу на проточном цитометре. Количество разрушенной ДНК зависело от дозы и времени. Уже через 24 ч воздействия на клетки 10 мкМ серинового карборанилпорфирина было разрушено более чем 40% ДНК. а через 48 ч - более 60%. Эти результаты показали, что сериновый карбо-ранилпорфирин может вызывать гибель клеток по механизму апоптоза. сопровождающемуся нарушением целостности ДНК.
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют. что аминокислотные производные бо-рированного протогемина. содержащие водорастворимый монокарбакарборан. обладают свойствами, необходимыми для создания как самостоятельных противоопухолевых препаратов, так и средств для БНЗТ.
Экспериментальная часть
Индивидуальность соединений контролировали с помощью ТСХ. Дтя ТСХ использовали пластинки Silufol (Чехия) в системе хлороформ:метанол (9:1). ИК-спектры получали в таблетках ГБХ (гексафтор-бутадиен), регистрировали на ИК-спектрометре «Specord М-82» («Carl Zeiss»). Очистку веществ проводили колоночной хроматографией на силикагепе Merk L (0.040-0.08). В качестве элюента использовали смесь хлороформ: метанол (9:!).
Общая методика синтеза коиъюгатов моно-карборанилпорфирина 3, в которых аминокислоты L-ряда связаны с монокарборанилпорфи-ринпм амиднон связью. К суспензии 0,195 ммоль гидрохлорида метилового эфира соответствующей L-аминокислоты в 2 мл СН2С!2 прибавляли 0,015 мл Et3N и перемешивали 1 ч при комнатной температуре. Растворители удаляли в вакууме. К остатку прибавляли безводный эфир, Eí3N I 1С! отделяли фильтрованием. Эфир отгоняли в вакууме.
К раствору 50 мг (0,065 ммоль) порфирина 1 в смеси 4 мл хлористого метилена и 4 мл пиридина, охлажденному до 0°С, прибавляли 60 мг (0,275 ммоль) лн-трет-бутилпирокарбоната и перемешивали при
этой температуре 15 мин. Затем прибавляли раствор L-аминокислоты метилового эфира в 2 мл хлористого метилена, еще через 5 мин добавляли 10 мг N,N'-диметиламинопиридина и перемешивали 2 ч при 20"С Растворители удаляли в вакууме. Продукт очищали колоночной хроматографией.
1,3,5,8-Тстраметил-2,4-дивннил-6(7)-|2'-(кло-ш-монокарборан-1-ил) метилоксикарбонил-этил]-7(6)-[2-Ма(Оа-метил-Ь-валино)карбонил-этил] порфиринат железа (III) (2). В качестве ам инок ист отной компоненты использовали 33 мг гидрохлорида метилового эфира L-валина. Выход 34 мг (59%), /Í, = 0.69. Электронный спектр (СН3С13), нм (е-10 3): 385,8(38,30); 511,0(4,09); 542,2(3,77); 643,2(1,83). ИК-спектр (v, см '): 3383 (NH). 2970 (СН), 2545 (ВН). 1719 (СО сл. эфира), 1657(CONH), 1623 (С=С), 1554 (амид II). Масс-спектр, m/z: 884 [М+].
1,3,5,8-Тетраметил-2,4-дивинил-6(7)-[2'-(клозо-монокарборан-1-ил) метил оксикарбонилэтил ]-7(6)-[2-N (О -метил-Ь.-серино)карбопилэтил] порфиринат железа (III) (3). В качестве аминокислотной компоненты испспьзовати 30 мг гидрохлорида метилового эфира L-серина. Вьгчод 26 мг (46%), R^ = 0,67. Электронный спектр (СНСЦ), Ямакс, нм (е.10~3): 397,8(48,4); 511,0(5,29); 542,0(4,68); 644,0(2,01). ИК-спектр (V, см"1): 3338 (NH. ОН). 2947 (СН), 2540 (ВН), 1742 (СО сл. эфира), 1658 (CONH),1623 (С=С), 1553 (амид II). Масс-спектр, m/z: 872 |М~|.
1,3,5,8-Тетраметил-2,4-дивинил-6(7)-[2/-(клозо-монокарборан-1-ил) метилоксикарбонилэтил]-7(6)-[2-N (О -метшьЬ-фенилаланино)карбонил-этил] порфиринат железа (III) (4). В качестве аминокислотной компоненты использовали 42 мг гидрохлорида метилового эфира L-фенилаланина Выход 34 мг (59%), Rf = 0.61. Электронный спектр (СН3С!3), нм (Е.10 3): 395,6(43,8); 511,! (5,62):
542,3(4,25); 643,4 (2,64). ИК-спектр (v, см"1): 3389(NH). 2930(СН), 2540(ВН), 1725 (СО сл. эфира), 1674(CONH). 1625 (С=С), 1550 (амид II). Масс-спектр, m/z: 932 [М J.
1,3,5,8-Тетраметил-2,4-дивинил-6(7)-[2/-(клозо-монокарборан-1-ил) метилоксикарбонилэтил]-7(6)-[2-N (О -метил-Ь-тирозино)карбонилэтил| порфиринат железа (Ш) (5). В качестве аминокислотной компоненты использовали 30 мг гидрохлорида метилового эфира L-серина Выход 37 мг (60%), Rf = 0,70. Электронный спектр (СНС13), XN];lK0. нм (е. 10 ): 387,9(45,4); 510,0(5,27); 542,2(4,66); 643,6(2,21), ИК-спектр (V, см"1): 3368 (NH, ОН), 2935 (СН), 2545
(ВН). ! 732 (СО сл. эфира), 1668 (CONH). 1623 (С=С). 1552 (амид II). Масс-спектр, m/z: 948 [M j.
1,3,5,8-Тетраметил-2,4-дивинил-6(7)-[2'-(клозо-монокарборан-1-ил) метилоксикарбоиилэтил]-7(6)-[2-N (О -метил-Ь-триоиино)карбонилэтил] порфиринат железа (Ш) (6). В качестве аминокислотной компоненты использовали 42 мг гидрохлорида метилового эфира L-фенилапанина. Выход 41 мг (64,9%), Rf = 0,55. Электронный спектр (СН2С12), А,ткс, нм (е.10 3): 393,3(44,1): 511,1 (5,62): 541,3(4,23); 642,7 (2,71). ИК-спектр (v, см"1): 3387(NH). 29!5(СН), 2537(ВН). 1728 (СО сл. эфира), 1667(CONH), 16351 (С=С), 1552 (амид II). Масс-спектр, m/z: 971 [М J
Общая методика синтеза конъюгатов моноза-мещенного карборанилпорфнрина с аминокислотами (9, 10). Литиевую соль серина или натриевую соль треонина в количестве 0,45 ммоль суспендировали в 3 мл безводного ТГФ. к раствору добавляли 0,27 мл BF3Et20 Реакционную смесь перемешивали 6 ч при комнатной темперагуре и 2 ч при 40-45°С. Раствор упаривали в вакууме. К охлажденному до 0°С раствору 50 мг (0,065 ммоль) порфирина 3 в смеси 4 мл хлористого метилена и 4 мл пиридина прибавляли 60 мг (0,275 ммоль) ди-трет-5}triпиро-карбоната, перемешивали при этой температуре 15 мин и прибавляли эту смесь к L-аминокислоте. Через 5 мин добавляли 10 мг N, Nд и метил аминопи-ридина и перемешивали 2 ч при 20°С Затем к реакционной смеси прибавляли 5 мл воды и перемешивали 1 ч в случае серина и 10 ч в случае треонина. Водный слой отделяли. Растворители удаляли в вша-уме. Продукт выделяли с помощью колоночной хроматографии.
1,3,5,8-Тет р амет и л -2,4 - д и в и н и л-6 (7)- [ 2'-( км оз о-монокарборан-1-нл) метилокснкарбоннлэтнл]-7(6)-[2-Оа-Ь-сериио]карбонилэтил] порфиринат
железа (III) (9). В качестве аминокислотной компоненты использовали 66 мг литиевой соли L-серина. Выход 33 мг (59%), Rf= 0,17. Электронный спектр (СНСЦ), Х.мак,, нм (е.10"3): 363,2(43,79); 511,4(4,20); 542.0(2.95); 621,2(1.02). ИК-спектр (v, см '): 3700 -3100 (ОН), 3315 (NH). 2936(СН). 2540(ВН), 1725(СО сл. эфира), 1623 (С=С). Macc-cneicrp, m/z: 858 |М:|.
1,3,5,8-Тет р амет и л - 2,4 - д и в и н и л - 6 (7)-12'-(кл оз о -монок'арборан-1-ил) метилоксикарбонил этил ]-7(6)-|2-Оа-Ь-треонино|карбонилэтил| порфиринат железа (III) (Ю). В качестве аминокислотной компоненты использовали 63 мг натриевой соли L-треонина Выход 30 мг (53%), AV = 0,69. Электронный спектр (СН2С12), Хшкс, нм (е.10-3): 406,4(53,32);
538.0(7,16); 641.2(2,32). ИК-спектр (v, СМ"1): 3700-3100 (ОН), 3321 (NH), 2925(СН), 2540 (ВН), 1730 (СО сл. эфира). 1623 (С=С). Масс-спектр, m/z: 872|М |.
Определение питотоксической активности производных протогемина IX для опухолевых клеток хронического ми ел о л ей коза человека К562, растущих в условиях in vitro. Клетки культивировали в полной питательной среде, содержащей RPM1-1640+DMEM (1:1) ("ПАНАЭКО", Россия) и 5% FCS (Flow, Англия), с добавлением 2 мМ глутамина.
Клетки, растущие в логарифмической фазе, снимали с подложки версеном-трипснном, тщательно пипетировали до образования одноклеточной суспензии. вносили 50 мкл суспензии в 450 мкл буфера (физиологического раствора), пипетировали и считали в камере Горяева (число клеток в 25 больших квадратах разделили на 5, умножили на 2500 и умножили на разведение, размерность - количество клеток/мл). В новую пробирку вносили клетки и среду так, что концентрация клеток сосга&ляла 15 000 клеток в мл. В лунки 96-луночного планшета вносили 190 мкл клеточной взвеси. Приготовляли серийные разведения: 250 мкМ (из исходного 1 мМ брали 10 микролитра и вносили в 90 мкл среды). Из этого раствора брали 25 мкл и вносили в 75 мкл среды с получением 62,5 мкМ раствора. Из этого раствора брали 25 мкл и вносили в 75 мкл среды с получением 15,6 мМ раствора. Затем из каждого разведения вносили по 5 и 10 мкл в лунки. В этих случаях объемами растворителя и изменением общего объема среды в лупке можно пренебречь. Инкубацию проводили 72 ч при 37"С.
Затем вносили в лунки 20 мкл водного раствора МТТ (5 мг/мл). Инкубировали 1 ч до развития интенсивной темно-фиолетовой окраски внутри клеток (формазан). Отбирали среду, не трогая клетки. К клеткам добавляли 100 мкл ДМСО, пипетировали до гомогенности и встряхивали на шейкере 2 мин. Оптическую плотность измеряли при 540 нм и построили кривые выживаемости. При этом за 100% принимати ОД540 контрольные лунок, к которой отнесли ОД лунок с той или иной концентрацией исследуемого препарата.
Спектрофотометрическое изучение взаимодействия карборанилпорфиринов 1,2,3 с ДНК. Спектры регистрировали на спектрофотометре М-40 {"Carl Zeiss"). В кварцевую кювету толщиной 1 см помещали 3 мл дистиллированной воды и 3 мкл
4 RMY химия, № 5
ДНК (конечная концентрация ДНК 10 мкг/мл). Готовили раствор лиофилизированной двухцепочечной ДНК из тканей теленка (10 мг/мл в дистиллированной воде), и растворы исследуемых веществ (10 мМ в ДМСО).
В кювету вносили 3 мл дистиллированной воды и 3 мкл раствора ДНК. конечная концентрация которого составляла 10 мкг/мл). Поглощение измеряли на спектрофотометре при длине волны 200-900 им. Затем в новую кювету вносили 3 мкл исследуемого порфирина 1 (конечная концентрация 10 мкМ) и из-
меряли поглощение на спекгрофлуориметре. В кювету с раствором ДНК добавляли 3 мкл раствора исследуемого порфирина 1 и измеряли поглощение относительно водного раствора ДНК такой же концентрации. О связывании с ДНК судили по изменению спектра в области 260 им (максимум поглощения, характерный для ДНК) после вычитания. Аналогичные измерения проводили и с порфиринами 2 и 3.
Контроль связывания ДНК проводили с помощью классического интеркалятора — противоопухолевого антибиотика доксорубицина.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Soloway A.II., Tjarks W., Barman ß.A. et al, // Chem. Rev
!998. 98. p 1515.
2. Davis MA., Little J.B. //Radialion Res. 197ft. 43. P. 534.
3. Miura M.. Joel D.D.. Na wrack у M.M.. Micca PL.,
Fisher C.D., Heinrichs J.C., Rising C.E., Walker W., Slatkin D.N. II Advances in Neutron Capture Therapy. Amsterdam. 1997. Vol. 2. P. 56.
4. Ольшевская H.A., Никитина Р.Г., 'Зайцев A.B., Гюльма-лиеваM, А., Лузгина В.Н., Кононова КГ., Морозова Т.Г., ДрожжинаВ.В., КаплаиМ.Л., Калинин В. П., Штиль АЛ. //Докл. ран. 2004.399. С. 783.
Поступила ü редакцию 09.04.07
BORONATED DERIVATIVES OF PROTOHEM1N IX AND LA Ml NO ACIDS AS POTENTIAL ANTICANCER AGENTS
A.N. Savchenko V.A. Ol'shevskava, V.N. Kalinin, A.A. Shtil*
(N. Nesmeyanov Institute ofOrganoelement Compounds Russian Academy of Sciences. *N. N. Blokhin Cancer Center)
We synthesized a series of novel water soluble conjugates of protohemin IX with anionic 1-carba-closo-dodccaboratc and L-amino acids. In these compounds the amino acid residues are hound to the porphyrin macrocytic via the amide or ester bonds. The antitumor activity of novel compounds demonstrated their high potency in killing a variety of human tumor cell lines, including those that expressed molecular determinants of altered anticancer drug response.
