CC BY
132
УДК 759.873.088.5:661.185
БІОТЕХНОЛОГІЧНИЙ ПОТЕНЦІАЛ БАКТЕРІЙ РОДУ RHODOCOCCUS ТА ЇХ МЕТАБОЛІТІВ
Т. П. ПИРОГ, М. О. ШУЛЯКОВА, Т. А. ШЕВЧУК, А. П. СОФІЛКАНИЧ Національний університет харчових технологій, Київ Е-таіІ: [email protected]
0тримано12.09.2011
Власні експериментальні результати авторів та дані літератури демонструють великий біотехно-логічний потенціал бактерій роду Rhodococcus як деструкторів ароматичних, гетероциклічних і аліфатичних ксенобіотичних сполук (нафтален, ксилол, толуол, етилбензен, індол, нітрофенол, трихлоретилен, вуглеводні нафти тощо), а також як продуцентів практично цінних метаболітів (поверхнево-активні речовини, антибіотики, екзополісахариди, ензими). Поверхнево-активні речовини (ПАР) є вкрай важливими продуктами мікробного синтезу, оскільки мають такі суттєві переваги перед синтетичними аналогами, як біодеградабельність, стійкість у широкому діапазоні температур, рН, а також можуть бути синтезовані з відходів інших виробництв. Розглянуто використання метаболітів ро до коків у при ро до охо рон них тех но логіях, ме ди цині, сільсь ко му гос по дарстві та участь представників роду Rhodococcus у процесах біотрансформації для одержання ароматизаторів (кар-вон, гераніол), біодизеля, бутираміду, акрилової кислоти тощо.
Підсумовано власні експериментальні дані щодо інтенсифікації синтезу і практичного застосування ПАР Rhodococcus erythropolis ІМВАс-5017. Встановлено, що заприсутностіяк клітин, так і позаклітинних метаболітів штаму ІМВ Ас-5017 з поверхнево-активними та емульгувальними властивостями ступінь деструкції нафти у воді і ґрунті досягав 80-93% через 30 діб. Показано, що ПАР Б. erythropolis ІМВ Ас-5017 притаманна антимікробна дія щодо низки мікроорганізмів, у тому числі й фітопатогенних бактерій. У разі обробки (1-2 год) препаратами ПАР суспензії досліджуваних тест-культур спостерігали зниження кількості життєздатних клітин на 74-97%.
Ключові слова: бактерії роду Rhodococcus, деструкція ксенобіотиків, біотрансформація, поверхнево-активні речовини, полісахариди, ензими.
Ринковий інтерес до представників роду ЯНойососсиз зумовлений унікальними особливостями метаболізму цих бактерій, зокрема здатністю до розкладу багатьох ксенобіотиків та їх перетворення на менш токсичні сполуки [1-18]. Можливості використання катаболічного різноманіття родо-коків у при ро до охо рон них тех но логіях роз -глянуто в огляді [16].
Великі геноми родококів, їх універсальні катаболічні шляхи, широка субстратна специфічність метаболічних систем, здатність до спо жи ван ня та пе рет во рен ня гідро фоб -них спо лук, стійкість до несп ри ят ли вих умов, наявність удосконалених інструментів генно-інженерної модифікації роблять їх ідеальними мікроорганізмами для використання у процесах біотрансформацій і біодеградації багатьох органічних сполук у промислових масштабах [12].
Використання представників роду Rhodococcus у процесах біодеградації ксенобіотиків
Хімічна, фармацевтична, сільськогосподарська, нафтопереробна та інші галузі сучасного виробництва є постійними постачальниками ксенобіотичних сполук у довкілля, що призводить до накопичення шкідливих речовин у природі. Біоремедіація — це технології використання живих організмів з метою розкладу забруднювальних речовин та перетворення їх на двоокис вуглецю і воду або менш токсичні сполуки. Такі технології зазвичай економічніші, ніж термічні та фізико-хімічні способи детоксикації, зокрема спалювання. Біоремедіація довкілля охоплює два процеси: біоауґментацію (інтродукція мікроорганізмів-деструкторів у забруднені території) та біостимуляцію
(активація природної автохтонної мікрофлори) [19, 20].
Розкладання ароматичних та гетероциклічних сполук. Серед представників роду Rhodococcus виявлено багато видів і штамів, здатних до деградації таких органічних сполук, як нафтален, ксилол, толуен, етил-бензен, дибензофуран, біфеніл, стирен, кате-хол, флуорен, індол, нітрофенол та ін. [1, 4, 5, 7-10, 13, 16-18, 21-23].
Так, виділений нещодавно штам Rhodococcus jialingiae djl-6-2 здатен використовувати як єдине джерело вуглецю та азоту карбенда-зим — речовину, що її широко застосовують як фунгіцид, якому притаманний мутагенний та тератогенний ефект навіть за низьких концентрацій [17]. R. jialingiae djl-6-2 може розкладати до 94% карбендазиму (100 мг/л) упродовж 60 год.
Уперше серед представників роду Rhodococcus було виявлено штам, ідентифікований як Rhodococcus ruber Chol-4, що вико -ристовує як джерело вуглецевого живлення ши ро кий спектр сте роїдних спо лук, се ред яких — холестерол, тестостерон, андросте-рон та прогестерон [5].
Нафтален — одна з найпоширеніших ксенобіотичних сполук. Здатність до його ка та болізму при та ман на грам не га тив ним бактеріям Pseudomonasputida G7 і NCIB9816-4, Ralstonia sp. U2 та грампозитивним — Rhodococcus opacus R7 і Rhodococcus sp. NCIMB12038 [4]. Останній розкладає нафта-лен че рез саліци ло ву та ген ти зи но ву кис ло -ти. При цьому гени, що кодують ці перетворення, не об’єднані в оперон. Порівняння генів, відповідаль них за ме та болізм наф та -лену, в R. opacus R7 та Rhodococcus sp. NCIMB12038 показало високий ступінь гомології, але різну їх організацію.
Rhodococcus sp. DK17 як єдине джерело вугле цю та енергії мо же ви ко рис то ву ва ти о-ксилол, бензен, алкібензени, фенол, фта-лати та інші ароматичні сполуки, при цьому розк лад алкілбен зенів ініціюєть ся о-кси -лолдіоксигеназою, що складається з редук-та зи, фе ре док си но вої скла до вої та [2Fe-2S]-оксигеназного компонента [9]. Індан — біциклічна органічна сполука, що складається з одного ароматичного та одного цик ло пен та но во го кіль ця. Rhodo coc cus sp. DK17 може рости на рідкому мінеральному середовищі, використовуючи індан як джерело вуглецевого живлення [10]. Структурна подібність індану та о-кси ло лу да ла підста ви при пус ти ти, що ен зи ми, які ка -талізують перетворення о-ксилолу, задіяні також у метаболізмі індану. Для перевірки
цього припущення мутантний штам Rhodococcus sp. DK180, не спроможний катаболі-зувати о-ксилол, вирощували на середовищі з інданом. Відсутність росту штаму DK180 на інданвмісно му се ре до вищі під твер ди ла висунуте авторами припущення. У ході досліджен ня бу ло та кож зап ро по но ва но шлях розк ла ду інда ну Rhodococcus sp. DK17, що починається з його ароматичного окиснення до 4,5-індадіолу з наступним роз-ри вом аро ма тич но го кіль ця у ме та по ло -женні під дією метилкатехол-2,3-діоксиге-нази [10]. Також відомо, що змішана культура Pseudomonas sp. NBM21 та Rhodococcus sp. BTO62 у разі вирощування у біофільтрі здатна до розкладу суміші о-, м- та n-ксилолу зі швидкістю 180 г/м3/год при 20 °С та 100 г/м3/год при 10 °С, що значно перевищує зафіксовані раніше значення — 60-78 г/м3/год [9].
Фенол та подібні йому ароматичні сполуки є заб руд ню валь ни ми ре чо ви на ми, що над хо дять у довкілля пе ре важ но з про мис -ловими відходами. Rhodococcus erythropolis UPV-1 здатен використовувати фенол як єдине джерело вуглецю та енергії, одночасно видаляючи формальдегід, що зазвичай також присутній у фенолвмісних стічних водах промислових підприємств [21]. Фенол-гід рок си ла за, що ка талізує пе рет во рен ня фенолу на катехол у R. erythropolis UPV-1, являє собою двокомпонентну флавінзалеж-ну монооксигеназу. Її ензиматична активність пов’язана з двома окремими протеїнами, що ко ду ють ся близь ко роз та шо ва ни ми генами pheAl та pheA2. Ген pheAl кодує протеїн з 542 амінокислот (флавінзалежна мо-нооксигеназа), тоді як ген pheA2 — зі 189 амінокислот (флавінредуктаза). Ці аміно-кис лотні послідов ності прак тич но іден тичні послідов нос тям фе нолгідрок си лаз них ком -понентів R. erythropolis CCM2595 і мають високий ступінь подібності з Nocardia farcini-ca IFM 10152 та R. jostii RHA1 [21].
Інтерес до штаму Rhodococcus sp. RHA1, виділеного із забрудненого гексахлорцикло-гексаном ґрунту, зумовлений його здатністю до ефективної деградації поліхло-рованих біфенілів (ПХБ) — досить поширеного й особливо стійкого класу забруднювальних речовин [8, 13, 16, 18]. Rhodococcus sp. RHA1 є першим представником роду, геном яко го бу ло повністю сек ве но ва но. Вста -новлено, що генетичний матеріал (9,7 Мбіт) штаму RHA1 складається з хромосоми невідо мої то по логії та трь ох ве ли ких лінійних плазмід: pRHL1 (1,100 kb), pRHL2 (450 kb) і pRHL3 (330 kb). Більшість генів,
відповідальних за деградацію ПХБ, розташовані на двох найбільших плазмідах — pRHLl та pRHL2 [16, 18]. Третя, найменша плазміда pRHL3 містить близько 300 генів, об’єднаних у три кластери. Один з катабо -лічних кластерів кодує гени, відповідальні за деградацію лімонену, що було підтверджено ростом штаму RHA1 на середовищах із лімоненом, карвоном або карвеолом як джерелом вуглецю. Окрім того, плазміда pRHL3 також містить ділянку, що кодує стійкість клітини до важких металів, і три гени цитохрому Р450 [18]. Серед генів хромосоми Rhodococcus sp. RHA1 виявлено кластер генів, що кодує ензими розкладу фенілоцтової кислоти. Цей шлях досить повно досліджено у грамнегативних бактерій, тимчасом як дані щодо особливостей його функціону ван ня у грам по зи тив них — майже відсутні. На прикладі цього штаму та інших подібних мож на зро би ти вис но вок, що метаболічна різноманітність бактерій роду Rhodococcus пов’язана з наявністю великих лінійних плазмід та функціональних гомологів ензимів [16].
Афлатоксини — надзвичайно токсичні, мутагенні та потенційно канцерогенні вторинні метаболіти (мікотоксини), синтезовані грибами Aspergillus flavus і Aspergillus parasiticus [1]. Наявність їх у продуктах харчування та зерні створює серйозні економічні та медичні проблеми в усьому світі. Афла-ток си ни є похідни ми ди фу ра но ку ма ри ну і дещо структурно схожі з вищезгаданими ароматичними ксенобіотиками (зокрема, ПХБ), тому можуть бути розкладені аналогічними шляхами. Встановлено здатність безклітинних екстрактів R. erythropolis до ефек тив ної дег ра дації аф ла ток си ну В1 (АФВ1): значне зменшення вмісту АФВ1 спостерігалося вже через 2 год, а через 72 год реєстрували лише 33,2% від початкового вмісту токсину.
Rhodococcus rhodochrous VKM B-2469 здатен повністю розкласти 12-25 мг/л флуорену упродовж 14 днів та кометаболізувати 50-100 мг/л упродовж 2-5 днів за наявності сахарози як косубстрату [22]. Низька розчинність флуорену — велика проблема у процесі його біорозкладу, що призводить до низької біодоступності цієї сполуки як субстрату. У природі більшість мікроорганізмів, які можуть метаболізувати флуорен, продукують поверхнево-активні речовини для підви щен ня йо го біодос туп ності та кра -що го про ник нен ня в кліти ну. Од нак для вдосконалення процесу біоконверсії полі-циклічних ароматичних вуглеводнів мож-
ли ве і зас то су ван ня син те тич них сур фак тан -тів. У разі R. rhodochrous VKM B-2469 внесення Tween 60 у концентрації 1% (об’ємна част ка) суп ро вод жу ва ло ся інтен сифікацією метаболізму флуорену, зниженням його токсичності та підтримки росту штаму завдяки використанню сурфактанту як додаткового дже ре ла вуг ле цю [22].
Оксиди сірки, що утворюються в процесі згоряння палива, призводять до кислотних дощів та забруднення повітря. Тому на су -час но му етапі наф ту підда ють про це су гідро -де суль фу ри зації з ви ко рис тан ням ме та ле -вих каталізаторів за присутності водню під надз ви чай но ви со кою тем пе ра ту рою і тис -ком [11]. У результаті такої обробки можна вилучити різні типи сполук сірки, хоча деякі ге те ро циклічні сірковмісні спо лу ки та -кому видаленню не піддаються. До таких речовин належать дибензотіофен (ДБТ) та його похідні, попередній розклад яких дасть змогу до сяг ти біль шо го сту пе ня де суль фу ри -зації. Одним з підходів до вирішення цієї проб ле ми є біоде суль фу ри зація за до по мо -гою ДБТ-де суль фу ри зу ю чих мікро ор ганіз -мів після стадії фізико-хімічної гідродесуль-фуризації. Із цією метою було ізольовано де які ви ди ме зофіль них та тер мофіль них бак терій, здат них ме та болізу ва ти ди бен -зотіофен: Rhodococcus sp. IGTS8, R.
erythropolis D-1, R. erythropolis H-2, R. erythropolis KA2-5-1, Paenibacillus sp. A11-2, Bacillus subtilis WU-S2B та Mycobacterium phlei WU-F1 [3, 11]. Окрім симетричних похідних ДБТ, у дизельному паливі після гідродесульфуризації виявлено й асиметричні сір ко вмісні ор ганічні спо лу ки, такі як нафтотіофен, бензотіофен та його похідні. Здат ність окис ню ва ти бен зотіофен че рез суль фу рс пе цифічні шля хи при та ман на, наприклад, Gordonia sp. 213E, Rhodococcus sp. T09, Paenibacillus sp. A11-2 [3, 11, 16]. Се лекціоно ва ний штам Rhodococcus sp. WU-K2R розкладає 80% нафтотіофену (0,27 мМ) упродовж 5 діб, що дає змогу розглядати цей штам як потенційно можливий біока-талізатор процесів десульфуризації [11].
Новий бактеріальний штам, ідентифікований як R. aetherivorans IAR1, синтезує полі-(3-гідрок си бу ти рат-3-гідрок си ва -леріат), ви ко рис то ву ю чи то лу ол як єди не джерело енергії [23]. Цей полімер характеризується гнучкістю та міцністю на рівні зі зви чай ни ми пласт ма са ми, але йо го ви роб ни -цт во заз ви чай пот ре бує вне сен ня до ро гих попередників як вторинного джерела вуглецю. Використання толуолвмісних відходів як си ро ви ни для син те зу поліме ру спри я ти ме
по даль шо му зни жен ню ви роб ни чих вит рат по ряд з ефек тив ним ви ко рис тан ням відхо -дів [23].
Бензотіазоли належать до великої родини син те тич них ге те ро циклічних спо лук і використовуються в різних галузях промисловості, наприклад, у виробництві шин як каталізатори процесів вулканізації, як лікарські засоби для лікування латерального аміот рофічно го скле ро зу та хіміоте рапії ра ко вих зах во рю вань, як пес ти ци ди (біоци -ди), а та кож у ви роб ництві азо ба рв ників [2]. Із промислових стічних вод було виділено штам R. rhodochrous OBT18, здатний розкладати похідні бензотіазолу, у тому числі бен-зотіазол, 2-гідроксибензотіазол, 2-амінобен-зотіазол (АБТ) і меркаптобензотіазол [2]. Для підвищення ефективності розкладу бен-зотіазолу запропоновано поєднання фото-та/або біодеградації за присутності комплексу FeHTА (нітрилотриацетат), який є фо-тоіндуктором. За наявності FeHTA, навіть без світла, суттєво збільшувалася швидкість біодеградації АБТ (до 99% за 25 год) [2]. Подальші досліджен ня по ка за ли на явність у R. rhodocrous OBT18 асоційованих із клі-ти на ми по ве рх не во-ак тив них гліколіпідів. Синтез ПАР, очевидно, сприяє біотрансфор-мації гідро фоб них похідних бен зотіазо лу.
Серед сполук, що потрапляють у довкілля в результаті антропогенної діяльності, важливе місце посідають лікарські засоби, які також відомі своєю стійкістю до біодегра-дації [7]. Для посилення біологічного розпаду де я ких фар ма цев тич них пре па ратів ви ко -ристовують явище кометаболізму, додаючи в середовище легкодоступне джерело вуглецю. Так, внесення глюкози дало змогу вилучити 15% карбамазепіну, 14% сульфаметіо-золу або 20% сульфаметоксазолу штамом R. rhodochrous АТСС 13808 [7].
Біодеградація аліфатичних ксенобіо-тич них ре чо вин. Заб руд нен ня ґрун ту й ґрун то вої во ди хлорвмісни ми роз чин ни ка -ми, особ ли во трих ло ре ти ле ном (TXE) стає важ ли вою еко логічною проб ле мою че рез токсичність і стійкість до розкладу [15]. За аеробних умов біологічний розпад TXE відбу ваєть ся пе ре важ но в ре зуль таті ко ме та -болізму з метаном, аміаком, пропаном, фенолом, толуолом або кумолом як ростовим субстратом. Здатність до окиснення толуолу ви яв ле но в ба гать ох бак терій, про те йо го ви -користання як ростового субстрату для кометаболізму TXE стримується високою ток-сич ністю. То му не обхідні аль тер на тивні способи індукції відповідних ензимів у таких бактерій. Попередньо було показано
мож ливість інтен сифікації біорозк ла ду поліхлорованих дифенілів кількома видами бак терій за до по мо гою рос лин них ефірних олій [15]. Чотири компоненти ефірних олій (кумол, карвон, лимонен і пінен) перевірено на здатність індукувати деградацію TXE у R. gordoniae P3 та R. erythropolis BD2. Найбільш ефек тив ним ви я вив ся ку мол, але ви -ко рис тан ня цієї ре чо ви ни об ме же но че рез її по тенційну ток сичність. Такі ре зуль та ти стимулювали пошук нових можливих ін-дук торів се ред рос лин них ефірних олій (кмину, лимону, лемонграсу, м’яти і сосни). Для досліджень було обрано штам Rhodo coc -cus sp. L4, здатний до деградації TXE під час росту на толуолі. За наявності у середовищі олії лимону і лемонграсу клітини штаму за 8 год інкубації здатні до деградації TXE на рівні 20 ± 6% і 27 ± 8% відповідно, що нижче, ніж у разі ви ко рис тан ня то лу о лу як індуктора (57 ± 5%) [15]. Здатність клітин до деградації TXE збільшилася до 36 ± 6% у разі внесення ефірної олії кмину [15].
N-нітрозодиметиламін (HДMА) є сильною кан це ро ген ною ре чо ви ною, що пот рап ляє у довкілля ра зом із про мис ло ви ми стічни ми водами та у питну воду як побічний продукт після дезінфекції хлораміном та іншими дезінфікувальними засобами [6]. У деяких бактерій виявлено монооксигенази із широкою субстрат ною спе цифічністю, здатні розк ла -дати HДMА у процесі кометаболізму — про-панотрофи Rhodococcus sp. RHA1 і Rhodococcus ruber ENV425, а також Mycobacterium vaccae JOB5, Pseudomonas mendocina KR1 і ме та нот роф Methylosinus trichosporium OB3b [6]. У R. ruber ENV425 вста нов ле но специфічний шлях розкладу HДMА, дещо по дібний до денітро зу ю чо го шля ху у ссавців, який каталізується P-450 ізозимами. Так, кінцевими продуктами такого розкладу є закис азоту, нітрит, нітрат, формальдегід, форміат та метиламін. R. ruber ENV425 здатен до зниження концентрації HДMА у середовищі з 8,3 мкг/л до 2 нг/л під час росту на про пані як ос нов но му субстраті [6].
У ході інших досліджень проаналізовано здатність нативної мікрофлори із середземноморської піщаної берегової лінії на північно му уз бе режжі Си цилії до біодег ра дації нафтопродуктів, де реальні аварійні розливи відбулися за 18 місяців до відбору проб [14]. Доміну ю чи ми дест рук то ра ми вуг ле вод нів виявились представники родів Rhodococcus, Gordonia і Nocardia. Усі ізоляти були здатні розкладати аліфатичні компоненти забруднювачів і жоден з них не асимілював ароматичні спо лу ки. Ці конк ретні ак ти но бак -
терії-деструктори н-алканів є перспективними для відновлення піщаних ґрунтів узбережжя Середземного моря, оскільки використання вже акліматизованих автохтонних мікро ор ганізмів завж ди ефек тивніше, ніж інтродукованих деструкторів [14].
Встановлено, що R. erythropolis DCL14 здатен до деградації вуглеводнів (С5-С16) в інтервалі температур 15-28 °С за присутності ви со ких кон це нт рацій хло ри ду натрію (до 2,5%) [24].
Уза галь нені дані що до дест рукції ток -сич них ксе нобіотич них спо лук бак теріями ро ду Rhodococcus на ве де но в табл. 1.
Ви ко рис тан ня предс тав ників ро ду Rhodococcus у про це сах біот ра нс фор мації
Mікроорганізми можуть брати участь у ре акціях транс фор мації (зміна ок ре мих діля нок у мо ле ку лах ор ганічних ре чо вин), пе рет во рю ючи ті чи інші спо лу ки на нові продукти. Умови перебігу цих реакцій м’які, і в багатьох випадках мікробіологічним транс фор маціям відда ють пе ре ва гу пе ред хімічними. Mожливе також використання біологічних процесів у випадках, де прямий хімічний син тез мо ле кул нездійснен ний або неефективний. На сучасному етапі біотранс-формації становлять інтерес у промисловому виробництві з погляду отримання продуктів
з відновної, дешевої органічної рослинної сировини [12, 25].
З ґрунту, де росте хміль, методом накопичувальних культур було виділено штам R. erythropolis MLT1, що використовує ß-мірцен як єдине джерело вуглецю [25]. Після інкубації бактерій у середовищі з 7,4 мМ ß-мірцену визначено основний продукт біотрансформації — гераніол. Цей монотер-пе но вий спирт ши ро ко зас то со ву ють у пар -фумерії, для ароматизації мила та мийних засобів, виробництва інших ароматизованих сполук. Основним способом його промислового отримання є хімічний синтез з ß-пінену і лише незначну частину одержують із природ ної си ро ви ни.
Ще один ароматизатор — R^-карвон — та кож мож на одер жу ва ти біот ра нс фор -мацією (-)-транс-карвеолу [26]. Ефірні олії, що містять багато карвону, використовують у харчовій промисловості, ароматерапії, вони входять до складу освіжувачів повітря тощо. R. erythropolis DCL14 здатен перетворювати (-)-транс-карвеол на R(-)-карвон [87]. Встановлено, що продуктивність утво-рен ня кар во ну в од но фаз но му фер мен тері об’ємом 3 л становила 31 мг/лтод [26]. Ге-терофазне культивування штаму DCL14 за присутності силіконової олії дало змогу підвищити вихід карвону в 2,5 раза [27].
R. opacus B-4, ізольований як стійкий до органічних розчинників мікроорганізм, здатен
Таблиця 1. Деструкція ксенобіотиків бактеріями — представниками роду Rhodococcus
Штам Ксенобіотична сполука Концентрація Ступінь деструкції Література
R. jialingiae djl-6-2 Карбендазим 100 мг/л 94% (60 год) [17]
Змішана культура Pseudomonas sp. NBM21 та Rhodococcus sp. BTO62 Суміш о-, м- та «-ксилолу Біофільтр 180 г/м3/год [9]
Rhodococcus sp. RHA1 Суміш поліхлорованих біфенілів 10 мг/мл 80-100% (72 год) [13]
R. erythropolis DSM 14303 Афлатоксин В1 1,75%о 66,8% (72 год) [1]
R. rhodochrous VKM B-2469 Флуорен 1 mM 100% (24 год) [22]
Rhodococcus sp. WU-K2R Нафтотіофен 0,27 hM 80% (120 год) [11]
R. aetherivorans IAR1 Толуол 10 мл/л 100% (48 діб) [23]
R. rhodochrous OBT18 2-амінобензотіазол 0,5 mM 99% (25 год) [2]
R. rhodochrous АТСС 13808 Карбамазепін 9,5% 15% (28 діб) [7]
Сульфаметіозол 43,4% 14% (12 діб)
Сульфаметоксазол 31,6% 20% (36 діб)
Rhodococcus sp. L4 Трихлоретилен 80 mM 36% (8 год) [15]
R. ruber ENV425 N-нітрозодиметиламін 8,3 мг/л 76% (18 год) [6]
R. erythropolis DCL14 Ыазут 2-32 мл/л 100% (9 міс.) [24]
ви ко рис то ву ва ти як гідрофільні, так і гідро -фобні субстрати [28]. Встановлено, що цей штам може утворювати індиго з індолу та o-крезол з толуолу за одночасного споживання глюкози й олеїнової кислоти. Так, за 12 год R. opacus B-4 утворював індиго і o-крезол (0,217 і 2,12 мг/мл відповідно). Можливість от ри ман ня цих ре чо вин за до по мо гою прос -тих біологічних перетворень є потенційно важливою з практичного погляду, оскільки на сучасному етапі їх одержують складним хімічним синтезом.
Бактерію, що розкладає нікотин, використовуючи його як єдине джерело вуглецю й азоту, було ізольовано та ідентифіковано як Rhodococcus sp. Y22 [29]. Нікотин (1,0 г/л) був метаболізований цим штамом упродовж 52 год при 28 °С та рН 7,0. Встановлено, що кліти ни Rhodococcus sp. Y22 здатні розкладати нікотин як із розчинів, так і з тютюнового листя. Це робить Rhodococcus sp. Y22 можливим біологічним агентом для розкладу нікотину під час оброблення листя тютюну у про цесі про мис ло во го ви роб ни цт ва тю -тю но вих ви робів [29].
Біоди зель, мо но алкілефіри дов го лан цю -гових жирних кислот з коротколанцюговими спиртами, синтезовані з триацилгліцеридів (ТАГ), можуть бути одержані з відновлю-валь них дже рел (рос лин ної біома си). Бак те -рії родів Streptomyces, Nocardia, Rhodococ-cus, Mycobacterium здатні на ко пи чу ва ти ТАГ за ліміту азоту [30]. Встановлення можливості синтезу ТАГ за високих концентрацій глюкози є важливою передумовою для одер жан ня цих спо лук з це лю ло зо- та крох -малевмісної сировини. Показано, що в процесі росту R. opacus PD630 на мелясі вміст ТАГ у клітинах досягає 52% [31]. Такі дані свідчать, що цей штам можна вирощувати на де ше вих дже ре лах вуг ле цю, от ри ма них із сільсь ко гос по дарсь ких куль тур, для ви -роб ни цт ва біоди зель но го па ли ва.
Акрилову кислоту застосовують у виробництві ак ри ло вих ефірів (ме ти лак ри лат, етилакрилат, бутилакрилат і 2-етилгекси-лакрилат), використовуваних для одержання промислових покриттів, клеїв, паперу, текстильних виробів, смол, флокулянтів тощо [32]. По точ ний про мис ло вий по пит на акрилову кислоту задовольняється хімічним синтезом, який базується на каталітично му окис ненні пропіле ну че рез ак ро леїн в одну або дві стадії. Біотехнологічні та біокаталітичні процеси є економічнішими і безпечнішими. Із забрудненого нафтою зразку ґрунту було ізольовано штам, інден-тифікований як Rhodococcus ruber AKSH-84, здатний здійснювати біотрансформацію акрилонітрилу в акрилову кислоту [32]. Порів-ня но з інши ми дже ре ла ми вуг ле цю у разі росту на гліцеролі (10 г/л) спостерігали високу нітрилазну активність, що забезпечувала біоконверсію акрилонітрилу в акрилову кислоту. Молекулярна маса очищеного ензиму становила майже 41 кДа, що близько до молекулярної маси нітрилази R. rhodochrous K22 [33]. Нітрилазі R. ruber AKSH-84 при та ман на ши ро ка субстрат на спе цифіч -ність і здатність гідролізувати різні нітрили (аліфатичні моно- і динітрили, ароматичні, гетероциклічні) у концентрації 100 мМ. Якщо для інтактних клітин ефективність біоконверсії становила 63% (за концентрації акрилової кислоти 126 мМ) через 120 хв, то за ви ко рис тан ня очи ще ної нітри ла зи — 92% за концентрації акрилової кислоти 183 мМ через 30 хв (рис. 1) [32]. Ці дослідження по ка зу ють, що біот ра нс фор мація ак ри ло -нітри лу в ак ри ло ву кис ло ту за до по мо гою нового штаму R. ruber AKSH-84 може бути використана в «зеленому» біосинтезі акри-ло вої кис ло ти [32].
Найк ра щий прик лад про мис ло во го ви -користання нітрилгідратази R. rhodococcus J1 — виробництво акриламіду з акрилоніт-
S
5^
Ч
К
а и:
Ен
'E
С
4
5 і : ft
К
а
ft
CÍ
Я
С
Тривалість інкубації (хв)
Рис. 1. Біотрансформація акрилонітрилу в акрилову кислоту:
а — інтактними клітинами, б — за допомогою очищеної нітрилази Rhodococcus ruber AKSH-84 [32]
б
а
рилу, що на цей час сягає 30 тис. т/рік [3]. Високоактивну нітрилгідратазу, виділену зі штаму R. ruber gt1, іммобілізували на немо-дифікованих оксидах алюмінію і вуглеце-вмісних сорбентах, що супроводжувалося підвищенням у кілька разів її термостабільності [34].
Бу ти рамід — важ ли ва хімічна ре чо ви на, що набула застосування для синтезу гідрокса-мо вих кис лот і ре гу лю ван ня ре о логічних харак те рис тик сис тем під дією елект рич но -го поля. Нітрилгідратаза Rhodococcus rhodochrous PA-34 каталізує перетворення бутиронітрилу в бутирамід [35]. Вихід бути-раміду становив 597 г за таких умов: культивування у ферментері об’ємом 1 л упродовж 6 год при температурі 10 °С, концентрація бутиронітрилу 60% (об’ємна частка) [36]. У ході подальшої роботи штам R. rhodochrous PA-34 було піддано дії хімічного мутагену ^метил-^нітро-^нітрозогу-анідину. Отриманий мутантний штам характеризувався синтезом нітрилгідратази із вдвічі вищою активністю [35]. Такі резуль-та ти відкри ва ють нові мож ли вості для інтен сифікації про цесів біот ра нс фор мації, що відбуваються під дією цього ензиму.
Оскільки робота над дослідженням і вивченням шляхів метаболізму, генів і їх послідов нос тей, струк ту ри спе цифічних ен -зимів та їхньої дії триває, можливі й інші галузі та нап ря ми ви ко рис тан ня бак терій ро ду Rhodococcus.
Прак тич не ви ко рис тан ня ме та болітів, син те зо ва них бак теріями ро ду Rhodococcus
До метаболітів, синтезованих бактеріями роду Rhodococcus, що набули практичного застосування у сучасних технологіях, належать по ве рх не во-ак тивні ре чо ви ни, ек зо -полісахариди, антибіотики і сполуки з антимікробними властивостями та ензими.
Ан тибіоти ки та ан тибіотичні спо лу -ки. З куль ту раль ної ріди ни шта му Rhodo coc -cus jostii K01-B0171 на хроматографічних ко лон ках бу ло виділе но й очи ще но два ан -тимікобактеріальні пептиди, названі ларіа-тин А і ларіатин В [37]. Ці речовини пригнічували ріст Mycobacterium smegmatis за концентрації 3,13 і 6,25 мкг/мл відповідно. Крім того, лариатин А інгібував ріст Mycobacterium tuberculosis за кон це нт рації 0,39 мкг/мл [37].
Інший антибіотик, аурацин RE, було ізоль о ва но з куль ту раль ної ріди ни R. ery-thropolis JCM 6824 [38]. За хімічною приро-
дою аурацин RE подібний до аурацину C — антибіотика, синтезованого Stigmatella aurantiaca [39]. Однак порівняно з аураци-ном C, RE при та ман на шир ша та сильніша ан ти бак теріаль на дія на грам по зи тивні бак -терії [38].
Rhodococcus fascians — відо мий фіто па -тоген, що вражає як покритонасінні, так і голонасінні рослини [40-43]. У лабораторних умо вах куль ти ву ван ня цих бак терій синтезу антибіотиків не спостерігали, доки їх не помістили в умови жорсткої конкуренції, вирощуючи спільно зі Streptomyces pada-nus [44]. Синтезовані за таких умов речовини, названі родострептоміцинами, належать до того самого класу аміноглікозидів, що й стрептоміцин. Уже перші ж тести показали, що родострептоміцини ефективно знищують пов’язані з гастритом і виразкою шлунка бактерії Helicobacter pylori й не інактиву-ються в умовах підвищеної кислотності (на-п рик лад, за при сут ності шлун ко во го со ку).
Екзополісахариди. Відомо, що бактеріям роду Rhodococcus при та ман на здатність до синтезу екзополісахаридів (ЕПС) [45-47]. Так, бензентолерантний штам Rhodococcus sp. 33 може утворювати значну кількість позаклітинного полісахариду, який було названо «33 EPS». Він сприяє підвищенню стійкості клітин про ду цен та до бен зи ну, особ ли во на по чат ко вих ета пах взаємодії з токсичною сполукою. Встановлено, що цей ЕПС складається з D-галактози, D-глюкози, D-манози, D-глюкуронової кислоти та піро-ви ног рад ної кис ло ти у мо ляр но му
співвідношенні 1:1:1:1:1 [46].
R. rhodochrous S-2 синтезує позаклітинний полісахарид масою в кілька мільйонів дальтон, що складається з D-глюкози, D-га-лактози, D-манози, D-глюкуронової кислоти у молярному співвідношенні 1:1:1:1 [47]. У його структурі було також виявлено 0,8% (масова частка) октадеканової та 2,7% (масова частка) гексадеканової кислот. Показано, що за присутності цього ЕПС дикі штами родококів, не здатні засвоювати вуглеводні нафти, набувають такої здатності. Подальші дослідження показали, що додавання ЕПС штаму S-2 до забрудненої нафтою морської води підвищувало деградацію поліарома-тичних вуглеводнів нафти, супроводжувалося емульгуванням нафти і збільшенням кількості морських бактерій, що розкладають поліароматичні вуглеводні [45].
Ензими. Мікробні холестериноксидази каталізують окиснення й ізомеризацію хо-лестеролу. Інтерес до цих ензимів полягає пе ре дусім у мож ли вості ви ко рис тан ня їх
для визначення холестеролу в біологічних зразках, харчових продуктах, а також у біо-конверсії багатьох 3в-гідроксистероїдів у органічні розчинники [48]. R. erythropolis ATCC 25544 синтезує асоційовану з клітинами (55% ) та позаклітинну (45% ) холестерол-оксидазу, Rhodococcus sp. 501 — позаклітинну холестеролоксидазу за умов росту на середовищі з холестеролом як єдиним джерелом вуглецю [49].
Бактерії роду Rhodococcus також синтезують ще один практично цінний ензим — кокаїнестеразу (КокЕ), яку останнім часом розглядають як потенційний терапевтичний агент для ліку ван ня пе ре до зу ван ня та ко -каїнової залежності [50, 51]. КокЕ безпосередньо розкладає кокаїн у неактивні про-дук ти, тим ча сом як тра диційні підхо ди вимагають блокади кокаїну на безлічі моно-амінних транспортерів та іонних каналів. Повноцінності нативної форми КокЕ перешкоджає його інактивація при 37 °С. У ході селективної роботи було отримано мутантний штам, що продукує термостабільну форму цього ензиму Coce-l169K/G173Q [50]. Кінетичні дослідження in vitro показують, що період напіврозпаду Coce-l169K/G173Q становить 2,9 доби при 37 °С, що в 340 раз більше, ніж для нативної форми. Отже, головні пе реш ко ди для клінічно го зас то су ван -ня Ко кЕ по ля га ють у йо го тер мо нес табіль -ності, швидкій деградації циркулюючими протеазами і потенційній імуногенності. Для розв’язання цих проблем було вирішено модифікувати ензим приєднанням поліети-ленгліколю (ПЕГ). Отримані дані свідчать, що така модифікація сприяє захисту КокЕ від теплової деградації та дії протеаз. Окрім того, попередні результати in vivo доводять, що ПЕГ-форма КокЕ, як і нативна КокЕ, змог ли за хис ти ти тва рин від спри чи не них ко каїном от руй них ефектів [51].
Поверхнево-активні речовини. Представ ни ки ро ду Rhodococcus є відо ми ми про -дуцентами поверхнево-активних та емульгу-вальних речовин, яким притаманний значний прак тич ний по тенціал.
Перші статті, у яких були описані представ ни ки ро ду Rhodococcus як про ду цен ти ре чо вин із по ве рх не во-ак тив ни ми влас ти -востями, з’явилися у 70-80-х роках ХХ ст. [52-54]. Відтоді було проведено значну тео-ре тич ну та прак тич ну ро бо ту з досліджен ня ПАР-синтезувальної здатності цих бактерій. Так, було визначено, що за хімічною природою синте зо вані ро до ко ка ми по ве рх не во-ак -тивні речовини є трегалозоміколатами, вста нов ле но за ко номірності їх син те зу, ме -
ханізми дії та роль для клітин [55-59]. Бактерії роду Rhodococcus розг ля да ють як про -ду цен ти прак тич но цінних ре чо вин з емуль -гу валь ни ми та по ве рх не во-ак тив ни ми властивостями в узагальнюючих оглядах [55, 57].
Деякі ПАР, синтезовані родококами, є навіть ефективнішими за синтетичні або взагалі не мають синтетичних аналогів [58, 59].
Однак якісний склад ПАР різних видів та штамів відрізняється. Зокрема, у R. ery-thropolis 51T7 ПАР — трегалозотетраефір, що складається із шести компонентів: одного великого та п’яти менших, при цьому гідрофобна складова містить від 9 до 11 атомів вуг ле цю [60]. ПАР, ут во рю вані R. fascians A-3, — це рамновмісні гліколіпіди
[61]. R. erythropolis 3C-9 утворює 2 типи ПАР: вільні жирні кислоти та гліколіпіди
[62]. Виявлено щонайменше 12 видів вільних жирних кислот С9-С22 та 2 види гліколі-підів: глюколіпіди та трегалозоліпіди, які, окрім вуглеводної складової, також відріз-ня ють ся кількістю не на си че них жир них кислот та довжиною їхніх ланцюгів, що входять до складу ліпідної складової ПАР [62]. R. ruber продукує ПАР, основними компонентами яких є вільні жирні кислоти [63]. R. fascians DSM 20669 синтезує типові для родококів поверхнево-активні трегалозолі-пі ди [64].
Водночас у складі ПАР Rhodococcus sp. TW53 не бу ло ви яв ле но тре га ло золіпідів [65]. У ре зуль таті екстракції ць о го комп лек -су ПАР сумішшю хло ро форм/ме та нол/во да та подальшого хроматографічного аналізу основну його складову було визначено як ліпопептид, а отже, TW53 є першим відомим предс тав ни ком бак терій ро ду Rhodococcus, що його синтезує. Було запропоновано назву — родофактин. Визначення ліпофільної фракції показало, що ліпопептид містить принаймні шість жир них кис лот з дов жи ною лан цю га С14-С19, серед яких насичені кислоти становлять 81,44% , а пальмітинова кислота — більшу частину (58,62% від загальної кількості). Гідрофіль ний фраг мент ліпо пеп ти ду складається з п’яти видів амінокислот: Аlа-Ile-Asp-Met-Pro. Mінімальне значення поверхневого натягу очищеного родофакти-ну становило 30,7 мН/м [65].
Rhodococcus wratislaviensis BN38 син те -зує ПАР за присутності лімітуючих концентрацій азоту і лише на гідрофобних субстратах, використовуючи н-алкани — від н-октану до н-гептадекану [66]. Аналіз показав, що за хімічною природою утворювані ПАР являють собою 2,3,4,2'-трегалозотетра-
ефір, в якому вуглецеві атоми у положеннях
2, 3 і 4 етерифіковані залишками октанової кис ло ти, а мо ле ку ляр на ма са ста но вить 876 г/моль. Виявлено також слідові кількості іншого 2,3,4,2'-тетраефіру трегалози з молекулярною масою 849 г/моль. Поверхневий натяг води поступово знижувався зі збільшенням концентрації ПАР від 72 мН/м до 24,4 мН/м і за концентрації від 5 мг/л ККM залишався постійним [66].
Субстрат, ви ко рис то ву ва ний про ду цен -том як дже ре ло вуг ле цю, пев ною мірою впливає на структуру і властивості ПАР. Зок ре ма, ріст R. erythropolis ATCC 4277 на гліце ролі приз во дить до вивіль нен ня в куль -ту раль ну ріди ну ре чо вин з по ве рх не во-ак -тивними властивостями, зазвичай зв’язаними з клітинною стінкою [67].
Rhodococcus sp. TA6 було виділено із забрудненого нафтою іранського ґрунту [68]. Штам син те зує по заклітин ний комп лекс по -ве рх не во-ак тив них ре чо вин із мо но гліце ри -дів, дигліцеридів, гліколіпідів та міколової кислоти. Подальші дослідження показали, що ПАР, ут во рені TA6, ви яв ля ють емуль гу -валь ну спе цифічність що до дов го го лан цю го -вих вуглеводнів, здатні утворювати стабільні емульсії з різних вуглеводнів — від пентану до легкого моторного мастила [68].
У наших попередніх дослідженнях із забруднених нафтою зразків ґрунту і води було виділено штам нафтоокиснювальних бактерій, іден тифіко ва ний як Rhodococcus erythropolis E^1 [69]. Штам зареєстровано в Депозитарії мікроорганізмів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України за номером ШВ Ас-5017.
Вста нов ле но здатність шта му R. erythropolis ШВ Ас-5017синтезувати метаболіти з по ве рх не во-ак тив ни ми і емуль гу -валь ни ми влас ти вос тя ми під час рос ту на гідрофільних (глюкоза, етанол) та гідрофобних (рідкі парафіни, гексадекан) субстратах [70-72]. Порівняно з відомими продуцентами ПАР штам має такі переваги: синтезує ПАР на середовищі з низьким вмістом солей (3 г/л), не пот ре бує фак торів рос ту, ха рак те ри зуєть ся високим виходом ПАР від субстрату (до 70%).
Показано, що R. erythropolis ШВ Ас-5017 синтезує як вільні, так і асоційовані з клітинами ПАР, які за хімічною природою є комплексом гліко-, фосфо- і нейтральних ліпідів зі сполуками полісахаридно-протеїнової природи [70, 71]. Гліколіпіди представлені тре-галозомоно- і диміколатами, фосфоліпіди — фосфатидилгліцеролом, фосфатидилетано-ламіном, дифосфатидилгліцеролом, нейтральні ліпіди — цетиловим спиртом,
пальміти но вою кис ло тою, ме ти ло вим ефі -ром н-пентадеканової кислоти, тригліцери-дами, міколовими кислотами та ін.
Вста нов ле но мож ливість інтен сифікації син те зу ПАР оп тимізацією умов куль ти ву -вання продуцентів як у колбах, так і в лабораторному ферментері [70-73], внесенням у середовище з етанолом чи гексадеканом С4-дикарбонових кислот (попередників глю-конеогенезу) і цитрату (регулятора синтезу ліпідів) [74-77], модифікацією середовища на основі дослідження особливостей метаболізму гексадекану в штаму ШВ Ас-5017 (зни жен ня в се ре до вищі куль ти ву ван ня вмісту інгібіторів і підвищення активаторів ключових ензимів біосинтезу ПАР) [78].
Так, виз на чен ня оп ти маль них умов культивування R. erythropolis ШВ Ас-5017 на етанолі (концентрація субстрату 2% , концентрація KNO3 — 1,5 г/л, тривалість культивування — 168 год) дало змогу утричі підвищити синтез ПАР [70]. Mаксимальний син тез ПАР під час куль ти ву ван ня R. erythropolis ШВ Ас-5017 на гексадекані в колбах на качалці спостерігався за таких умов: концентрація гексадекану 2%,
співвідношення С/N = 49:1, джерело азоту NaNO3, наявність у середовищі іонів заліза, коефіцієнт масообміну 0,14 г 02/л год, тривалість культивування 168 год [71].
Встановлено, що катіони калію є інгібіторами алкангідроксилази і НАДФ+-залежної альдегіддегідрогенази, а катіони натрію — активаторами цих ензимів у штаму ШВ Ас-5017 [78]. Зниження в середовищі культи ву ван ня кон це нт рації катіонів калію до 1 mM, підвищення вмісту катіонів натрію до 35 mM, внесення 36 мкмоль/л іонів заліза (II), не обхідно го для функціону ван ня ал кан -гідроксилази, супроводжувалося збільшенням активності ензимів метаболізму н-гек-са де ка ну, а та кож підви щен ням у 4 ра зи кількості синтезованих ПАР [78].
Необхідним етапом розроблення технології мікробного синтезу є масштабування процесу на ферментаційному обладнанні. Куль ти ву ван ня про ду цен та у фер мен тері дає змогу також дослідити вплив на біосинтез таких важливих параметрів, як аерація, швидкість перемішування, режим внесення субстрату, рН та ін., що суттєво підвищує ефек тивність тех но логії.
Незважаючи на велику кількість публікацій, присвячених дослідженням мікробних ПАР [55, 57, 79-82], відомості про масштабування технологій їх біосинтезу чи особ ли вості ут во рен ня цих про дуктів мік -роб но го син те зу у про цесі куль ти ву ван ня
мікроорганізмів-продуцентів у лабораторних біореакторах нечисленні [55, 67, 83-86]. Перші такі повідомлення з’явилися наприкінці 70-х — у середині 80-х років ХХ ст. і стосувалися масштабування процесів біосинтезу поверхнево-активних трегалозоліпі-дів [52] і рамноліпідів [87, 88]. Пізніше відомості про культивування у біореакторах бактерій роду Rhodococcus — продуцентів ПАР було підсумовано в огляді [55]. Проте зазначимо, що дотепер у літературі є дуже мало даних про біосинтез ПАР родококами у біореакторах. Можливо, однією з причин цього є той факт, що ПАР-синтезувальна здатність предс тав ників ро ду Rhodococcus де що ниж ча, ніж про ду центів інших по ве рх -нево-активних гліколіпідів (рамно-, софоро-, манозоеритритоліпіди). Окрім того, недоліком ро до ко ків як про ду центів ПАР є по віль -ний ріст і, як наслідок, висока тривалість процесу біосинтезу цільового продукту. Так, під час культивування R. erythropolis АТСС 4277 упродовж 51 год у ферментері об’ємом 1,5 л на середовищі з гліцеролом (15 г/л) кількість син те зо ва них ПАР ста но ви ла ли -ше 1,7 г/л [67]. У разі використання як джерела вуглецю н-алканів (20 г/л) кількість ПАР, утворюваних R. erythropolis DSM 43215 у біореакторі (50 л) на 36-ту-38-му год росту, досягала 2 г/л [52], а під час культивування цього самого штаму у ферментері об’ємом 20 л упродовж 160 год на середовищі, що містило 100 г/л н-алканів, — 32 г/л [55]. Штам R. erythropolis SD-74 через 240 год вирощування у біореакторі об’ємом 5 л синтезував з 80 г/л н-гексадекану до 40 г/л ПАР [55]. У більшості випадків високої концентрації ПАР було досягнено під час син те зу цих спо лук іммобілізо ва ни ми клі -ти на ми бак терій ро ду Rhodococcus чи клітинами, які перебували у стані спокою.
Нещодавно з’явилося повідомлення про штам Rhodococcus sp. Moj-3449, який харак-
теризувався високою швидкістю росту (до 0,2 год-1) на середовищах з 180 г/л алканів чи сирої нафти [89]. Проте в цій роботі відсутня інформація про здатність штаму Moj-3449 до синтезу ПАР.
Наші дослідження щодо утворення ПАР у процесі періодичного культивування R. erythropolis ШВ Ас-5017 у ферментері АК-210 на середовищі з н-гексадеканом показали, що максимальні показники синтезу ПАР (кон це нт рація по заклітин них ПАР 7,2 г/л, індекс емульгування культуральної рідини 50%, вихід ПАР від субстрату 50%) спостерігалися за концентрації розчиненого кисню 60-70% від насичення повітрям, рН 8,0, поетапної подачі субстрату порціями по 0,3-0,4% кожні 5-6 год до кінцевої концентрації 2,4% (об’ємна частка) та використанні 10% інокуляту, вирощеного до середини екс по ненційної фа зи на се ре до вищі з 1,0% н-гексадекану [73]. Реалізація про-це су біосин те зу ПАР на фер мен таційно му обладнанні дала змогу підвищити у 2 рази кількість син те зо ва них ПАР і ско ро ти ти у 3,5 раза тривалість культивування проду-цен та порівня но з ви ро щу ван ням у кол бах на качалці [73].
У табл. 2 на ве де но порівняльні по каз ни -ки синтезу ПАР штаммом ШВ Ас-5017 та інши ми предс тав ни ка ми ро ду Rhodococcus під час куль ти ву ван ня в біоре ак то рах на се -редовищах з н-алканами. Як свідчать наведені дані, селекціонований нами штам R. erythropolis ШВ Ас-5017 не поступається, а за де я ки ми по каз ни ка ми пе ре ви щує відомі продуценти. Так, у процесі вирощування штаму ШВ Ас-5017 у біореакторі (у встанов-ле них оп ти маль них умо вах) син те зу ють ся переважно позаклітинні ПАР, тимчасом як для інших родококів у літературі (табл. 2) наводиться концентрація сумарних поверхне во-ак тив них ре чо вин (як асоційо ва них із кліти на ми, так і по заклітин них).
Таблиця 2. Порівняльні показники синтезу ПАР під час культивування R. erythropolis ІМВ Ас-5017 та інших представників роду Rhodococcus у біореакторах
Штам, література Джерело вуглецю, концентрація, г/л Біомаса, г/л ПАР Тривалість процесу, год
г/л вихід, % (від субстрату) г / г біомаси
DSM 43215 [52] С12-С18- н-алкани; 20,0 19,0 2,0 10 0,11 38
DSM 43215 [55] С10-н-алкани; 100,0 8,0 32,0 32 4,0 160
SD-74 [55] н-гексадекан; 80,0 12,0 40,0 50 3,3 240
ШВ Ас-5017 [73] н-гексадекан; 14,4 1,7 7,2 50 4,2 48
Подальші наші дослідження показали можливість інтенсифікації синтезу ПАР Я. вгуШтороШ ІМВ Ас-5017 за наявності у середовищі з етанолом цитрату (регулятор синтезу ліпідів) і фумарату (попередник глюконеогенезу) [74, 75, 77]. Збільшення на 40-100% показників синтезу ПАР за умови внесення цитрату (0,1%) і фумарату (0,2%) на початку стаціонарної фази росту продуцента зумовлено активацією глюконеогене-тич ної гілки обміну і по си лен ням син те зу лі -підів, про що свідчило підвищення в 1,4-1,5 і 3,4-3,6 раза активності ізоцитратліази
і фосфоенолпіруватсинтетази, відповідно, а також зниження в 1,5-1,6 раза активності ізо цит рат дегідро ге на зи [74, 75].
Підвищення синтезу ПАР Я. єгуШгороШ ІМВ Ас-5017 за умови внесення у середовище з н-гексадеканом фумарату і цитрату спричинено інтенсифікацією синтезу поверх-нево-активних трегалозоміколатів, про що свідчи ло збіль шен ня у 3-5 раз ак тив нос ті фосфоенолпіруватсинтетази і трегалозофос-фат син та зи порівня но з ви ро щу ван ням шта -му на н-гексадекані [78].
Практичне використання ПАР родоко-ків. У класичних методах мікробної інтенсифікації наф то ви до бут ку мікро ор ганізми синтезують полімери і поверхнево-активні речовини, які знижують поверхневий натяг між фазами нафта-ґрунт, що сприяє вилученню нафти [90]. Такі мікроорганізми мають бути стійкими до суворих екологічних умов нафтородовищ, у тому числі й до високої температури, тиску, солоності й низької аерації [90]. Тому перспективнішим є застосування у процесах нафтовидобутку мікробних ПАР замість живих мікроорганізмів [68].
ПАР бактерій роду ЯНойососсиэ можна ефективно використовувати у природоохо-рон них тех но логіях, зок ре ма, для очи щен ня ґрунту та води від нафти [3, 20, 56, 58, 59]. Доведено, що внесення ПАР родококів у ґрунт призводить не тільки до підвищення ступеня біодеградації нафти, а й до суттєвого збіль шен ня по пу ляцій бак терій, які бе -руть участь в окисненні сирої нафти. Під дією по ве рх не во-ак тив них ре чо вин бак терій роду ЯНойососсиэ також починається розкладання ароматичних та аліфатичних вуглеводнів і на 20-25% прискорюється процес біологічно го очи щен ня [20].
У наших дослідженнях [69] показано можливість очищення води, забрудненої нафтою (100-200 мг/л), іммобілізованими на керамзиті клітинами Я. єтуШтороШ ІМВ Ас-5017. Ступінь очищення води від нафти за швидкості подачі води 0,68 л/хв, аерації
0,1 л /л за хв та періодичному додаванні 0,01% діамонійфосфату становив 99,5-99,8%. Вста-нов ле но, що за при сут ності у на ко пи чу -вальній культурі нафтоокиснювальних бактерій штаму Rhodococcus erythropolis ІМВ Ас-5017 і екзогенних ПАР, синтезованих Pseudomonas sp. PS-27, ефективність розк -ладання сирої нафти (2%) досягала 93-94% [91]. Ступінь деструкції нафти (2,6 г/л) у воді за присутності суспензії клітин R. erythropolis ІМВ Ас-5017 становила 92% через 50 діб [92].
Нас тупні наші досліджен ня по ка за ли перс пек тивність ви ко рис тан ня ПАР R. erythropolis ІМВ Ас-5017 у природоохоронних біотех но логіях для очи щен ня довкілля від нафти. Так, через 30 діб (рис. 2) ступінь деградації нафти (2,6 г/л) у воді за присутності 5% (об’ємна частка) препаратів ПАР у виг ляді пост фер мен таційної куль ту раль ної ріди ни або її су пер на тан та ста но вив 80-93%.
1а 1б 1в
2а 2б 2в
3
Рис. 2. Деструкція нафти різними препаратами поверхнево-активних речовин R. erythropolis ІМВ Ас-5017:
1 — нативна культуральна рідина;
2 — супернатант культуральної рідини;
3 — контроль (без обробки).
Тривалість експозиції: а — 1 доба, б — 12 діб, в — 30 діб
Інтен сифікація дест рукції наф ти зу мов -ле на ак ти вацією при род ної наф то окис ню -вальної мікрофлори під впливом поверхнево-активних речовин.
Через 30 діб ступінь деградації нафти (21,4 г/кг ґрунту) за присутності препаратів Пар я. етуіКтороііз імв Ас-5017 (100-300 мл/кг ґрун ту) у виг ляді пост фер -мен таційної куль ту раль ної ріди ни ста но вив
46-86% (табл. 3). За присутності ПАР R. erythropolis ШВ Ас-5017 у вигляді нативної куль ту раль ної ріди ни (30 мл) відми ван ня піску від нафти (0,1 мл нафти/1 г піску) становив 100%.
ПАР Rhodococcus sp. TA6 [68], ви я ви ли -ся стабільними за високої солоності (10% NaCl), підвищених температур (стабільність влас ти вос тей навіть після ав ток ла ву ван ня при 120 ОС упродовж 15 хв) і в широкому діапазоні рН (4,0-10,0). Препарати ПАР у вигляді культуральної рідини здатні видаляти до 70% нафти із забрудненого піску. Ці дані вказують на потенційну цінність ПАР ТА6 для інтенсифікації процесів нафтовидо-бут ку, особ ли во у ро до ви щах з екстре маль -ни ми умо ва ми [68].
Таблиця 3. Вплив препаратів ПАР R. erythropolis ІМВ Ас-5017 на ефективність очищення ґрунту від нафти
Синтезовані родококами трегалозоліпіди розглядають і як терапевтичні агенти [93, 94]. Гліколіпідний комплекс, синтезований Rhodococcus ruber, нетоксичний і не спричиняє відчутного ефекту на проліферативну активність лейкоцитів периферичної крові [94]. У фракції моноцитів ПАР активізує утворення IL-Ібета і фактора некрозу пух-лин-альфа, не впливаючи на утворення IL-6. У мо но нук ле арній фракції гліколіпід не впливав на продукцію цих цитокінів. Ці результати вказують на перспективи подальших досліджень імуномодулюючої та анти-пухлинної дії препарату ПАР. Гліколіпідний комплекс Rhodococcus ruber IEGM 231 стимулює синтез IL-12, IL-18 та активних форм кис ню кліти на ми врод же но го імуніте -ту [93]. При цьому ПАР неістотно впливав на утворення IL-10 моноцитами та мононук-ле ар ни ми кліти на ми
Перші повідомлення про антивірусні влас ти вості мікроб них ПАР ро до коків з’явилися ще наприкінці 80-х років ХХ ст.
[53, 54]. Так, ПАР R. erythropolis виявляли антивірусну дію щодо простого вірусу герпесу 1 (HSV-1) та вірусу грипу.
Наші дослідження [95-97] показали, що, що препарати ПАР R. erythropolis ШВ Ас-5017 (0,61-2,1 мг/мл) у вигляді суперна-тан та куль ту раль ної ріди ни ви яв ля ють ан -ти мік роб ну дію що до ря ду мікро ор ганізмів (Bacillus subtilis БТ-2, Candida tropicalis ПБТ-5, Candida albicans Д-6, Candida utilis БВС-65, Saccharomyces cerevisiae ОБ-3). Не ви яв ле но інгібу ю чо го впли ву пре па ратів ПАР R. erythropolis ШВ Ас-5017 на клітини
S. cerevisiae ОБ-3 і Escherichia coli IEM-1 та ан ти фун галь ної дії ПАР що до Aspergillus niger Р-3 і Fusarium culmorum Т-7.
Виживання мікробних клітин залежало від концентрації ПАР у препаратах, тривалості експозиції, а також фізіологічного стану тест-культур. Через 2 год оброблення досліджуваними препаратами ПАР спостерігали загибель 97% клітин B. subtilis БТ-2, 85% — C. tropicalis ПБТ-5 і 74% — C. albicans Д-6 [95].
У наших подальших експериментах було встановлено, що ПАР R. erythropolis ШВ Ас-5017 посилюють антимікробну дію олії чайного дерева на певні мікроорганізми (C. albicans, A. niger, S. aureus) завдяки власним як антимікробним, так і емульгувальним властивостям [96, 97]. Показано, що за одночасного внесення у суспензію досліджуваних тест-культур (104-105 клітин/мл) емульсії на основі олії чайного дерева (12,5 мкл/мл) і ПАР (0,43 мг/мл) кількість живих клітин через 15 хв експозиції була на 0,7-66% нижчою, ніж у разі оброблення суспензії мікроорганізмів препаратами олії без поверхнево-активних речовин.
Зазначимо, що поверхнево-активні речовини R. erythropolis ШВ Ас-5017 виявляли антимікробну дію щодо ряду фітопатогенних бактерій — Pseudomonas syringae 8511, Pseudomonas corrugata 9070, Pectobacterium carotovorum 8289, Xantomonas vesicatoria 7790 (рис. 3). Eксперименти показали, що зі збільшенням тривалості експозиції з 1 до 2 год ви жи ван ня X. vesicatoria 7790 і P. syringae 8511 за присутності препаратів ПАР штаму ШВ Ас-5017 (0,8 мг/мл) становило всього 11-12%.
Наведені дані дають змогу розглядати ПАР R. erythropolis ШВ Ас-5017 як перспективні для ви ко рис тан ня не тіль ки у ме ди -цині, а й у сільському господарстві для пригнічення фітопатогенних бактерій.
Рин ко вий інте рес до бак терій ро ду Rhodococcus зу мов ле ний їхніми ши ро ки ми метаболічними можливостями і здатністю до синтезу низки практично цінних мета-
Препарати ПАР Концентрація препаратів ПАР, мл/кг ґрунту Кон це нт -рація залишкової наф ти в пробі, г Ступінь деструкції наф ти,%
Культу-ральна ріди на 100 7,0±0,012 67,3±2,3
200 5,7±0,023 73,4±2,7
300 2,9±0,019 86,4±2,0
Суперна- тант 100 11,6±0,026 45,8±2,1
200 10,4±0,015 51,4±2,2
300 9,3±0,021 56,5±2,7
Контроль 0 21,4±0,015 0
і 70
Xantmonas Pseudomonas PecÊobaiierium. Pseudomonas vesicatoria 7790 syrmgœ 8511 camtovomm. cormgpÈa 9070
8982
Рис. 3. Антимікробна дія ПАР R. erythropolis ІМВ Ас-5017 на деякі фітопатогенні бактерії
болітів: по ве рх не во-ак тив них та емуль гу -валь них ре чо вин, фло ку лянтів, полімерів, антибіотиків, ензимів тощо.
Дані літератури свідчать про величезний потенціал цих бактерій як деструкторів ароматичних, гетероциклічних та аліфатичних
ксенобіотиків — нафталену, ксилолу, толуе-ну, флуорену, ізопрену, індолу, фенолу, вуглеводнів нафти тощо.
Економічно привабливими також є представники роду Rhodococcus, здатні здійснювати біотрансформації — процеси біологічного перетворення сполук, що становлять інтерес у промисловому виробництві продуктів з відновлювальної дешевої рослинної сировини. Так, перспективними є штами ро-до коків, ви ко рис то ву вані для одер жан ня ароматизаторів карвону та гераніолу, а також нікотинредукуючі штами. Застосовуючи біоконверсію різноманітних субстратів представниками цього роду, можна істотно здешевити та полегшити отримання біодизе-ля, бутираміду, акрилової кислоти.
Метаболіти бактерій роду Rhodococcus мо жуть бу ти ефек тив ни ми у при ро до охо рон -них технологіях (ПАР, полісахариди), медицині (ензими, антибіотики, ПАР), промисловості (ензими, ПАР) тощо.
ЛІТЕ РА ТУ РА
1. Alberts J. F., Engelbrecht Y., Steyn P. S. et al. Bio -logical degradation of aflatoxin B1 by Rhodo coc -cus erythropolis cultures // Tnt. J. Food Microbiol. — 2006. — V. 109, N 1-2. — P. 121-126.
2. Chorao C., Charmantray F., Besse-Hoggan P. et al. 2-Aminobenzothiazole degradation by free and Ca-alginate immobilized cells of Rhodococcus rhodochrous // Chemosphere. —
2009. — V. 75, N 1. — Р. 121-128.
3. De Carvalho C. C, da Fonseca M. M. The remarkable Rhodococcus erythropolis // Appl. Microbiol. Biotechnol. — 2005. — V. 67, N 6. — P. 715-726.
4. Di Gennaro P., Terreni P., Masi G. et al. Tdentification and characterization of genes involved in naphthalene degradation in Rhodo -coccus opacus R7 // Tbid. — 2010. — V. 87, N 1. — Р. 297-308.
5. Fernandez de Las Heras L., Garcia Fernandez E., Maria Navarro Llorens J. et al. Morpho logical, physiological, and molecular characterization of a newly isolated steroid-degrading actino-mycete, identified as Rhodococcus ruber strain Chol-4 // Curr. Microbiol. — 2009. — V. 59, N5. — Р. 548-553.
6. Fournier D., Hawari J., Halasz A. et al. Aerobic biodegradation of N-nitrosodimethylamine by the propanotroph Rhodococcus ruber ENV425 // Appl. Environ. Microbiol. — 2009. — V. 75, N 15. — Р. 5088-5093.
7. Gauthier H., Yargeau V., Cooper D. G. Biodegradation of pharmaceuticals by Rhodo coccus rhodochrous and Aspergillus niger by co-metabolism // Sci. Total. Environ. — 2010. — V. 408, N 7. — Р. 1701-1706.
8. Goncalves E. R., Hara H., Miyazawa D. et al. W. Transcriptomic assessment of isozymes in the biphenyl pathway of Rhodococcus sp. strain RHA1 // Appl. Environ. Microbiol. — 2006. — V. 72, N 9. — P. 6183-6193.
9. Kim D., Choi K. Y., Yoo M. et al. Benzylic and aryl hydroxylations of m-xylene by o-xylene dioxygenase from Rhodococcus sp. strain DK17 // Appl. Microbiol. Biotechnol. — 2010. — V. 86, N 6. — Р. 1841-1847.
10. Kim D., Lee C. H., Choi J. N. et al. Aromatic hydroxylation of indan by o-xylene-degrading Rhodococcus sp. strain DK17 // Appl. Environ. Microbiol. — 2010. — V. 76, N 1. — Р. 375-377.
11. Kirimura K., Furuya T., Sato R. et al. Biodesulfu-rization of naphthothiophene and benzothiophene through selective cleavage of carbon-sulfur bonds by Rhodococcus sp. strain WU-K2R // Tbid. — 2002. — V. 68, N 8. — Р. 3867-3872.
12. Martinkova L., Uhnakova B., Patek M. et al. Biodegradation potential of the genus Rhodococcus // Environ. Tnt. — 2009. — V. 35, N 1. — Р. 162-177.
13. Navarro-Lorens J. M., PatrauchanMA, Stewart G. R et al. Phenylacetate catabolism in Rhodococcus sp. strain RHA1: a central pathway for degradation of aromatic compounds // J. Bacteriol. — 2005. — V. 187, N 13. — P. 4497-4504.
14. Quatrini P., Scaglione G., De Pasquale C. et al. Tsolation of Gram-positive n-alkane degraders from a hydrocarbon-contaminated Mediterranean shoreline // J. Appl. Microbiol. — 2008. — V. 104,N 1. — Р. 251-259.
15. Suttinun O., Muller R., Luepromchai E. Trichloroethylene cometabolic degradation by Rhodococcus sp. L4 induced with plant essen-
tial oils // Biodegradation. — 2009. — V. 20, N 2. — Р. 281-291.
16. Van der Geize R., Dijkhuizen L. Harnessing the catabolic diversity of rhodococci for environmental and biotechnological applications // Curr. Opin. Microbiol. — 2004. — V. 7, N 3. — P. 255-261.
17. Wang Z., Wang Y., Gong F. et al. Biodegradation of carbendazim by a novel actinobacterium Rhodococcus jialingiae djl-6-2 // Chemosphere. —
2010. — V. 81, N 5. — Р. 639-644.
18. Warren R., Hsiao W. W., Kudo H. et al. Functional characterization of a catabolic plasmid from polychlorinated- biphenyl-degrading Rhodococcus sp. strain RHA1 // J. Bacteriol. — 2004. — V. 186, N 22.— P. 7783-7795.
19. Robles-Gonzalez I. V., Fava F., Poggi-Varaldo H. M. A review on slurry bioreactors for bioremediation of soils and sediments // Microb. Cell Fact. — 2008. — V. 7:5. doi: 10.1186/1475-2859-7-5.
20. Seo J.-S., Keum Y.-S., Li Q. X. Bacterial degradation of aromatic compounds // Tnt. J. Environ. Res. Public Health. — 2009. — V. 6, N 1. — Р. 278-309.
21. Saa L., Jaureguibeitia A., Largo E. et al. Cloning, purification and characterization of two components of phenol hydroxylase from Rhodococcus ery-thropolis UPV-1 // Appl. Microbiol. Biotechnol. —
2010. — V. 86, N 1. — Р. 201-211.
22. Kolomytseva M. P., Randazzo D., Baskunov B. P. et al. Role of surfactants in optimizing fluorene assimilation and intermediate formation by Rhodococcus rhodochrous VKM B-2469 // Bioresour. Technol. — 2009. — V. 100, N 2. — Р. 839-844.
23. Hori K., Kobayashi A., Ikeda H., Unno H. Rhodococcus aetherivorans TAR1, a new bacterial strain synthesizing poly(3-hydroxybutyrate-co--3-hydroxyvalerate) from toluene // J. Biosci. Bioeng. — 2009. — V. 107, N 2. — Р. 145-150.
24. De Carvalho C. C, da Fonseca M. M. Degradation of hydrocarbons and alcohols at different temperatures and salinities by Rhodococcus erythropolis DCL14 // FEMS Microbiol. Ecol. — 2005. — V. 51, N 3. — P. 389-399.
25. Thompson M. L., Marriott R., Dowle A., Grogan G. Biotransformation of ß-myrcene to geraniol by a strain of Rhodococcus erythropolis isolated by selective enrichment from hop plants // Appl. Microbiol. Biotechnol. — 2010. — V. 85, N 3. — Р. 721-730.
26. Morrish J. L., Daugulis A J. Tnhibitory effects of substrate and product on the carvone biotransformation activity of Rhodo coccus erythropolis // Biotechnol. Lett. — 2008. — V. 30, N 7. — Р. 1245-1250.
27. Morrish J. L., Brennan E. T., Dry H. C., Daugu-lis A. J. Enhanced bioproduction of carvone in a two-liquid-phase partitioning bioreactor with a highly hydrophobic biocatalyst // Biotechnol. Bioeng. — 2008. — V. 101, N 4. — Р. 768-775.
28. Honda K., Yamashita S., Nakagawa H. et al. Stabilization of water-in-oil emulsion by Rhodococcus opacus B-4 and its application to biotransformation //Appl. Microbiol. Biotechnol. — 2008. — V. 78, N 5. — Р. 767-773.
29. Gong X. W., Yang J. K., Duan Y. Q. et al. Tsolation and characterization of Rhodococcus sp. Y22 and
its potential application to tobacco processing // Res. Microbiol. — 2009. — V. 160, N. 3. — P. 200- 204.
30. Kurosawa K., Boccazzi P., de Almeida N. M., Sinskey A. J. High-cell-density batch fermentation of Rhodococcus opacus PD630 using a high glucose concentration for triacylglycerol production // J. Biotechnol. — 2010. — V. 147, N 3-4. — Р. 212-218.
31. Voss I., Steinbuchel A. High cell density cultivation of Rhodococcus opacus for lipid production at a pilot-plant scale // Appl. Microbiol. Biotechnol. —
2001. — V. 55, N 5. — Р. 547-555.
32. Kamal A., Kumar M. S., Kumar C. G., Shaik T. Bioconversion of acrylonitrile to acrylic acid by Rhodococcus ruber strain AKSH-84 // J. Microbiol. Biotechnol. — 2011. — V. 21, N 1. — Р. 37-42.
33. Kobayashi M., Yanaka N., Nagasawa T., Yamada H. Primary structure of an aliphatic nitrile-degra-ding enzyme, aliphatic nitrilase, from Rho do coccus rhodochrous K22 and expression of its gene and identification of its active site residue // Biochemistry. — 1992. — V. 31, N 37. — Р. 9000-9007.
34. Мактмова Ю. Г., Дeмакoв В. А., Манимое А Ю. и др. Каталитические свойства нитрилгидратазы, иммобилизованной на оксидах алюминия и углеродсодержащих адсорбентах // Прикл. биохим. микробиол. — 2010. — T. 46, № 4. — С. 416-421.
35. Pratush A., Seth A., Bhalla T. C. Generation of mutant of Rhodococcus rhodochrous PA-34 through chemical mutagenesis for hyperproduction of nitrile hydratase // Acta Microbiol. Tmmunol. Hung. — 2010. — V. 57, N 2. — Р. 135-146.
36. Raj J., Seth A., Prasad S., Bhalla T. C. Bioconversion of butyronitrile to butyramide using whole cells of Rhodococcus rhodochrous PA-34 // Appl. Microbiol. Biotechnol. — 2007. — V. 74, N 3. — Р. 535-539.
37. Iwatsuki M., Uchida R., Takakusagi Y. et al. Lariatins, novel anti-mycobacterial peptides with a lasso structure, produced by Rhodococcus jostii K01-B0171 // J. Antibiot. (Tokyo). — 2007. — V. 60, N 6. — Р. 357-363.
38. Kitagawa W., Tamura T. A quinoline antibiotic from Rhodococcus erythropolis JCM 6824 // Tbid. —
2008. — V. 61, N 11. — Р. 680-682.
39. Kunze B., Hofle G., Reichenbach H. The aurachins, new quinoline antibiotics from myxobacteria: production, physico-chemical and biological properties // Tbid. — 1987. — V. 40, N 3. — Р. 258-265.
40. Cornelis K., Maes T., Jaziri M. et al. Virulence genes of the phytopathogen Rhodococcus fascians show specific spatial and temporal expression patterns during plant infection // Mol. Plant Microbe Tnteract. — 2002. — V. 15, N 4. — Р. 398-403.
41. De O’Manes C. L., Beeckman T., Ritsema T. et al. Phenotypic alterations in Arabidopsis thaliana plants caused by Rhodococcus fascians infection // J. Plant Res. — 2004. — V. 117, N 2. — Р. 139-145.
42. Depuydt S., De Veylder L., Holsters M., Vereecke D. Eternal youth, the fate of developing Arabidopsis leaves upon Rhodococcus fascians infection // Plant Physiol. — 2009. — V. 149, N 3. — Р. 1387-1398.
43. Forizs L., Lestrade S., Mol A. et al. Metabolic shift in the phytopathogen Rhodococcus fascians in response to cell-free extract of infected tobacco plant tissues // Curr. Microbiol. — 2009. — V. 58, N 5. — Р. 483-487.
44. Kurosawa K., Ghiviriga I., Sambandan T. G. et al. Rhodostreptomycins, antibiotics biosynthesized following horizontal gene transfer from Streptomyces padanus to Rhodo coccus fascians // J. Am. Chem. Soc. — 2008. — V. 130, N 4. — Р. 1126-1127.
45. Iwabuchi N., Sunairi M., Urai M. et al. Extracellular polysaccharides of Rhodococ cus rhodochrous S-2 stimulate the degradation of aromatic components in crude oil by indigenous marine bacteria // Appl. Environ. Microbiol. — 2002. — V. 68, N 5. — Р. 2337-2343.
46. Urai M., Aizawa T., Anzai H. et al. Structural analysis of an extracellular polysaccharide produced by a benzene tolerant bacterium, Rho -dococcus sp. 33 // Carbohydr. Res. — 2006. — V. 341, N 5. — Р. 616-623.
47. Urai M., Anzai H., Ogihara J. et al. Structural analysis of an extracellular polysaccharide produced by Rhodococcus rhodochrous strain S-2 // Md. — 2006. — V. 341, N 6. — Р. 766-775.
48. Sojo M. M., Bru R. R., Garcia-Carmona F. F. Rhodococcus erythropolis ATCC 25544 as a suitable source of cholesterol oxidase: cell-linked and extracellular enzyme synthesis, purification and concentration // BMC Biotechnology. — 2002. — V. 2:3. (htpp://www.biomedcentral. oom/1472-6750/2/3).
49. Lashkarian H., Raheb J., Shahzamani K. et al. Extracellular cholesterol oxidase from Rhodococcus sp.: isolation and molecular characterization // Tran Biomed. J. — 2010. — V. 14, N1-2. — Р. 49-57.
50. Brim R. L., Nance M. R., Youngstrom D. W. et al. A thermally stable form of bacterial cocaine esterase: a potential therapeutic agent for treatment of cocaine abuse // Mol. Pharmacol. — 2010. — V. 77, N 4. — Р. 593-600.
51. Park J. B, Kwon Y. M., Lee T. Y. et al. PEGylation of bacterial cocaine esterase for protection against protease digestion and immunogenicity // J. Control Release. — 2010. — V. 142, N 2. — Р. 174-179.
52. Rapp P., Bock H., Wray V., Wagner F. Formation, isolation and characterization of trehalose dimyco-lates from Rhodococcus erythropolis grown on n-alkanes // J. Gen. Microbiol. — 1979. — V. 115, N 2. — P. 491-503.
53. Uchida Y., Misawa S., NakaharaT., Tabuchi T. Factors affecting the production of succinoyl trehalose lipids by Rhodococcus erythropolis SD-74 grown on n-alkanes //Agric. Biol. Chem. — 1989. — V. 53, N 3. — P. 765-769.
54. Uchida Y., Tsuchiya R., Chino M. Extracellular accumulation of mono- and di-succinoyl trehalose lipids by a strain of Rhodococcus erythropolis grown on n-alkanes // Tbid. — 1989. — V. 53, N 3. — P. 757-763.
55. Lang S., Philp J. C. Surface-active lipids in rhodococci // Antonie Van Leeuwenhoek. — 1998. — V. 74, N 1. — P. 59-70.
56. Ron E. Z., Rosenberg E. Biosurfactants and oil bioremediation // Curr. Opin. Biotechnol. — 2002. — V. 13, N 3. — P. 249-252.
57. Rosenberg E., Ron E. Z. High and low molecular mass microbial surfactants // Appl. Microbiol. Biotechnol. — 1999. — V. 52, N 2. — Р. 154-162.
58. Banat I. M., Makkar R. S., Cameotra S. S. Potential applications of microbial surfactants // Tbid. — 2000. — V. 53, N 5. — Р. 495-508.
59. Desai J. D., Banat J. M. Microbial production of surfactants and their commercial potential // Microbiol. Mol. Rev. — 1997. — V. 61, N 1. — P. 47-67.
60. Marques A. M., Pinazo A., Farfan M. et al. The physicochemical properties and chemical composition of trehalose lipids produced by Rhodococ -cus erythropolis 51T7 // Chem. Phys. Lipids. —
2009. — V. 158, N 2. — Р. 110-117.
61. Gesheva V., Stackebrandt E., Vasileva-Tonkova E. Biosurfactant production by halotolerant Rhodo -coccus fascians from Casey Station, Wilkes Land, Antarctica // Curr. Microbiol. — 2010. — V. 61, N 2.— Р. 112-117.
62. Peng F., Liu Z., Wang L., Shao Z. An oil-degrading bacterium: Rhodococcus erythropolis strain 3C-9 and its biosurfactants // J. Appl. Microbiol. —
2007. — V. 102, N 6. — Р. 1603-1611.
63. Philp J. C., Kuyukina M. S., Ivshina I. B. et al. Alkanotrophic Rhodococcus ruber as a biosurfactant producer // Appl. Microbiol. Biotechnol. —
2002. — V. 59, N 2-3. — Р. 318-324.
64. Yakimov M. M., Giuliano L., Bruni V. et al. Characterization of antarctic hydrocarbon-degrading bacteria capable of producing bioemulsifiers // New Microbiol. — 1999. — V. 22, N 3. — Р. 249-256.
65. Peng F., Wang Y., Sun F. et al. A novel lipopeptide produced by a pacific ocean deep-sea bacterium, Rhodococcus sp. TW53 // J. Appl. Microbiol. —
2008. — V. 105, N 3. — Р. 698-705.
66. Tuleva B., Christova N., Cohen R. et al. Production and structural elucidation of trehalose tetraesters (biosurfactants) from a novel alkanothrophic Rhodococcus wratislaviensis strain // Tbid. — 2008. — V. 104, N 6. — Р. 1703-1710.
67. Ciapina E. M., Melo W. C., Santa Anna L. M. et al. Biosurfactant production by Rhodococcus erythro-polis grown on glycerol as sole carbon source // Appl. Biochem. Biotechnol. — 2006. — V. 131, N 1-3. — Р. 880 -886.
68. Shavandi M., Mohebali G., Haddadi A. et al. Emulsification potential of a newly isolated biosurfactant-producing bacterium, Rhodococcus sp. strain TA6 // Colloids Surf. B. Biointerfaces. —
2011. — V. 82, N 2. — Р. 477-482.
69. Пирог Т. П., Шeвчук Т. А., Волошина И. H., Грє-гирчак H. H. Иснользование иммобилизирован ных на ке рам зи те кле ток неф те о кис ляю-щих микроорганизмов для очистки воды от нефти // Прикл. биохим. микробиол. — 2005. — T. 41, № 1. — С. 58-63.
70. Пирог Т. П., Шeвчук Т. А., Волошина И. H., Кар-пєнко Е. И. Образование новерхностно-актив-ных веществ при росте штамма Rhodococcus erythropolis ЭК-1 на гидрофильных и гидрофоб-
ных субстратах // Там же. — 2004. — Т. 40, №5. — С. 544-550.
71. Пирог Т. П., Волошина И. H., Игнатенко С. В., Вильданова-Марцишин P. И. Некоторые зако-но мер нос ти син те за по ве рх но ст но-ак тив ных веществ при росте штамма Rhodo coc cus erythropolis ЭК-1 на гексадекане // Биотехнология. — 2005. — № 6. — С. 27-36.
72. Пирог Т. П., Ігнатенко С. В., Тара^нко Д. О. Вплив якості посівного матеріалу на синтез по-ве рх не во-ак тив них ре чо вин шта мом
Rhodococcus erythropolis E^1// Mікробіол. журн. — 2008. — T. 70, № 4. — С. 9-17.
73. Пирог Т. П., Игнатенко С. В. Mасштабирование процесса биосинтеза поверхностно-активных веществ Rhodococcus erythropolis ЭК-1 на гексадекане // Прикл. биохим. микробиол. — 2011. — Т. 47, № 4. — С. 436-442.
74. Пирог Т.П.,КоржЮ.В.,Шевчук Т.А., Тарасенко Д.О. Роль екзогенних попередників в утворенні поверхнево-активних речовин під час культивування Rhodococcus erythropolis E^1 на етанолі // Ыікробіол. журн. — 2008. — Т. 70, № 6. — С. 11-18.
75. Пирог Т. П., Корж Ю. В., Шевчук Т. А., Тара^н-ко Д. А Особенности С2-метаболизма и интенсификация синтеза поверхностно-активных веществ у штамма Rhodococcus erythropolis ЭК-1, растущего на этаноле // Mикробиология. — 2008. — Т. 77, № 6. — С. 749-757.
76. Пирог Т. П., Ігнатенко С. В. Mікробні поверхнево-активні речовини: проблеми промислового виробництва // Біотехнологія. — 2008. — Т. 1, № 4. — С. 29-38.
77. Пирог Т. П., Тара^нко Д. А Влияние фумаратаи цитрата на образование поверхностно-активных веществ штаммом Rhodococcus erythropolis ЭК-1 // Биотехнология. — 2008. — № 3. — С. 48-55.
78. Пирог Т. П., Шевчук Т. А., Клименко Ю. А. Интенсификация синтеза поверхностно-активных веществ нри культивировании Rhodococcus erythropolis E^1 на гексадекане // Прикл. биохим. микробиол. — 2010. — Т. 46, № 6. — С. 651-658.
79. Kuyukina M. S., Ivchina I. B., Philp J. C. et al. Recovery of Rhodococcus erythropolis biosurfactants using methyl-tertiary butyl ether (MTBE) extraction // J. Microbiol. Methods. — 2001. — V. 46, N 2. — P. 149-156.
80. Mukherjee S., Das P., Sen R. Towards commercial production of microbial surfactants. // Trends in Biotechnology. — 2006. — V. 24, N 11. — Р. 509-515.
81. Singh A., Van Hamme J. D., Ward O. P. Surfactants in microbiology and biotechnology: Part 2. Applications aspects // Biotechnol. Adv. — 2007. — V. 25, N 1. — P. 99-121.
82. Rodrigues L., Banat I. M., Teixeira J., Oliveira R. Biosurfactants: potential applications in medicine // J. Antimicrob. Chemother. — 2006. — V. 57. N 4. — P. 609-618.
83. Adamczak M., Bednarski W. Tnfluence of medium composition and aeration on the synthesis of biosurfactants produced by Candida antarctica // Biotechnol. Lett. — 2000. — V. 22, N 1. — P. 313-316.
84. Rau U., Nguyen L. A., Roeper H. et al. Downstream processing of mannosylerythritol lipids produced by Pseudozyma aphidis // Eur. J. Lipid. Sci. Technol. —
2005. — V. 107, N 2. — P. 373-380.
85. Chen S. Y., Wei Y. H., Chang J. S. Repeated pH-stat fed-batch fermentation for rhamnolipid production with indigenous Pseudomonas aeruginosa S2 // Appl. Microbiol. Biotechnol. — 2007. — V. 76, N 1. — P. 67-74.
86. Barros F. F. C., Ponezi A. N., Pastore G. M. Production of biosurfactant by Bacillus subtilis LB5a on a pilot scale using cassava wastewater as substrate // J. Tnd. Microbiol. Biotechnol. —
2008. — V. 35, N 9. — P. 1071-1078.
87. Guerra-Santos L., Kappeli O, Fiechter A. Pseudomonas aeruginosa biosurfactant production in continuous culture with glucoseas carbon source // Appl. Environ. Microbiol. — 1984. — V. 48, N 2. — P. 302-305.
88. Reiling H. E., Thanei-Wyss U, Guerra-Santos L. H. et al. Pilot plant production of rhamnolipid biosurfactant by Pseudomonas aeruginosa // Tbid. — 1986. — V. 51, N 5. — P. 985-989.
89. Binazadeh M., Karimi L. A., Li Z. Fast biodegradation of long chain n-alkanes and crude oil at high concentrations with Rhodococcus sp. Moj-3449 // Enzyme Microb. Technol. — 2009. — V. 45, N 1. — Р. 195-202.
90. Youssef N., Simpson D. R., Duncan K. E. et al. Tn situ biosurfactant production by Bacillus strains injected into a limestone petroleum reservoir // Appl. Environ. Microbiol. — 2007. — V. 73, № 4. — Р. 1239-1247.
91. Карпенко Е. В., Вильданова-Марцишин P. И., Щеглова H. С. и др. Перспектива использования бактерий рода Rhodococcus и микробных поверхностно-активных веществ для деградации нефтяных загрязнений // Прикл. биохим. микробиол. —
2006. — Т. 42, № 2. -С. 175-179.
92. Морозова А П. Дослідження здатності поверхнево-активних речовин Rhodococcus erythropolis E^1 до активації деструкції нафти у воді // Xар-чова промисловість. — 2008. — № 7. — С. 36-39.
93. Chereshnev V. A., Gein S. V., Baeva T. A. et al. Modulation of cytokine secretion and oxidative metabolism of innate immune effectors by Rhodococcus biosurfactant // Bull. Exp. Biol. Med. — 2010. — V. 149, N 6. — Р. 734-738.
94. Kuyukina M. S., Ivshina I. B., Gein S. V. et al. In vitro immunomodulating activity of biosurfactant glycolipid complex from Rhodococcus ruber // Tbid. — 2007. — V. 144, N 3. — Р. 326-330.
95. Пирог Т. П., Конон А Д., Софілканич А П., Скоч-ко А Б. Антимікробна дія поверхнево-активних ре чо вин Acinetobacter calcoaceticus K-4 та Rhodococcus erythropolis EK-1 // Mікробіол. журн. — 2011. — T. 73, № 3. — С. 14-20.
96. Пирог Т. П., Конон А. Д., Скочко А. Б. Ви ко рис -тання мікробних новерхнево-активних речовин у біології та медицині // Біотехнологія. —
2011. — T. 4, № 2. — С. 24-38.
97. Конон А Д., Пирог Т. П. Поверхнево-активні речовини Rhodococcus erythropolis E^1, їх внлив на антимікробні властивості ефірної олії чайного дерева // Xарчова та переробна промисловість. —
2010. — №3 (367). — С. 25-27.
БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ ПОТЕНЦИАЛ БАКТЕРИЙ РОДА RHODOCOCCUS И ИХ МЕТАБОЛИТОВ
Т. П. Пирог М. А.. Шулякова Т. А. Шевчук А. П. Софилканич
Национальный университет пищевых технологий, Киев
E-mail: [email protected]
Собственные экспериментальные результаты авторов и данные литературы демонстрируют большой биотехнологический потенциал бактерий рода Rhodococcus как деструкторов ароматических, гетероциклических и алифатических ксенобиотических соединений (наф-тален, ксилол, толуол, этилбензен, индол, нит-ро фе нол, трих ло рэ ти лен, уг ле во до ро ды неф ти и др.), а также как продуцентов практически ценных метаболитов (поверхностно-активные вещества, антибиотики, экзополисахариды, энзимы). Поверхностно-активные вещества (ПАВ) являются чрезвычайно важными про-дук та ми мик роб но го син те за, поскольку име ют такие существенные преимущества перед синтетическими аналогами, как биодеградабель-ность, устойчивость в широком диапазоне температур, рН, а также могут быть синтезированы из отходов других производств. Рассматривается использование метаболитов родококков в природоохранных технологиях, медицине, сельском хозяйстве, а также участие представителей рода Rhodococcus в процессах биотрансформации для получения ароматизаторов (карвон, гераниол), биодизеля, бутирамида, акриловой кислоты и др.
Обобщены собственные экспериментальные дан ные по ин тен си фи ка ции син те за и практическому применению ПАВ Rhodococcus erythropolis ИМВ Ас-5017. Установлено, что в при су т ствии как кле ток, так и внек ле точ ных метаболитов штамма ИМВ Ас-5017 с поверхностно-активными и эмульгирующими свойствами степень деструкции нефти в воде и почве достигала 80-93% на 30-е сутки. Показано, что ПАВ R. erythropolis ИМВ Ас-5017 характери зу ют ся ан ти мик роб ным действи ем по от но -ше нию к ря ду мик ро ор га низ мов, в том чис ле и фитопатогенным бактериям. При обработке (1-2 ч) препаратами ПАВ суспензии исследуемых тест-культур наблюдали снижение количества жизнеспособных клеток на 74-97%.
Ключевые слова: бактерии рода Rhodococcus, дест рук ция ксе но би о ти ков, би от ра нс фор ма -ция, поверхностно-активные вещества, полисахариды, энзимы.
BIOTECHNOLOGICAL POTENCIAL OF BACTERIA OF RHODOCOCCUS STRAIN AND THEIR METABOLITES
T. P. Pirog M. O. Shulyakova T. А. Shevchuk A. P. Sofylkanich
National University of Food Technologies, Kyiv
E-mail: [email protected]
The literature and own experimental data, concerning biotechnological potential of bacteria of Rhodococcus strain as destructors of aromatic, heterocyclic and aliphatic xenobiotic compounds (naphtalet, xylol, toluene, ethylbenzene, indole, nitrophenolum, trichloroethylene, hydrocarbons of oil, etc.), and also as producers of valuable metabolites (surfactants, antibiotics, exopolysaccharides, enzymes) are given. Surface-active substances (surfactants) are essential products of microbial synthesis, as these have significant advantages over synthetic analogs as biodegradability, stability over a wide range of temperature, pH, and can be produced from the wastes of other industries. The use of Rhodococcus metabolites in environmental protection technologies, medicine, agriculture, and also participation of Rhodococcus strain in biotransformation processes for production of flou-ver (carvon, geraniol), biodiesel, butiramide, acrylic acid, etc. is discussed.
The own experimental data concerning the intensification of Rhodococcus erythropolis IMV Ас-5017 surfactant synthesis and practical application are summarized. It was determined that the oil destruction degree in water and soil reached 80-93% on the 30th day in the presence of cells of strain IMV Ас-5017, as well as exocel-lular metabolites with surface-active and emulsifying properties. It was shown that surfactant of R. erythropolis IMV Ac-5017 inherent the antimicrobial activity against the number of microorganisms, including phytopathogenic bacteria. The reduction of quantity of living cells by 74-97% was observed after treatment (1-2 h) of suspension of test-cultures with surfactant preparations.
Key words: bacteria of Rhodococcus strain, destruction of xenobiotics, biotransformation, surfactants, polysaccharides, enzymes.
