CC BY
78
УДК 579.62:636.757
БЛАГОПОЛУЧИЕ ЖИВОТНЫХ И КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ ЭЛЕМЕНТОВ МИКРОБИОТЫ
© Шубкина Анна Владимировна
кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Института проблем экологии и эволюции им. А. Н. Северцова Российской академии наук Россия, 119071, г. Москва, Ленинский пр., 33 E-mail: annashubkina@ rambler.ru © Ерофеева Екатерина Владимировна
инженер-лаборант Российского государственного аграрного университета — МСХА им. К. А. Тимирязева
Россия, 127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, 49 E-mail: [email protected]
Проведен анализ динамики количественного состава микробиоты элементов поверхности кожного покрова у животных с разным уровнем благополучия. Установлено, что присутствие микрофлоры на мочке носа не является следствием контаминации из воздуха и окружающей среды и определяется общим состоянием организма. При этом отсутствуют гендерные различия, но существуют возрастные, что соответствует современным представлениям об изменении в ходе онтогенеза стресс-реакции и иммунного ответа. Установлено наличие значимого повышения количества микрофлоры у неблагополучных животных независимо от конкретных причин ухудшения их состояния. Результаты исследования позволяют рекомендовать неинвазивный метод для сравнения благополучия животных.
Ключевые слова: микробиота, микроорганизмы, макроорганизмы, стресс, благополучие. ANIMAL WELFARE AND QUANTATIVE VARIABILITY OF MICROBIOTA ELEMENTS
Anna.V. Shubkina
PhD in biology, senior researcher, Severtsov Institute of Ecology and Evolution of the Russian Academy of Sciences ( IEEP- RAS A.N. Severtsev) 33 Leninskiy ave, Moscow, 119071 Russia
Ekaterina V. Erofeeva
engineer-laboratory, Russian State Agrarian University 49 Timiryazevskaya St., Moscow, 127550 Russia
The comparative analysis of quantative parameters of microbiotic elements of the skin surface was made. It is established that the presence of microflorae at the nasal mirror does not reflect the contamination from air and surroundings but is determined by general state of the macroorganism, its welfare. There are no gender distinctions unlike to age differences in accordance to the modern view of the development of stress and immunity in ontogenesis. Is proved the significant increase of microorganisms amount in unfortunate animals despite of concrete reasons of the decline. The result of the study allows to recommend the non-invasive method for animal welfare comparison. Keywords: microbiota, microorganism, microorganism, stress, welfare.
Введение
Поверхности и внутренние полости тела многоклеточных организмов населены огромным количеством микроорганизмов [16], которые взаимодействуют между собой, объединены в сообщества и упорядоченно изменяются в зависимости от состояния организма хозяина. Сообщества микроорганизмов включают комменсальные, симбиотические и патогенные формы, совокупность которых называют микробиотой. Численность и состав микробиоты регулируются гормонами стресса и эндогенными антимикробными пептидами, т. е. тесно связана с состоянием организма хозяина [15]. Изменение микробиоты включает качественные (смену видового состава) и количественные (изменение численности) перестройки. Здоровье и болезнь человека невозможно понять без полного понимания «симбиоза макроорганизма и микробиоты как суперорганизма» [18].
Количество микроорганизмов — обитателей слизистых и кожи на порядок превышает число клеток человека [20]. Значительная часть микроорганизмов является обитателями кожных покровов, что требует рассматривать их как часть иммунной системы [14; 17]. Поверхностная микрофлора может рассматриваться как единый маркер множественных отклонений состояния макроорганизма [4]. Одним из важнейших факторов, влияющих на динамику численности нормальных кожных бактерий и их замещение патогенными формами, как внутри тела, так и на покровах, является генерализованный адаптационный синдром — стресс [9]. При заболевании или развитии стресса, нередко еще до появления клинических признаков заболевания, изменяется состав микробиоты, прежде всего? возрастает количество нормальных кожных бактерий [1].
Целью нашей работы является изучение динамики микробиоты у животных с разным уровнем благополучия на примере борзых собак. Использована оценка количественных изменений элементов микрофлоры мочки носа — эта часть тела у большинства млекопитающих лишена волос и удобна для получения проб [9].
Материал и методы. Работу проводили с 2012 по 2015 г. Применяли стандартную методику. Метод был успешно апробирован в работах [6; 7; 8; 9], продолжает использоваться в современных работах [9; 10].
Материалом для исследований служили отпечатки на МПА (мясопептонный агар) с мочки носа собак. Для приготовления проб замороженный (предварительно стерилизованный) МПА разогревали на водяной бане. Обжигая пламенем горелки горло сосуда, разливали МПА в чашки Петри. Остужали и слегка подсушивали под УФ-лампой. Перед взятием проб маркировали чашки, указывая дату и кличку собаки.
Для получения отпечатков чашки с застывшим МПА прикладывали к носам собак (чашка открыта 5-15 с). На время сбора проб открытую чашку со средой оставляли в вольере (далее контроль воздуха, седиментационный метод, МУ 2.1.4.1057-01), она оставалась открыта более 10 минут, т. е. примерно на два порядка длительнее.
Пробы помещали в термостат, предварительно разогрев его до температуры +37 оС. Инкубировали 48 часов при t+37 оС, потом производили подсчет глазомерно колониеобразующих единиц, от 1 до 300 (согласно нормам Минздрава). Также производили фотосъемку проб.
Общепринятым методом оценки изменений количества микрофлоры является характеристика колониеобразующих единиц — КОЕ (в англоязычной литературе CFU — Colony Forming Units). Ко-лониеобразующая единица — это одна микробная клетка, из которой вырастает колония, т. е. жизнеспособный микроорганизм, который при инкубации в питательной среде, воспроизводясь, может сформировать колонию. КОЕ характеризует количество микрофлоры. В норме оно больше нуля, но, например, применение антибиотиков может приводить не только к сокращению численности, но и к полному исчезновению микроорганизмов. Увеличение КОЕ свидетельствует о возросшей биомассе микрофлоры поверхностей тела. Для оценки КОЕ мы применяли подсчет числа колоний на чашку.
Статистическая обработка включала сравнение Descriptive statistic и оценку значимости различий пар признаков по критерию Стьюдента в программе Statistica 8.0.
Объектом исследований служили борзые трех пород — псовые, хортые и грейхаунды, принадлежащие 4 питомникам и частным лицам. У собак частных лиц пробы собраны во время крупнейшего мероприятия по оценке рабочих качеств — на всероссийских состязаниях борзых, куда допускаются отобранные собаки, находящиеся, по мнению владельцев, в безупречной физической форме.
Благополучными (условно здоровыми) считали собак с обычной двигательной, пищевой и игровой активностью, при отсутствии клинических признаков заболеваний. Неблагополучными считали животных с установленными хроническими или острыми болезнями, травмами, краткосрочными диспепсиями, аномальными линьками, либо аномально сниженной активностью.
Результаты и их обсуждение. Микробиологический анализ показал, что состав бактерий поверхности носа представлен разными видами родов Staphylococcus, Enterococcus, Escherichia, Lactobacillus, встречаются дрожжеподобные грибы рода Candida (табл. 1). Данные соответствуют анализу, проведенному ранее [9].
Таблица 1
Качественный состав микроорганизмов в пробах, % (выполнен в независимой лаборатории ШАНС-БИО)
Вид Sta. epidermidis Sta. aureus Enter. faecium Sta. intermedius Lac + E.colii Candida albicans
Частота встречаемости 77,8 55,6 38,8 33,3 27,7 22,2
Сравнение количества микроорганизмов контроля воздуха с пробами всех собак показывает наличие значимых (р<0,0001) различий. Следовательно, присутствие микрофлоры на мочке носа собак обусловлено не контаминацией из воздуха.
Таблица 2
Общие результаты проведенных работ
№ Название выборки Величина выборки КОЕ среднее КОЕ Дов. инт
1 Пробы всех собак 427 154,0 145,0±163,0
2 Контроль воздуха 25 10,0 14,2 ± 25,4
3 Питомник ИПЭЭ-РАН 310 152,0 141,5± 162,1
4 Иные (3 питомника и состязания) 96 157,0 138,3 ±175,4
5 Зима (снеговой покров, -27гр С< Т >+2 гр С) 50 123,0 104,5± 141,3
6 Лето (+18 гр С< Т >+30 гр С) 137 108,0 96,7 ± 119,2
7 Возраст от 1года до 8 лет 276 125,0 116,0±134,3
8 Возраст до 1 года и после 8 лет 35 186,0 154,4±217,1
9 Все кобели 113 128,0 72,0±93,1
10 Все суки 163 123,0 70,0±87,0
11 Благополучные 276 125,0 116,0±134,3
12 Неблагополучные 83 230 213,0±247,0
Полученные данные свидетельствуют о том, что количество микрофлоры не различается у борзых четырех питомников, находящихся в разных регионах и климатических условиях.
Считается, что в летнее время условия внешней среды более благоприятны для развития микроорганизмов, что могло влиять на количество микроорганизмов в пробах у собак. Наши исследования не подтвердили этого. Независимо от температуры внешней среды количество микроорганизмов в пробах не различается (р=0,84). Это доказывает, что развитие микрофлоры поверхности тела контролируют в большей степени эндогенные факторы (состояние организма), нежели экзогенные (окружающая среда).
Принято считать, что у собак в возрасте до 1 года неустойчивая иммунная система, а животные старше 8 лет могут иметь ослабленный иммунитет [3]. Следовало оценить, есть ли различия между такими животными. С этой целью из общей выборки были отобраны молодые собаки до года (п=1) и пожилые от 8 до 10 лет (п=14).
Данные, представленные на рис. 1, показывают, что количество микрофлоры у молодых и пожилых собак значимо (р<0,0001) выше, чем у собак от года до 8 лет (табл. 2). Это соответствует положению об ослаблении иммунитета и более низкой стресс-резистентности молодых и старых животных [2; 12]. Учитывая эти результаты, данные по молодым и старым собакам не использовали в дальнейшем анализе.
Рис. 1. Возрастная изменчивость По оси ординат — кол-во колоний, по оси абсцисс — названия выборок. Меап-среднее, 8Б-доверительный интервал, 1,96SD — величина дисперсии
Анализ гендерной изменчивости (табл. 2, п. 9-10) количества микрофлоры показал отсутствие значимых различий (р=0,6).
Существуют данные о том, что состав и количество микроорганизмов у людей и животных меняются в зависимости от их состояния [9,12]. К неблагополучным были отнесены 29 животных с травмами (п=9), диспепсией, стрессом (п=12), кожные воспаления (п=2) и различные болезни (п=8), ложная беременность (п=2).
Рис. 2. Результаты сравнения животных в разном состоянии
Количество микроорганизмов, обнаруженных на мочке носа неблагополучных животных почти вдвое выше, чем у здоровых (табл. 2): среднее значение КОЕ у здоровых собак ниже, чем у неблагополучных, а дисперсия — существенно больше.
Заключение
Из представленных данных видно, что повышенное количество микроорганизмов значимо чаще встречается у неблагополучных собак и является признаком снижения благополучия. Это свидетельствует о том, что количество микрофлоры мочки носа определяется эндогенными факторами, т. е. общим благополучием организма, что соответствует данным [13] о том, что стрессоры повышают число особей с большим количеством колоний бактерий. При любом заболевании развивается генерализованный адаптационный синдром, т. е. животные с повышенным количеством микроорганизмов на поверхности кожи пребывают в состоянии длительного стресса. Стресс — это не только состояние организма, но и механизм регуляции количественного и качественного состава микрофлоры, населяющей любой макроорганизм. Выброс адреналина является пусковым механизмом процессов, нарушающих стабильность кожных микробных ассоциаций [5].
Таким образом, сравнение количества кожных микроорганизмов можно рекомендовать для характеристики благополучия животных в качестве неинвазивного метода оценки их состояния.
Литература
1. Ерофеева Е. В. Неинвазивный метод оценки состояния собак // Человек и животные. Астрахань, 2014. С. 72-75.
2. Никитин В. Н. Эндокринная система в разные возрастные периоды. Щитовидная железа // Возрастная физиология. Сер. Руководство по физиологии. Л.: Наука, 1975. C. 345-348.
3. Петрянкин Ф. П., Петрова О. Ю. Фундаменталные исследования в ветеринарии. Использование иммуностимуляторов для повышения физиологического статуса у молодняка // Ветеринарная патология. 2008. № 1. С. 70-73.
4. Северцов А. С., Шубкина А. В. Теория эволюции. Эволюционное значение хищников // Природа. 2015. № 6. С. 18-27.
5. Севрцова А. С., Шубкина А. В. Хищник как универсальный селекционер // Наука в России. 2014. № 5(203). С. 11-18.
6. Соколов В. Е. Реакция микробных ассоциаций на поверхности кожи млекопитающих на изменение физиологического состояния организма // Изв. АН СССР. Сер. Биол. 1990. № 5. С. 694-700.
7. Соколов В. Е., Ушакова Н. А., Козлова А. А. Изучение физиологического статуса детенышей котика с использованием микробиологических свойств кожного и волосяного покрова // Известия РАН. Сер. Биол. 1994. № 3. С. 375-385.
8. Соколов В. Е., Ушакова Н. А., Чернова О. Ф. Взаимодействие бактерий с поверхностью кожи у млекопитающих // Известия РАН. Сер. Биол. 1993. № 4. С. 519-524.
9. Стресс как фактор, нарушающий стабильность кожных микробных ассоциаций / В. Е. Соколов, Н. А. Ушакова, А. В. Шубкина, Т. И. Неклюдова // Доклад АН СССР. 1991. Т. 317, № 3. С.764-768.
10. Шубкина А. В., Северцов А. С., Чепелева К. В. Факторы, влияющие на изъятие жертвы хищником: моделирование с использованием борзых собак // Известия РАН. Сер. Биол. 2012. № 1. С. 1-13.
11. Шубкина А. В. Изучение реакции хищника на жертву с использованием борзых собак в качестве модели // Проблемы исследования домашней собаки: материалы совещания. ИПЭЭ РАН. 2006. С. 53-67.
12. Ясенявская А. Л. Изучение влияния иммобилизационного стресса и антиоксидантов на гормональную активность щитовидной железы белых крыс на разных этапах онтогенеза // Вестник Нижегородского университета им. Н. И. Лобачевского. 2010. № 2(2). С. 689-693.
13. Bailey M. T., Engler H., Sheridan J. F. Stress induces the translocation of cutaneous and gastrointestinal microflora to secondary lymphoid organs of C57BL/6 mice // JOURNAL OF NEUROIMMUNOLOGY 171 (1-2): 2006. P. 29-37.
14. Choi Y. S., Gray H. M., Ambady N. The glimpsed world: Unintended communication and unintended perception // The new unconscious. 2005. P. 309-333.
15. Henderson B. Cell Stress Proteins as Modulators of Bacteria-Host Interaction. The Biology of Extracellular Molecular Chaperones / Novartis Foundation Symposium 291 (eds D. J. Chadwick and J. Goode). UK, 2008.
16. Lee Y. K., Mazmanian S. K. Has the microbiota played a critical role in the evolution of the adaptive immune system? // Published in final edited form as: Science. 24; 330(6012), 2010. P. 1768-1773.
17. Niyonsaba F., Nagaoka I., Ogawa H. Human defensins and cathelicidins in the skin: Beyond direct antimicrobial properties // CRITICAL REVIEWS IN IMMUNOLOGY 26 (6): 2006. P. 545-575.
18. Floyd E., Dewhirst Tuste Chen., Jacques Izard., Bruce J. Paster., Anne C. R., Tanner Wen-Han Yu., Abirami Lakshmanan, and William G. Wade J Bacteriol. The Human Oral Microbiome // American Society for Microbiology October; 192(19): 5002-5017. 2010.
19. Tlaskalova-Hogenova H., Stepankova R., Hudcovic T., Tuckova L., Cukrowska B., Lodinova-Zadnikova R., Kozakova H., Rossmann P., Bartova J., Sokol D., Funda D. P., Borovska D., Rehakova Z., Sinkora J., Hofman J., Drastich P., Kokesova A. 2004. Commensal bacteria (normal microflora), mucosal immunity and chronic inflammatory and autoimmune diseases // IMMUNOLOGY LETTERS 93 (2-3): 97-108 Pennisi, 2010.
References
1. Erofeeva E. V. Neinvazivnyi metod otsenki sostoianiia sobak [Independent method of assessment dogs' status]. Chelovek i zhivotnye. Astrakhan. 2014. Pp. 72-75.
2. Nikitin V. N. Endokrinnaia sistema v raznye vozrastnye periody. Shchitovidnaia zheleza [Endocrine system in different periods. thyroid galnd] Vozrastnaia fiziologiia. Ser.Rukovodstvo po fiziologii. Leningrad. 1975. Pp. 345-348.
3. Petriankin F. P., Petrova O. Iu. Fundamentalnye issledovaniia v veterinarii. Ispol'zovanie immu-nostimuliatorov dlia povysheniia fiziologicheskogo statusa u molodniaka [Basic research in the veterinary field. The use of immunostimulants to improve the physiological status young animals]. Veterinarnaia patologiia. 2008. № 1. Pp. 7073.
4. Severtsov A. S., Shubkina A. V. Teoriia evoliutsii. Evoliutsionnoe znachenie khishchnikov[Evolution theory. Predators evolution significance]. 2015. № 6. Pp. 18-27.
5. Sevrtsova A. S., Shubkina A. V. Khishchnik kak universal'nyi selektsioner [Predators like universal selectionist] Nauka v Rossii. 2014. № 5(203). Pp. 11-18.
6. Sokolov V. E. Reaktsiia mikrobnykh assotsiatsii na poverkhnosti kozhi mlekopitaiushchikh na izmenenie fiziologicheskogo sostoianiia organizma [Reaction of microbial associations on the surface of mammalian skin to changing physiological states of organism] 1990. № 5. Pp. 694-700.
7. Sokolov V. E., Ushakova N. A., Kozlova A. A. Izuchenie fiziologicheskogo statusa detenyshei kotika s ispol'zovaniem mikrobiologicheskikh svoistv kozhnogo i volosianogo pokrova [The study of the physiological status of young seals with microbiological properties of skin and hair]. 1994. № 3. Pp. 375-385.
8. Sokolov V. E., Ushakova N. A., Chernova O. F. Vzaimodeistvie bakterii s poverkhnost'iu kozhi u mlekopitaiushchikh [The interaction of bacteria with the mammals' skin surface]. 1993. № 4. Pp. 519-524.
9. Stress kak faktor, narushaiushchii stabil'nost' kozhnykh mikrobnykh assotsiatsii [Stress - as a factor disturbing the stability of skin microbial associations] V. E. Sokolov, N. A. Ushakova, A. V. Shubkina, T. I. Nekliudova. 1991. Vol. 317, № 3. Pp. 764-768.
10. Shubkina A. V., Severtsov A. S., Chepeleva K. V. Faktory, vliiaiushchie na iz"iatie zhertvy khishchnikom: modelirovanie s ispol'zovaniem borzykh sobak [Factors affecting the eviction victim predator: modeling with greyhounds] 2012. № 1. Pp. 1-13.
11. Shubkina A. V. Izuchenie reaktsii khishchnika na zhertvu s ispol'zovaniem borzykh sobak v kachestve modeli [Study of the reaction of the predator on the victim with greyhounds as a model] Problemy issledovaniia domashnei sobaki: materialy soveshchaniia. IPEE RAN. 2006. Pp. 53-67.
12. Iaseniavskaia A. L. Izuchenie vliianiia immobilizatsionnogo stressa i antioksidantov na gormonal'nuiu ak-tivnost' shchitovidnoi zhelezy belykh krys na raznykh etapakh ontogeneza [The study of the effect of immobilization stress and antioxidants in the hormonal activity of the thyroid gland of white rats at different stages of ontogenesis] Vestnik Nizhegorodskogo universiteta im. N. I. Lobachevskogo. 2010. № 2(2). Pp. 689-693.
13.Bailey M. T., Engler H., Sheridan J. F. Stress induces the translocation of cutaneous and gastrointestinal microflora to secondary lymphoid organs of C57BL/6 mice // JOURNAL OF NEUROIMMUNOLOGY 171 (1-2): 2006. Pp. 29-37.
14. Choi Y. S., Gray H. M., Ambady N. The glimpsed world: Unintended communication and unintended perception // The new unconscious. 2005. Pp. 309-333.
15. Henderson B. Cell Stress Proteins as Modulators of Bacteria-Host Interaction. The Biology of Extracellular Molecular Chaperones / Novartis Foundation Symposium 291 (eds D. J. Chadwick and J. Goode). UK, 2008.
16. Lee Y. K., Mazmanian S. K. Has the microbiota played a critical role in the evolution of the adaptive immune system? // Published in final edited form as: Science. 24; 330(6012), 2010. Pp. 1768-1773.
17. Niyonsaba F., Nagaoka I., Ogawa H. Human defensins and cathelicidins in the skin: Beyond direct antimicrobial properties // CRITICAL REVIEWS IN IMMUNOLOGY 26 (6): 2006. Pp.545-575.
18. Floyd E., Dewhirst Tuste Chen., Jacques Izard., Bruce J. Paster., Anne C. R., Tanner Wen-Han Yu., Abirami Lakshmanan, and William G. Wade J Bacteriol. The Human Oral Microbiome // American Society for Microbiology October; 192(19): 5002-5017. 2010.
19. Tlaskalova-Hogenova H., Stepankova R., Hudcovic T., Tuckova L., Cukrowska B., Lodinova-Zadnikova R., Kozakova H., Rossmann P., Bartova J., Sokol D., Funda D. P., Borovska D., Rehakova Z., Sinkora J., Hofman J., Drastich P., Kokesova A. 2004. Commensal bacteria (normal microflora), mucosal immunity and chronic inflammatory and autoimmune diseases // IMMUNOLOGY LETTERS 93 (2-3): 97-108 Pennisi, 2010.
