Микробные поверхностно-активные вещества. I. гликолипиды Текст научной статьи по специальности «Сельское хозяйство, лесное хозяйство, рыбное хозяйство»

REVIEWS

УДК 759.873.088.5:661.185

МІКРОБНІ ПОВЕРХНЕВО-АКТИВНІ РЕЧОВИНИ. I. ГЛІКОЛІПІДИ

Т. П. ПИРОГ, А. Д. кОНОН Національний університет харчових технологій, Київ, Україна E-mail: [email protected]

Отримано 07.03.2013

Огляд присвячено поверхнево-активним речовинам гліколіпідної природи. Подано загальну характеристику й описано фізіологічну роль рамноліпідів, трегалозоліпідів, софороліпідів, манозилеритритолліпідів та їхніх традиційних продуцентів — представників родів Pseudozyma, Pseudomonas, Rhodococcus і Candida. Докладно розглянуто хімічну структуру, етапи біосинтезу і регуляції деяких низькомолекулярних поверхнево-активних речовин гліколіпідної природи.

Підсумовано експериментальні дані авторів щодо інтенсифікації синтезу, фізіологічної ролі та практичного використання поверхнево-активних речовин Rhodococcus erythropolis ІМВ Ас-5017, Acinetobacter calcoaceticus ІМВ В-7241 та Nocardia vaccinii ІМВ В-7405, які за хімічною природою є комплексом гліко-, фосфо-, аміно- і нейтральних ліпідів (гліколіпіди всіх штамів представлені трегалозоміколатами).

З’ясовано, що поверхнево-активним речовинам R. erythropolis ІМВ Ас-5017, A. calcoaceticus ІМВ В-7241 та N. vaccinii ІМВ В-7405 притаманні протекторні (захист клітин продуцента від дії важких металів), а також антимікробні й антиадгезивні властивості. Показано, що поверхнево-активні речовини R. erythropolis ІМВ Ас-5017, A. calcoaceticus ІМВ В-7241 та N. vaccinii ІМВ В-7405 у вигляді культуральної рідини інтенсифікують деструкцію нафти у воді унаслідок активації природної нафтоокиснювальної мікрофлори.

Ключові слова: поверхнево-активні речовини, гліколіпіди, біосинтез, промислові відходи.

Мікробні поверхнево-активні речовини (ПАР) належать до структурно різноманітних сполук, що синтезуються мікроорганізмами і складаються з гідрофільної (містить кислоти, пептиди, моно-, ди- та полісахариди) і гідрофобної (насичені й ненасичені вуглеводні та жирні кислоти) частин. Усі ПАР мікробного походження умовно можна поділити на низькомолекулярні (ліпопептиди, гліколіпіди, протеїни), здатні знижувати поверхневий і міжфазний натяг, та високо-молекулярні (полісахариди, ліпопротеїни), що утворюють міцели і мікроемульсії. У зарубіжній літературі перші зазвичай називають біосурфактантами, а другі — біоемуль-гаторами [1].

ПАР мікробного походження є відносно новим продуктом біотехнології, оскільки їх почали активно досліджувати у 70-80 роках ХХ ст. Перші повідомлення про мікробні ПАР датуються 40-ми рр. ХХ ст. [2, 3]. Ці сполуки мають суттєві переваги перед син-

тетичними аналогами, зокрема біодеграда-бельність і нетоксичність, що істотно знижує забруднення довкілля за їх практичного застосування; характеризуються стійкістю в широкому діапазоні температури, pH та солоності середовища; різноманітною біологічною активністю. Унікальність мікробних ПАР полягає в тому, що їх можна використовувати в різних галузях промисловості (харчовій, хімічній та ін.), сільському господарстві, а також у процесах біоремедіації, видобутку нафти, у медицині та фармацевтиці [1, 4-12].

У перших оглядах, присвячених мікробним ПАР, приділяли увагу їх класифікації, хімічній структурі, фізико-хімічним властивостям (здатність до зниження поверхневого натягу, значення критичної концентрації міцелеутворення — ККМ), фізіологічній ролі (емульгування гідрофобних субстратів, участь в адгезії клітин на поверхнях), продуцентам, продуктивності, умовам культи-

вування (живильні середовища, вплив рН, температури), потенційним галузям застосування [13, 14]. У подальших роботах більш детально описано можливість використання ПАР мікробного походження у процесах біо-ремедіації [11], визначено гени та ключові ензими біосинтезу рамноліпідів, описано нові глікогліцероліпіди представників роду Microbacterium, нові продуценти Nocardia sp. L-417, Bacillus subtilis FE-2, Pseudozyma fusiformata VKM Y-2821, Bradyrhizobium japonicum 532C47, Pseudomonas fluorescens 495 та властивості синтезованих ними ПАР [4]. Антимікробна активність ПАР, здатність до зв’язування металів, роль у формуванні біоплівок, русі клітин, їх диференціації, а також практичне застосування досить ґрунтовно розглянуто в роботах [10, 12, 15]. Найсучасніші огляди присвячено подальшому вивченню властивостей гліко-ліпідів (рамноліпіди, трегалозоліпіди, ма-нозилеритритолліпіди, софороліпіди), їхніх традиційних продуцентів (переважно представники родів Pseudomonas, Rhodococcus, Pseudozyma, Candida), а також потенційних сфер застосування [16, 17].

Рамноліпіди

Одними з найвідоміших поверхнево-активних гліколіпідів є рамноліпіди, перші повідомлення про які з’явилися ще в 40-х рр. ХХ ст. [2, 3]. Вони складаються з однієї або двох молекул рамнози, приєднаних до однієї, двох (рідко трьох) молекул Р-гідроксі-аліфатичних кислот [18]. Залежно від кількості молекул вуглеводів і жирних кислот зазвичай розрізняють монорамномоноліпі-ди, монорамнодиліпіди, дирамномоноліпі-ди та дирамнодиліпіди. Понад 60 гомологів рамноліпідів синтезується представниками роду Pseudomonas, серед яких найповніше вивченими є P. aeruginosa, а також бактеріями, що належать до інших родин, класів і навіть відділів [19]. У літературі описано фізико-хімічні властивості рамноліпідів [20], можливість їх використання у процесах біоремедіації [21] та підвищення нафтовидобутку [22]. Зважаючи на високу антимікробну та антиадгезивну активність [23, 24] ці поверхнево-активні речовини можна застосовувати як компоненти мийних засобів, а також у косметичній та фармацевтичній промисловості [1]. Окрім того, рамноліпіди синтезуються з відходів інших виробництв або відновлювальних ресурсів, є біодеградабельними та нетоксичними [25, 26]. У роботах останніх років [18] розглядаються шляхи підвищення біосинтетичної

активності в результаті генетичних модифікацій штамів P. aeruginosa; оптимізації процесу біосинтезу P. aeruginosa; одержання рекомбінантних штамів-продуцентів серед P. putida та E. coli.

У літературі детально розглянуто також шляхи регуляції біосинтезу рамноліпідів [18, 27, 28], їхню хімічну структуру, фізіологічну роль та різноманітність самих продуцентів [19, 22, 29-33].

Хімічна структура. Перші дослідження було присвячено визначенню хімічної структури рамноліпідів P. pyocyanea (на цей час P. aeruginosa). Встановлено, що ці ПАР є дирамнодиліпідами і являють собою

2-O-a-1,2-L-рамнопіранозил-a-L-рамнопі-ранозил-Р-гідроксидеканоїл-Р-гідрокси-де-каноат [3, 34, 35]. Пізніше було описано й інші гліколіпіди зі схожою структурою [36], а також монорамнодиліпіди [36, 37] та рамноліпіди, що містять тільки одну Р-гідрокси-деканову кислоту [38].

Значний прорив у вивченні хімічної структури рамноліпідів у 90-х рр. ХХ ст. був пов’язаний з використанням нових методів, зокрема високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ), мас-спектрометрії та їх комбінації. Усього було описано 28 сполук рамноліпідної природи [39].

В останнє десятиліття визначено структуру монорамноліпідів штамів P. aeruginosa, до складу яких входять поліненасичені Р-гід-роксижирні кислоти C8.2 та C12.2 [20, 40], а також дирамноліпідів з мононенасиче-ними ланцюгами C1G-C1G.1 та C12 C12.1 [41]. Встановлено, що Pseudomonas chlororaphis NRRL B-30761 синтезує кілька гомологів, що складаються з C1G-C14.1,C12-C12.1 та C1G-C14 [42], P.aeruginosaLBI — Cg C1g*1,C1g C1g*1 та C12-C12.1 [30], мутантний надпродуцент P. aeruginosa MIG-N146 — C14.2 та C1G.1-C8 [43]. Використання протонного ядерно-магнітного резонансу, мас-спектрометрії у поєднанні з іонізуючим електророзпиленням, а також тандемної мас-спектрометрії дало змогу визначити хімічну структуру моно- та дирамноліпідів, синтезованих двома новими штамами P. aeruginosa, виділеними з бразильської нафти [31]. Методами тонкошарової хроматографії, ВЕРХ, рідинної хроматографії з мас-спекторометрією, протонного ядерно-магнітного резонансу досліджено дирамноліпіди P. aeruginosa ATCC 10145, синтезовані на середовищі з пересмаженою олією [33].

У 90-х рр. ХХ ст. описано хімічну структуру рамноліпідів Burkholderia glumae та Burkholderia sp. [44]. Пізніше з’явили-

ся відомості про те, що B. pseudomallei та B. plantarii синтезують дирамноліпіди з C14-C14 ланцюгами [45, 46]. Останній штам здатен синтезувати ПАР з однією або трьома молекулами P-гідрокситетрадеканової кислоти. B. thailandensis синтезує нові гомологи моно- та дирамноліпідів із C1G-C12,C12-

C12,C12-C14,C14-C14,C14-C16 та C16-C16 ланцюгами жирних кислот, а B. pseudomallei — з аналогічною комбінацією C12, C14 та C16 аліфатичних кислот [47].

Отже, рамноліпіди складаються із залишків рамнози (полярна група) та ліпідних фрагментів (неполярна група), з’єднаних О-глікозидним зв’язком. Полярна група містить один (монорамноліпід) або два (ди-рамноліпід) рамнозних залишки, з’єднаних між собою a-1,2-глікозидним зв’язком. Неполярна складається з однієї або двох (у деяких випадках трьох) P-гідроксижирних кислот (із насиченими, моно- або поліненаси-ченими ланцюгами завдовжки від С8 до С16), поєднаних один з одним ефірним зв’язком між карбоксильною групою проксимального та P-гідроксильною групою дистального ланцюга. У більшості випадків карбоксильна група дистального ланцюга P-гідрокси-жирної кислоти залишається вільною, проте може мати ефірний зв’язок з короткою алкільною групою. Гідроксильна група біля другого атому вуглецю рамнози зазвичай залишається вільною, хоча у деяких гомологів може бути ацильована довголанцюговою ал-кеновою кислотою. Зміни в структурі полярної та неполярної частини зумовлюють утворення різноманітних гомологів [19].

Продуценти. В останнє десятиліття з’являється дедалі більше інформації про нові продуценти рамноліпідів, відмінні від P. aeruginosa [42, 48, 49]. Деякі з них є представниками відділу Proteobacteria класу Gammaproteobacteria. Так, наприклад, два штами Acinetobacter calcoaceticus належать до порядку Pseudomonadales, родини Moraxellaceae [50]; Pseudoxanthomonas sp. — порядку Xanthomonadales, родини Xanthomonadaceae [51]; Enterobacter sp., Pantoea sp. — порядку Enterobacteriales, родини Enterobacteriaceae [50, 52]. Описано також продуценти серед P. alcaligenes, P. cepacia, P. chlororaphis, P. fluorescens, P. luteola, P. putida та P. stutzeri [25, 42, 48,

49, 53-55].

Продуцентами рамноліпідів є і представники класів Betaproteobacteria (рід Burkholderia) [45, 47] та Deltaproteobacteria, до якого належить, наприклад, Myxococcus sp., що синтезує незвичні рамнозовмісні гліко-

ліпіди, названі міксотирозидами завдяки тирозинпохідній основній структурі, зв’язаній з рамнозою та жирними кислотами — ^)-15-метил-2-гесадекановою і ^)-2-гекса-декановою [56].

Серед представників відділу Actino-bac teria як продуценти рамноліпідів описано Renibacterium salmoninarum [57] та Nocardioides sp. [58], а відділу Firmicutes — Tetragenococcus koreensis [59].

Важливими є дослідження, присвячені вивченню консорціуму бактерій Enterobacter cloacae та Pseudomonas sp. (ERCPPI-2), здатного до синтезу суміші екзополісахариду (43,4% вуглеводів, 20,9% протеїнів і 9,1% уронових кислот) та ПАР рамноліпідної природи (33,6% вуглеводів, 61,7% ліпідів і 5,3% протеїну) за екстремальних умов. температура до 70 “C, тиск — до 41,4 МПа, солоність — до 15%, рН 4-10 [22].

Отже, рамноліпіди синтезуються широким колом продуцентів, що належать не тільки до різних класів, а й навіть відділів.

Властивості. Актуальним залишається питання визначення ролі рамноліпідів для власних продуцентів. Добре відомо, що рамноліпіди, як й інші ПАР, переводять гідрофобні субстрати у доступну для клітин форму, їм притаманні антимікробна та ан-тивірусна дія, здатність до лізису зооспор та участь у формуванні біоплівок [14, 15]. У сучасній літературі доповнено відомості про дію рамноліпідів на клітини про- та евка-ріотів, описано роль у русі клітин та механізми утворення біоплівок [19]. Детально роль рамноліпідів висвітлено в огляді [29].

Етапи та регуляція біосинтезу. Найповніша інформація про біосинтез рамноліпідів з’явилася в останні роки. Встановлено, що він відбувається у три етапи [60, 61].

1) синтез димерів жирних кислот з P-гід-роксижирних кислот за участю RhlA (кодується геном rhlA) [62, 63];

2) утворення монорамноліпіду з дТДФ-L-рамнози та димерів жирних кислот під дією мембранної RhlB рамнозилтрансферази (кодується геном rhlB) [64];

3) синтез дирамноліпіду через приєднання дТДФ^-рамнози до монорамноліпіду за участю RhlC рамнозилтрансферази (кодується геном rhlC) [65].

Біосинтез дТДФ^-рамнози відбувається в реакціях гліколізу або глюконеогенезу і розпочинається з D-глюкозо^-фосфату, що під дією фосфоглюкомутази AlgC перетворюється на D-глюкозоЛ-фосфат [66] (рисунок). Під дією глюкозо-1-фосфаттимідилілтран-сферази (RmlA, КФ 2.7.7.24) відбувається

Схема біосинтезу та регуляції утворення рамноліпідів [18]:

ЛПС — ліпополісахариди;

ЕПС — екзополісахариди;

ПГА — полі(З-полігідроксіалканоат);

НАА — 3-(3-гідроксіалканоїлоксі)алканові кислоти; ГСЛ — гомосеринлактон;

ГАХ — 4-гідрокси-2-алкілхінолін

приєднання тимідилмонофосфатного нуклеотиду до D-глюкозоЛ-фосфату з утворенням дТДФ^-глюкози. дТДФ^-глюкозо-4,6-де-гідратаза (RmlB, КФ 4.2.1.46) каталізує окиснення C4 гідроксильної групи D-глюко-зи з подальшою дегідратацією, що зумовлює утворення дТДФ-4-кето-6-дезокси^-глюко-зи [67].

На наступному етапі дТДФ-4-кето-6-де-зокси-D-глюкозо-3,5-епімераза (RmlC, КФ 5.1.3.13) відповідає за подвійну реакцію епі-меризації у положенні C3 та C5 4-кето-6-де-зокси^-глюкози [68], а утворена дТДФ-4-кето-6-дезокси^-маноза під дією редуктази (RmlD, КФ 1.1.1.133) втрачає кетогрупу в положенні C4 і перетворюється на дТДФ-L-рамнозу [68].

За біосинтез ліпідної частини рамноліпі-дів відповідають класичні синтетази ІІ типу (FAS II), що контролюються fab-генами [19, 69], а проміжними продуктами біосинтезу є ацил-АПБ, P-кетоацил-АПБ та P-гідроксі-ацил-АПБ (рис.).

Встановлено, що за другу реакцію відповідає FabG P-кетоацил-АПБ-редуктаза [63, 70], а не RhlG, як вважали раніше [71]. RhlAB (рамнозилтрансфераза 1) каталізує утворення P-гідроксіалканоїл-P-гідроксіал-каноїл-АПБ (або -КоА) з подальшим приєднанням дТДФ^-рамнози і утворенням монорамноліпіду [62, 63], а RhlC (рамно-зилтрансфераза 2) відповідає за приєднання другої молекули активованої рамнози з наступним синтезом дирамноліпідів [65].

Біосинтез рамноліпідів тісно пов’язаний із синтезом інших метаболітів полісахарид-ної природи (ліпополісахариди, екзополіса-хариди, флагеліни) [72-74] та метаболітів, структурними одиницями яких є P-гідроксі-алканові кислоти [наприклад, полі(3-полі-гідроксіалканоат)] [66].

Регуляція синтезу рамноліпідів у P. aeru-gi nosa відбувається під час утворення як вуглеводної частини, так і ліпідної. Каталітична активність RmlA піддається ало-стеричній регуляції кінцевим продуктом (дТДФ^-рамнозою) [75], проте загалом біосинтез контролює складна система [18, 28, 60]. До цієї системи належать регуляторні протеїни (автоіндуктори), зокрема N-ацил-гомосеринлактон (ГСЛ), що здійснюють контроль регуляції кворумзалежних генів. У псевдомонад існують дві сигналпровідні системи las та rhl [76].

Система las залежить від синтезу N-3-оксо-додеканоїл-ГСЛ (3-O-C12-ГCЛ), а rhl — N-бу-таноїл-ГСЛ (Q-ГСЛ). За синтез цих двох ав-тоіндукторів відповідають синтази LasI та

RhlI (рис. ). Крім того, у P. aeruginosa утворюється 4-гідрокси-2-алкілхінолін [77]. Усі ці регуляторні протеїни відповідають за активацію задіяних у синтезі рамноліпідів генів. оперона rhlAB та генів rhlC [64].

Слід зазначити, що за рахунок такого розташування генів (оперонна структура rhlAB та окреме місце rhlC в геномі), відповідальних за синтез рамнозилтрансфераз, P. aeruginosa синтезує суміш моно- та ди-рамноліпідів, тимчасом як P. chlororaphis продукує лише моногліколіпіди. Припускають, що в цього штаму відсутні гомологи rhlC-гена [42].

Тривалий час вважали, що представники роду Burkholderia продукують тільки дирамноліпіди, що зумовлено розміщенням в одному кластері генів, які відповідають за їх синтез. Проте у роботі [47] описано штам

B. thailandensis, який здатен утворювати й моногліколіпіди у незначній концентрації. У роботі [27] досліджено регуляцію транскрипції оперона rmlBDAC, відповідального у P. aeruginosa за синтез ензимів, що беруть участь в утворенні dTDP-L-рамнози. Встановлено, що один із трьох промоутерів цього оперона залежить від фактора а (S) та RhlR/ Q-ГСЛ.

Оптимізація умов культивування та створення рекомбінантних продуцентів

Основним підходом до підвищення продуктивності диких штамів псевдомонад є оптимізація умов культивування. Так, для P. aeruginosa проводять дослідження з підбору оптимальних компонентів живильного середовища, концентрації [61, 78-88], способів культивування [81, 86, 89, 90].

Синтезувальна здатність штамів P. aeruginosa коливається в широких межах. від 6 до 112 г/л (періодичне) та від 5 до 95 г/л (напівбезперервне культивування) [18]. За використання для культивування P. aeruginosa BYK-2 KCTC 18012P живильного середовища з 25 г/л риб’ячого жиру та 0,01% сечовини (масова частка) і відпрацьованої соняшникової олії (6% , масова частка) та нітрату натрію (1%, масова частка) для вирощування P. aeruginosa WJ-1 спостерігали максимальний вихід (YRL/S = 0,75 та 0,84 г/г, відповідно) [81, 87].

У роботах останніх років описано низку штамів P. aeruginosa — ефективних продуцентів рамноліпідів. Так, під час культивування у колбах на качалці (200 об/хв) P. aeruginosa UCP0992 синтезував до 8 г/л

ПАР через 96 год при 28 “С на середовищі, що містило 3% гліцеролу та 0,6% NaNO3. Одержані рамноліпіди знижували поверхневий натяг до 27,4 мН/м, емульгували гексадекан (Е72 75-80%), були стійкими за температури 4-120 “С, рН 4-і2 та концентрації солі 2-10% [85]. За умов росту на середовищі з глюкозою штам P. aeruginosa S6 синтезував рамнолі-піди, що знижували поверхневий натяг до 33,9 мН/м, значення ККМ становило 50 мг/л, емульгували сиру нафту, солюбілізували фенатрен і були стійкими у широкому діапазоні рН та солоності [88]. Одним із перспективних субстратів для одержання рамноліпідів є екстракт із тропічної рослини маніоки їстівної. Під час культивування P. aeruginosa L2-1 на цьому субстраті відбувалося зниження поверхневого натягу до 30 мН/м, ККМ становила 30 мг/л, а індекс емульгування соєвої олії — 100% [79]. Значної продуктивності штаму P. aeruginosa PAO1 вдалося досягти за культивування в лабораторному ферментері об’ємом 30 л із соняшниковою олією як джерелом вуглецю. При цьому максимальна концентрація цільового продукту становила 36 г/л, продуктивність — 0,43 г/(лтод), вихід біомаси — 3,15 г/г [82]. Використання флокуляції для виділення рамноліпідів, синтезованих іммобілізованими клітинами P. aeruginosa DSM 2874 у10 л ферментері, дало змогу одержати до 70 г ПАР після чотирьох циклів [91]. Штам P. aeruginosa WJ-1, ізольований із місць нафтових розробок тропічної зони на півночі Китаю, синтезував 50,2 г/л рамноліпідів на середовищі з відпрацьованою соняшниковою олією (6%, масова частка), нітратом натрію (1%, масова частка) як джерелом азоту, співвідношенням С/N 8.1, за температури 37 “C, рН 6,0-8,0 та 180 об/хв після 96 год культивування у ферментері об’ємом 10 л. ПАР штаму WJ-1 знижували поверхневий натяг до 24,5 мН/м, ККМ становила 0,014 г/л, а індекс емульгування гасу (E24) — 95% [87]. Для штаму P. aeruginosa RS29 проводили підбір оптимального джерела азоту для синтезу рамноліпідів на середовищі з гліцеролом (2%) [84]. Максимальну концентрацію ПАР (6 г/л), індекс емульгування (E24 80%), зниження поверхневого натягу (26,4 мН/м) спостерігали за використання як джерела азоту нітрату натрію або калію. Синтезовані рамноліпіди були термостабільними (витримували нагрівання до 121 “С упродовж 15 хв), стійкими у широкому діапазоні рН (2-10) і концентрації NaCl (2-10%).

Для продуцентів рамноліпідів процес росту та синтезу ПАР описано математично [82, 90]. Застосування методу повного фак-

торного експерименту (24) дало змогу підвищити синтез рамноліпідів P. aeruginosa AT10 з 3,6 г/л до 18,66 г/л [78] за рахунок визначення оптимальних концентрацій соєвої олії (50 г/л), NaNO3 (4,6 г/л), KH2PO4/K2HPO4 (1 г/л, співвідношення 1.2), FeSO4-7H2O (7,4 мг/л). Аналогічні методи було використано для визначення оптимальної концентрації соєвої олії (22 г/л), NH4NO3 (5,625 г/л) та дріжджового автолізату (11,5 г/л) у живильному середовищі для культивування інших штамів P. aeruginosa [80]. Слід зазначити, що ці дослідження проведено за умов культивування продуцентів у колбах на качалках, проте актуальним є масштабування процесу на обладнання [92, 93].

Оптимізацію умов синтезу рамноліпідів здійснено і для інших представників роду Pseudomonas. Так, для штаму P. nitroreducens AY297786 підбирали оптимальні джерела вуглецю та азоту, а також їх співвідношення [83]. Максимальний синтез ПАР (5,46 г/л) спостерігали за додавання в живильне середовище глюкози (40 г/л) та нітрату натрію (2 г/л) зі співвідношенням С/N 22. Синтезований рамноліпід знижував поверхневий натяг до 37 мН/м, а ККМ становила 28 мг/л.

Створення рекомбінантних продуцентів рамноліпідів розпочалося в середині 90-х рр. ХХ ст. Для цього клітини E. coli та різних представників роду Pseudomonas трансформували ген rhl, виділений з P. aeruginosa [94]. На той час вдалося отримати рекомбі-нантні штами P. fluorescens і P. putida, які синтезували 0,25 і 0,6 г/л рамноліпідів відповідно. Згодом було створено новий продуцент рамноліпідів — штам E. coli BL21 [95]. Найпродуктивнішим серед рекомбінантних продуцентів (7,3 г/л) є штам P. putida KCTC1067, одержаний трансформацією оперона rhlAB та генами rhlI, виділеними з P. aeruginosa EMS1 [96]. Вбудовування не тільки оперона rhlAB, а й генів rmlBDAC дало змогу отримати мутантний штам E. coli, який синтезував

0,12 г/л ПАР [97].

У рекомбінантних продуцентів рамно-ліпідів відсутня складна система регуляції їх біосинтезу, характерна для P. aeruginosa. Ці штами є також непатогенними. Крім того, створено рекомбінантні продуценти P. putida (наприклад, P. putida KT42C1 pVLT31_rhlAB), що майже не синтезують інших побічних продуктів, зокрема полі(3-по-лігідроксіалканоатів) [98]. Проте й дотепер не вдалось одержати рекомбінантні продуценти, які б характеризувалися такою самою високою продуктивністю біосинтезу рамноліпідів, як і природні штами [18, 60].

Трегалозоліпіди

До синтезу трегалозоліпідів здатні представники родів Mycobacterium, Rhodococcus, Arthrobacter, Nocardia та Gordonia. Вперше трегалозодиміколати було виявлено в куль-туральній рідині Arthrobacter paraffineus на середовищі з вуглеводневими субстратами [99], проте найбільш вивченими на сьогодні є трегалозоліпіди родококів. Так, у 1979 р. описано штам R. erythropolis DSM 43215, здатний до синтезу 2,1 г/л ПАР за умов росту на середовищі з 2% (масова частка) C12-C18 н-ал-канів [100]. У 80-х роках ХХ ст. досліджено здатність трегалозоліпідів знижувати між-фазний натяг між водними розчинами солей та гексадеканом до 16-17 мН/м і встановлено ККМ (близько 2 мг/л) [101]. Пізніше було ізольовано штам Rhodococcus sp. 51T7, який синтезував до 3 г/л цих гліколіпідів [102], і показано можливість використання їх для підвищення нафтовидобутку [103].

Розглянуто хімічну структуру та роль трегалозоліпідів [104-109], етапи їх біосинтезу [106-109], а також умови культивування продуцентів [108-116]. Незначну кількість робіт присвячено використанню рекомбі-нантних продуцентів трегалозоліпідів [117].

Хімічна структура та властивості. Тре-галозоліпіди містять дисахарид трегалозу, приєднаний у положеннях С6 та С6' до а-роз-галуженої-^-гідроксикарбонової кислоти,

відомої як міколат — R-CHОH-CHR’-CООH. У 80-х рр. ХХ ст. було описано гліколіпіди R. erythropolis DSM43215, до складу яких входили трегалозо-6-мономіколати, трега-лозо-6,6-діацилати та трегалозо-6-ацилати [101]. Наступні дослідження показали, що Rhodococcus sр. H13-A синтезує неіонні трегалозоліпіди [118], а R. erythropolis S-1 — суміш ацильованих C10-C22 насичених і нена-сичених жирних кислот, C35-C40 міколових кислот, гексан- та додекандикарбонових кислот, 10-метилгекса- та октодеканових кислот

[119]. На початку ХХ ст. було описано тре-галозодиміколати з довголанцюговими (С39) розгалуженими та лінійними (С16) жирними кислотами [106], тетраефіри трегалози [106,

107, 109] та сукционілтрегалозоліпіди [108].

Трегалозоліпіди зазвичай асоційовані з клітинною поверхнею і синтезуються за умов росту продуцентів на вуглеводневих субстратах. Вважають, що функція ПАР полягає у підвищенні доступності малорозчинних субстратів для клітин [104]. Слід зазначити, що поверхневі властивості клітини можна змінювати, розміщуючи на її поверхні більшу або меншу кількість гідрофільних та гідрофобних груп молекул ПАР

[120]. У роботі [105] показано, що поверхня клітини Оогйопіа ер. Б829 мала гідрофобні властивості на початку експоненційної фази росту на гексадекані і змінювала їх на гідрофільні наприкінці цієї фази.

У наших попередніх дослідженнях із забруднених нафтою зразків ґрунту виділено штами нафтоокиснювальних бактерій, ідентифіковані як ІІНо^соссш вгуЛгороШ ЕК-1, АсіпвіоЬасівг саїсоасвист К-4 та Иосатйіа иассіпіі К-8 [121-124]. Штами зареєстровано у Депозитарії мікроорганізмів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України за номерами ІМВ Ас-5017, ІМВ В-7241 та ІМВ В-7405, відповідно.

Встановлено здатність штамів Я. вгуШ-гороШ ІМВ Ас-5017, А. саїсоасвист ІМВ В-7241 та N. иассіпіі ІМВ В-7405 синтезувати метаболіти з поверхнево-активними і емуль-гувальними властивостями під час росту на гідрофільних (глюкоза, етанол, гліцерол) та гідрофобних (рідкі парафіни, н-гексадекан) субстратах [121-124].

Показано, що за хімічною природою ПАР Я. вгуШгороШ ІМВ Ас-5017 становлять комплекс гліко-, фосфо- і нейтральних ліпідів зі сполуками полісахаридно-протеїнової природи [124], ПАР А. саїсоасвисш ІМВ В-7241 [122] та N. иассіпіі ІМВ В-7405 — комплекс гліко-, аміно- та нейтральних ліпідів [121]. Гліколіпіди всіх штамів представлені трега-лозоміколатами (табл. 1).

Більшість представників роду Асіпєіо-Ьаіїєг синтезують високомолекулярні ПАР, яким притаманні емульгувальні, проте не поверхнево-активні властивості [14, 125]. За хімічною природою ці сполуки становлять комплекс позаклітинних полісахаридів і протеїнів. Лише нещодавно [126] з’явилось одне з перших повідомлень про здатність представників роду АсіпвіоЬасівг синтезувати низькомолекулярні ПАР, проте тільки на гідрофобних субстратах. Селекціонований нами штам А. саїсоасвист ІМВ В-7241 синтезує незвичні за хімічним складом ПАР на середовищі з етанолом, причому гліколіпіди (трегалозоміколати) є характерними метаболітами для бактерій роду ЯНойососси^, проте не АсіпвіоЬасівг [14].

Дані про синтез поверхнево-активних речовин представниками роду Nocaгdia вкрай обмежені. Так, у 2000 р. з’явилося перше повідомлення про здатність Nocaгdia ер. Ь-417 синтезувати ПАР (суміш жирних кислот) на гідрофобних субстратах [127]. У сучасних оглядах, присвячених мікробним ПАР, є інформація про здатність бактерій роду Nocaгdia синтезувати поверхнево-активні

Таблиця 1. Хімічний склад поверхнево-активних речовин R. erythropolis ІМВ Ас-5017, A. calcoaceticus ІМВ В-7241 і N. vaccinii ІМВ В-7405 [121]

Штам Джерело вуглецю в середовищі для культивування Гліколіпіди Нейтральні ліпіди Фосфоліпіди Аміно- ліпіди

ІМВ Ас-5017 н-Гексадекан Трегалозомоно-і диміколати Цетиловий спирт, пальмітинова і міколові кислоти Фосфатидил- гліцерол, фосфатидил- етаноламін -

ІМВ В-7241 Eтанол Трегалозомоно-і диміколати; трегалозомоно-та діацелати С13-С18-н-алканоли, С11-С22-н-алканові та міколові кислоти - +

ІМВ В-7405 Гліцерол Трегалозодиміколати і трегалозодіацелати н-Алканові та міколові кислоти - +

гліколіпіди, у тому числі трегалозоміколати [1]. При цьому автори користуються інформацією кінця 80-х років ХХ ст., коли було описано штам Nocaгdia вгуШгороШ — продуцент трегалозоміколатів. Однак згодом штам Nocaгdia вгуЛгороШ рекласифікували як Яhodococcus вгуМгороШ.

Таким чином, наші дані свідчать про здатність представників родів АсіпвіоЬасівг

і ^саМіа синтезувати незвичайні за хімічним складом ПАР на гідрофільних субстратах.

Встановлено, що ПАР штамів ІМВ Ас-5017, ІМВ В-7241 та ІМВ В-7405 захищають клітини продуцентів від впливу важких металів, виявляють антимікробну та антиад-гезивну дію щодо клітин про- та евкаріотів [128-132], а також підвищують ступінь деструкції нафти у воді [133-135].

Так, показано, що за присутності 0,01 мМ Си2+ відбувалася повна загибель клітин Я. вгуШгороШ ІМВ Ас-5017, позбавлених ПАР, тимчасом як за наявності їх виживало до 65% клітин. За дії 0,5 мМ катіонів міді на клітини А. саїсоасвист ІМВ В-7241 виживало 32% клітин, що містили ПАР, натомість без них усі клітини гинули. Стійкішими за присутності ПАР до дії катіонів міді виявилися клітини N. иассіпіі ІМВ В-7405, близько 20% яких виживало навіть за концентрації Си2+ до 2,0 мМ. ПАР досліджуваних штамів здатні захищати клітини продуцентів і від більш токсичних катіонів металів — кадмію та свинцю. Так, у разі дії 0,01 мМ Сё2+ за наявності ПАР А. саїсоасєіісш ІМВ В-7241 виживало 93 % клітин, тоді як без ПАР майже всі клітини гинули. Зі внесенням у суспензію N. иассіпіі ІМВ В-7405 0,3-0,5 мМ Сё2+ та РЬ2+ 100% клітин гинуло, а з додаванням ПАР виживало до 25%.

Встановлено, що ПАР R. ІМВ Ас-5017 (0,61-2,1 мг/мл) та A. calcoaceticus ІМВ В-7241 (0,15-0,22 мг/мл) у вигляді супернатанта культуральної рідини виявляли антимікробну дію щодо низки мікроорганізмів (Bacillus subtilis БТ-2, Escherichia coli ШМ-1, Candida tropicalis ПБТ-5, Candida albicans Д-6, Candida utilis БВС-65, Saccharomyces cerevisiae ОБ-3). Виживання мікробних клітин залежало від концентрації ПАР у препаратах, тривалості експозиції, а також фізіологічного стану тест-культур. Препарати ПАР A. calcoaceticus ІМВ В-7241 спричиняли ефективнішу дію на спори B. subtilis БТ-

2, ніж на вегетативні клітини, знижуючи виживання спорової культури на 75% через

2 год експозиції [130].

Подальші дослідження показали, що ПАР R. erythropolis ІМВ Ас-5017, A. calcoace-ticus ІМВ В-7241 та N. vaccinii ІМВ В-7405 притаманна антимікробна дія і щодо фіто-патогенних бактерій. Так, після оброблення упродовж 2 год препаратами ПАР (0,15-0,4 мг/мл) штамів ІМВ Ac-5017 та ІМВ В-7241 виживання клітин (105-107 в мл) фі-топатогенних бактерій родів Pseudomonas і Xanthomonas становило 0-33%. За присутності як препаратів ПАР (0,085-0,85 мг/ мл), так й інших позаклітинних метаболітів N. vaccinii ІМВ В-7405 кількість клітин більшості досліджуваних фітопатогенних бактерій знижувалася на 95-100%.

Препарати ПАР A. calcoaceticus ІМВ В-7241 (0,28 мг/мл) у супернатанті культу-ральної рідини зменшували кількість прикріплених клітин B. subtilis БТ-2 різного фізіологічного стану на кахлі на 38,7-45,8% і лінолеумі на 79,1-85,8%, E. coli ШМ-1 — на сталі, пластику і кахлі на 41, 15 і 14% відповідно [131]. За оброблення скляних,

пластикових пластинок, а також пластинок з лінолеуму та кахлі препаратами ПАР R. erythropolis ІМВ Ас-5017 (1,25 мг/мл) рівень адгезії досліджуваних тест-культур знижувався на 45-65%. Аналогічні результати було одержано у разі використання розчину очищених ПАР штаму ІМВ Ас-5017 у значно нижчих концентраціях (0,065 мг/мл).

Eфективними виявилися препарати штамів ІМВ Ас-5017, ІМВ В-7241 та ІМВ В-7405 різного ступеня очищення (0,018-0,036 мг/ мл) для запобігання формуванню біоплівок

C. albicans Д-6, B. subtilis БТ-2 та E. coli №М-1 на поверхні матеріалу зубних протезів. Досліджувані речовини знижували кількість адгезованих клітин C. albicans Д-6 на поверхні протезного матеріалу до 80, B. subtilis БТ-2 —

90, E. coli ШМ-1 — 55%.

Оброблення матеріалу урогенітальних катетерів пробами ПАР N. vaccinii ІМВ В-7405 різного ступеня очищення у концентрації

0,05-0,08 мг/мл спричинювало зниження кількості прикріплених клітин C. albicans Д-6, Enterobacter cloaceae К-1, Pseudomonas sp. Н-2 та Proteus vulgaris В-4 до 76-95%.

Встановлено, що ПАР R. erythropolis ІМВ Ас-5017, A. calcoaceticus ІМВ В-7241 та N. vaccinii ІМВ В-7405 у вигляді культураль-ної рідини інтенсифікують процеси деструкції нафти у забрудненій воді [133-135]. На

30-ту добу ступінь очищення води від нафти (2,6 г/л) після оброблення препаратами ПАР (5%, об’ємна частка) становив 83-92%. Інтенсифікація деструкції нафти зумовлена активацією природної нафтоокиснювальної мікрофлори води (збільшення кількості клітин навіть на порядки) під впливом ПАР. Ми вважаємо, що це зумовлено підвищенням біодоступності нафти за рахунок її емульгування ПАР.

Біосинтез. У роботі [13] описано етапи біо синтезу трегалозоміколатів R. erythropolis DSM 43215 з тетрадекану. Детальніше синтез гідрофобної частини трегалозоміколатів досліджено у Mycobacterium tubercolosis під час утворення клітинної стінки [111, 136]. Він відбувається в чотири етапи і починається із синтезу міколових кислот за участю полікетидсинтази 13. Далі міколова група приєднується до D-манопіранозил-1-фосфо-гептапренолу під дією міколілтрансферази І

з утворенням 6-O-міколіл-P-D-манопірано-зил-1-фосфогептапренолу (реакція 1). Остання реагує з трегалозо-6-фосфатом за участю мембранзв’язаного ензиму міколілтрансфе-рази ІІ. Після дефосфорилювання утвореного трегалозомономіколатфосфату синтезується трегалозомономіколат (реакція 2), що

транспортується назовні клітини (реакція

3). При цьому відбувається синтез клітинної стінки бактерії, що складається з комплексу «арабін-галактан-міколат». Екзоензим мі-колілтрансфераза Ag85/Fbp/PS1 завершує її синтез і бере участь в утворенні трегалозоди-міколатів (реакція 4).

Реакції Локалізація

Міколіл-Я-полікетидсинтаза 13 + Б-манопіранозил-1-

1. фосфогептапренол ^ 6-О-міколіл-Р-Б-манопірано-

зил-1-фосфогептапренол.

6-О-міколіл-Р-Б-манопіранозил-1-фосфо-

2. гептапренол + трегалозо-6-

фосфат ^ трегалозо моно міколат. Трегалозомономіколат

3 (усередині клітини) + АТФ ^

3. трегалозомономіколат (зовні клітини) + АДФ + Фн.

Трегалозомономіколат +

4 трегалозомономіколат ^

трегалозодиміколат + трегалоза.

Умови культивування продуцентів

Традиційно для синтезу трегалозоліпідів використовували гідрофобні сполуки, наприклад н-алкани [108, 109, 112-114, 137], проте нещодавно з’явилися повідомлення про одержання ПАР на більш технологічих гідрофільних субстратах. Так, Я. вгуЛгороШ АТСС 4277 синтезував позаклітинні гліколіпіди під час культивування на середовищі з гліцеролом [110].

Наші експерименти показали можливість синтезу поверхнево-активних гліколіпідів під час культивування А. саїсоасвист ІМВ В-7241, N. иассіпіі ІМВ В-7405 і Я. вгуШгороШ ІМВ Ас-5017 на таких гідрофільних субстратах, як гліцерол та етанол, проте концентрація цільового продукту була недостатньо високою [121, 122, 138]. Тому на наступному етапі досліджували можливість інтенсифікації синтезу ПАР внесенням екзогенних попередників біосинтезу та використанням змішаних субстратів, що дає змогу уникнути непродуктивних втрат вуглецю й енергії, що мають місце у разі використання моносуб-стратів, і підвищити ефективність трансформації вуглецю субстратів у цільовий продукт. Одночасне внесення у середовище з гліцеролом або етанолом (1-2%, об’ємна частка) фума-рату і цитрату (0,01-0,02%) супроводжувалося підвищенням у 2-3 рази концентрації

Усередині

клітини.

Транспорт із клітини.

Зовні

клітини.

позаклітинних ПАР А. calcoaceticus ІМВ В-7241 порівняно з культивуванням бактерій на середовищі без органічних кислот [139, 140].

Збільшення синтезу ПАР за таких умов зумовлено одночасним функціонуванням двох анаплеротичних шляхів (гліоксилат-ного циклу і ФЕП-карбоксилазної реакції), а також підвищенням у 3-5 разів активності ензимів біосинтезу поверхнево-активних глі-ко- (ФЕП-синтетаза і ФЕП-карбоксикіназа) і аміноліпідів (НАДФ+-залежна глутамат-дегідрогеназа). За внесення у середовище з етанолом 0,2% фумарату з наступною періодичною регуляцією рН до 8,0 лимонною кислотою спостерігали підвищення концентрації синтезованих Я. егу^гороШ ІМВ Ас-5017 ПАР [141]. Показники синтезу ПАР N. иассіпіі К-8 зростали на 40-50% за внесення на початку стаціонарної фази росту на глі-церолі фумарату (0,1%) і цитрату (0,1%) [142].

Показано можливість інтенсифікації синтезу ПАР під час культивування А. саісо-асеЫсш ІМВ В-7241 і Я. егу^гороі ІМВ Ас-5017 на суміші гексадекану і гліцеролу в концентрації 0,5-1,0% (об’ємна частка). За використання інокуляту, вирощеного на гексадекані, умовна концентрація ПАР

А. calcoaceticus ІМВ В-7241 на змішаному субстраті була на 56-100, а Я. егу^гороі ІМВ Ас-5017 — на 260-320% вищою, ніж на моносубстраті гліцеролі [138].

Застосування лігноцелюлозних, крохма-левмісних субстратів, а також відходів масложирової, молочної, цукрової промисловості для біосинтезу ПАР детально описано в [5], проте інформація про синтез трегалозоліпі-дів на цих субстратах дуже обмежена. Так, Я. егу^гороШ 16 ЬМ.иБТНБ здатен до біокон-версії пересмаженої олії у гліколіпіди, що знижували поверхневий натяг до 31,9 мН/м [116], а Яhodococcus ер. Б832 синтезував позаклітинні ПАР на середовищі з рапсовою олією [115].

Наші експериментальні дані показали, що А. саісоасеист ІМВ В-7241, Я. егу^гороі ІМВ Ас-5017 та N. иассіпіі ІМВ В-7405 можуть синтезувати ПАР на таких відходах виробництв, як рідкі парафіни, пересмажена соняшникова олія (1,5-2,0%, об’ємна частка), а також меляса (1,5-2,0% за вуглеводами, масова частка). Максимальні показники синтезу ПАР спостерігали за культивування штамів ІМВ Ас-5017, ІМВ В-7241 та ІМВ В-7405 на олієвмісних субстратах: підвищення умовної концентрації ПАР в 1,5-2,5 раза порівняно з показниками на середовищі з гексадеканом, етанолом або гліцеролом. У разі використання меляси як джерела вуглецю для шта-

мів ШВ В-7241 та ІМВ В-7405 спостерігали збільшення кількості синтезованих ПАР на 80-196%, а рідких парафінів — на 40% порівняно з вирощуванням на етанол- та гліцерол-вмісних середовищах.

Враховуючи те, що з усіх досліджуваних штамів R. erythropolis ІМВ Ас-5017 синтезував найменшу кількість ПАР на оліє-вмісних субстратах, на наступному етапі досліджували можливість інтенсифікації біосинтезу внесенням у живильне середовище додаткового джерела вуглецю. глюкози (0,1-0,2%) або меляси (0,2-0,4%). Показано, що додавання глюкози на початку процесу або в експоненційній фазі росту продуцента супроводжувалось підвищенням у 2-3 рази концентрації синтезованих ПАР порівняно з показниками на середовищі без вуглеводів. У разі використання меляси замість глюкози за умов росту R. erythropolis ІМВ Ас-5017 на олієвмісних середовищах концентрація синтезованих ПАР та індекс емульгування куль-туральної рідини практично не змінювались [143].

Можливість масштабування процесу на обладнання було встановлено для низки продуцентів трегалозоліпідів. Так, до 40 г/л ПАР синтезував штам R. erythropolis SD-74 під час вирощування у біореакторі (об’єм 5 л) на середовищі з н-гексадеканом (80 г/л) [13], 32 г/л — R. erythropolis DSM 43215 за культивування у 20 л ферментері зі 100 г/л н-алканів [13]. За використання гідрофільного субстрату гліцеролу (15 г/л) під час культивування R. erythropolis АТСС 4277 у ферментері об’ємом 1,5 л кількість синтезованих ПАР становила 1,7 г/л [110].

Нами показано, що реалізація процесу біосинтезу ПАР R. erythropolis ІМВ Ас-5017 на обладнанні (ферментер АК-210) на середовищі з н-гексадеканом дала змогу підвищити у 2 рази кількість синтезованих ПАР і скоротити у 3,5 раза тривалість культивування продуцента порівняно з вирощуванням у колбах на качалці [144]. Максимальні показники синтезу (концентрація позаклітинних ПАР 7,2 г/л, індекс емульгування культуральної рідини 50%, вихід ПАР від субстрату 50%) спостерігали за концентрації розчиненого кисню 60-70% від насичення повітрям, рН 8,0, дробової подачі субстрату порціями по 0,3-0,4% кожні 5-6 год до кінцевої концентрації 2,4% (об’ємна частка) та використанні 10% інокуляту, вирощеного до середини експоненційної фази на середовищі з 1,0% н-гексадекану.

Слід зазначити, що у процесі вирощування R. erythropolis ІМВ Ас-5017 у біореакторі

синтезуються переважно позаклітинні ПАР, тимчасом як для інших родококів — як асоційовані з клітинами, так і позаклітинні поверхнево-активні речовини.

Софороліпіди

Ці ПАР синтезуються переважно дріжджами родів Torulopsis та Candida і містять дисахарид софорозу, який поєднаний глікозидним зв’язком з передостаннім атомом вуглецевого ланцюга жирної кислоти С16-С19 [7, 145]. Уперше ці гліколіпіди було описано у 70-80 рр. ХХ ст. [146, 147]. Інтерес до софороліпідів зумовлений можливістю використання їх як ефективних антиадгезивних агентів, а також препаратів для очищення довкілля від ксенобіотиків [148-152].

У літературі приділяють значну увагу інтенсифікації синтезу ПАР із використанням математичних методів планування експерименту, а також застосуванню новітніх методів для визначення структури синтезованих софороліпідів.

У роботі [148] описано оптимізацію процесу культивування Candida tropicalis UCP0996 на середовищі з пересмаженою соняшниковою олією як субстратом із використанням методу математичного планування. Встановлено, що максимальне зниження поверхневого натягу (до 33,66 мН/м) спостерігали за мінімального вмісту дріжджового екстракту, співвідношення C/Fe та максимального C/P, найвищу концентрацію цільового продукту (3,61 г/л) — за мінімального C/Mg та C/P. Завдяки високим емульгувальним властивостям (Е24 до 94%) ПАР C. tropicalis UCP0996 у вигляді супернатанта культуральної рідини ефективно очищували пісок від нафти та моторної оливи (79-92% відмитого піску).

Використання методу повнофакторного експерименту (23) дало змогу оптимізувати склад живильного середовища для продуцента ПАР Candida glabrata UCP1002. Встановлено, що максимальне зниження поверхневого натягу (до 24 мН/м) та синтез ПАР (до 7 г/л) спостерігали у разі культивування штаму UCP1002 на середовищі з 5% рослинних олій та 2% дріжджового екстракту (масова частка). У складі синтезованих метаболітів виявлено 48% вуглеводів, 34% протеїнів та 18% ліпідів. ПАР не втрачали поверхневої активності у широкому діапазоні солоності (0-10%), рН (2-12) і температури (4-120 °С). Використання 10% супернатанта культуральної рідини сприяло відмиванню 92,6% забрудненого моторною олією (4%) піску через 24 год [149].

В інших дослідженнях [152] показано можливість синтезу 8 г/л ПАР руфісану штамом Candida lipolytica UCP0988 на відходах виробництва соєвої олії. Руфісан знижував поверхневий натяг до 25,3 мН/м, а значення ККМ становило 0,03%.

Руфісан у концентрації 6-12 мг/л виявляв ефективну антимікробну дію щодо представників роду Streptococcus (виживання S. mutans HG становило 64,9%, S. oralis J 22 — 62,8%, S. mutans — 58%, S. sanguis 12-48%, S. mutans NS — 46%), менш активно діяв на L. reuteri ML1 (32,1%), L. casei (28,4%), L. casei 72 (33,7%), L. reuteri 104R (25,4%) і практично не інгібував ріст C. albicans (5%), E. coli (5%), S. aureus (15%), P. aeruginosa (16%) та S. epidermidis (18%). Окрім того, ру-фісан знижував адгезію всіх досліджуваних тест-культур на полістиролові пластинки. Так, вже за мінімально досліджуваної концентрації ПАР (0,75 мг/л) ступінь адгезії L. casei, L. casei 72, L. reuteri 104R, L. reuteri ML1, S. sanguis 12, S. agalactiae, S. mutans NS, S. mutans, S. oralis J22, S. mutans HG985, S. aureus становив 61-91%. Зі збільшенням концентрації руфісану до 12 мг/л він також знижував кількість прикріплених клітин E. coli, S. epidermidis, C. albicans на 21-51%.

Eфективним антимікробним та антиадге-зивним агентом виявився лунасан, синтезований Candida sphaerica UCP0995 на середовищі із соєвою олією у концентрації 9 г/л [151]. ПАР штаму UCP0995 знижували поверхневий натяг до 25 мН/м, ККМ становила 0,25 мг/мл, у концентрації 10 мг/мл на 36-68% інгібували ріст L. casei, L. casei 72, L. reuteri 104R, L. reuteri ML1, S. agalactiaea, S. mutans, S. mutans NS, S. mutans HG, S. pyogene, S. sanguis 12, S. oralis J22, S. epidermidis,

S. aureus, P. aeruginosa, C. albicans і знижували на 40-100% їх адгезію на пластикових пластинках, причому найефективніше діяли на представників родів Streptococcus, Staphylococcus та Candida. Використання методу математичного планування (двофактор-ний експеримент) дало змогу визначити оптимальне співвідношення соєвої олії (8,63%, об’ємна частка) та кукурудзяного екстракту (8,80%, об’ємна частка) для максимального синтезу ПАР C. sphaerica UCP0995. Утворений лунасан відмивав до 95% піску від моторної оливи (5 мл олії/60 г піску) за 24 год [150].

Продуцентами софороліпідів є не тільки представники роду Candida. Так, у [153] описано штам термотолерантних дріжджів Pichia anomalia PY1, здатних до синтезу ПАР софороліпідної природи. Максимальний

синтез ПАР (0,2 г/л) спостерігали на середовищі з 4% бобової олії та 0,4% нітрату натрію за культивування у колбах на качалці (200 об/хв) упродовж 7 діб при температурі 30 °С. Софороліпіди, продуковані штамом PY1, знижували поверхневий натяг до 28 мН/м. Мас-спектрометричний аналіз дав змогу встановити, що до складу ПАР входять С20- та С18:1-жирні кислоти у нормальній, лактонній і діацетильованій формах.

Здатність до синтезу софороліпідів на середовищі з мелясою (150 г/л) встановлено для дріжджів Starmerella bombicola NBRC 10243 [154]. За оптимального значення рН 6 на 120-ту год культивування штам NBRC 10243 утворював до 14,4 г/л ПАР. За масштабуван-ня процесу на обладнання кількість цільового продукту підвищувалася в 1,6 раза (до 22,8 г/л). Методом газової хроматографії-мас-спектрометрії виявлено, що синтезовані гліколіпіди містили C16- та C18- жирні кислоти.

Інший штам Starmerella bombicola — ATCC 22214 синтезував 12,3 г/л софороліпі-дів на середовищі із сумішшю глюкози (10%, масова частка) та соняшникової олії (10%, масова частка), 6,6 г/л — на суміші гліцеро-лу (15%, масова частка) та соняшникової олії (10%, масова частка) під час культивування у колбах на качалці (210 об/хв) за 30 °С упродовж 200 год [155]. Заміна у суміші свіжої соняшникової олії на пересмажену та відпрацьовану пересмажену призводила до зниження показників синтезу ПАР до 3,93-6,45 г/л. Для визначення структури лактонного софо-роліпіду S. bombicola ATCC 22214, синтезованого на суміші гліцеролу і соняшникової олії, використовували обернену ВЕРХ, рідинну хроматографію-мас-спектрометрію та ядерний магнітний резонанс [156], а кислого софороліпіду, утворюваного на середовищі з пересмаженою олією та глюкозою, — ВЕРХ, рідинну хроматографію мас-спектрометрію та інфрачервону спектрометрію [155].

Важливими є дослідження хімічної структури софороліпідів Rhodotorula bogo-riensis із використанням ВЕРХ у комбінації з випарним детектором світлорозсіювання та тандемної мас-спектрометрії з іонізуючим розпиленням. Цими методами вперше встановлено, що ПАР R. bogoriensis містять моно- та діацетильовані C24:0 гідроксижир-ні кислоти [157]. Використання матричної лазерної десорбційної часопролітної мас-спектрометрії дало змогу ідентифікувати 18-гідрокси-Д9-октадеканоат у складі софороліпідів Candida sp. NRRL Y-27208 [158].

Манозилеритритолліпіди

Основними продуцентами манозилери-тритолліпідів (МЕЛ як основну структуру містить 4-О-Р-Б-манопіранозил-мезо-еритритол, з’єднаний з жирною кислотою та/або ацетильними групами) є представники роду Pseudozyma. Pseudozyma аМагсНса Т-34 [159], Pseudozyma aphidis Б8М 70725

[160] та Pseudozyma гugulosa ЫБИС 10877

[161], які синтезують суміш МЕЛ-А, МЕЛ-В та МЕЛ-С, Pseudozyma huЬeiensis КМ-59

[162], Pseudozyma gгaminicola СБ8 10092

[163], Pseudozyma siamensis СБ8 9960 [164] та Pseudozyma shanxiensis СБ8 10075 [165] здатні утворювати МЕЛ-С, що містять жирні кислоти з різною довжиною ланцюга. МЕЛ-В продукують Ustilago scitaminea за умов росту на середовищі з вуглеводнями [166], а Pseudozyma tsukuЬaensis — їх діа-стеомери (1-О-Р-(2',3'-ди-О-алка(е)ноїл-6'-О-а-цетил-Б-манопіранозил)-Б-еритритол) [167]

з комерційно важливими властивостями завдяки здатності утворювати великі везикули (1-5 мкм) за низьких концентрацій (можуть бути використані як компоненти косметичних засобів) [168]. Нещодавно на острові Окінава (Японія) з листя цукрової тростини було ізольовано новий штам Pseudozyma chuгashimaensis ер. пои. JCM 16988(Т), здатний до синтезу триацильованих похідних манозилеритритол ліпідів (МЕЬ-А2) на середовищі з глюкозою. ПАР мали здатність до самоорганізації з утворенням ламілярних фаз, знижували поверхневий натяг до 29,2 мН/м, а ККМ становила 1,710-6 М [169].

Пошук продуктивних штамів МЕЛ-В та МЕЛ-С є досить актуальним. Так, у роботі [170] було виділено чотири штами 1Б9, 1Б10, 1Б11 та 1Е5, серед яких останній синтезував до 73,1 г/л МЕЛ-В на середовищі з оливковою олією (10%, масова частка) за культивування у ферментері об’ємом 5 л упродовж 168 год. Використання соку цукрової тростини (19,3% цукру, масова частка) як субстрату для культивування Ustilago scitaminea ЫБИС 32730 у ферментері на 7-му добу дало змогу отримати до 25,1 г/л МЕЛ-В, що знижував поверхневий натяг до 25,2 мН/м, ККМ становила 3,710-6 М [171].

Під час вирощування в колбах на качалці іншого продуцента МЕЛ — Pseudozyma huЬeiensis 8У62 концентрація МЕЛ-С становила 20,1 г/л за оптимальної температури 25 °С, а після оптимізації складу живильного середовища (глюкоза, оливкова олія 100 г/л, дріжджовий екстракт 6 г/л) підвищилася до 49,2 г/л [172]. Культивування з підживленням (додавання джерел вуглецевого живлення на

Taблuця 2. Синтез гліколіпідів на різних вуглецевих субстратах

ПАР Продуцент Джерело вуглецю, концентрація, г/л Концентрація ПАР, г/л Вихід від суб-стра ту, % Літе- рату- ра

Рамно- ліпіди Pseudomonas aeruginosa BYK-2 KCTC 18012P Риб’ячий жир, 25,0 18,8 75,0 [81]

Pseudomonas aeruginosa UCP0992 Гліцерол, 37,8 8,0 21,2 [85]

Pseudomonas aeruginosa PAO1 Соняшникова олія, 250 36,0 14,4 [82]

Pseudomonas aeruginosa AT10 Соєва олія, 50,0 18,7 37,3 [78]

Pseudomonas nitroreducens AY297786 Глюкоза, 40,0 5,5 13,7 [83]

Рекомбінантний штам Pseudomonas putida KCTC1067 Соєва олія, 20,0 7,3 36,5 [96]

Рекомбінантний штам Pseudomonas putida KT42C1 Глюкоза, 10,0 1,5 15,0 [98]

Pseudomonas aeruginosa WJ-1 Відпрацьована соняшникова олія, 60,0 50,2 83,7 [87]

Pseudomonas aeruginosa RS29 Гліцерол, 25,2 6,0 23,8 [84]

Трега- лозо- ліпіди Rhodococcus erythropolis АТСС 4277 Гліцерол, 15,0 1,7 11,3 [110]

Rhodococcus erythropolis DSM 43215 С12-С18-н-алкани, 20,0 2,0 10,0 [86]

С10-н-алкани, 100,0 32,0 32,0 [13]

Rhodococcus erythropolis SD-74 н-Гексадекан, 80,0 40,0 50,0 [13]

Rhodococcus erythropolis ІМВ Ас-5017 н-Гексадекан, 15,0 7,5 50,0 [144]

Пересмажена соняшникова олія, 18,0 6,8 40,0 [143]

Acinetobacter calcoaceticus ІМВ В-7241 Етанол, 16,0 6,0 37,5 [139]

Nocardia vaccinii ІМВ В-7405 Гліцерол, 19,0 12,6 66,3 [121]

Софоро- ліпіди Candida tropicalis UCP0996 Пересмажена соняшникова олія, 20,0 3,6 18,1 [148]

Candida glabrata UCP1002 Відходи рослинних жирів, 50,0 7,0 14,0 [149]

Candida lipolytica UCP 0988 Соєва олія, 60,0 8,0 13,3 [152]

Candida sphaerica UCP0995 Соєва олія, 79,8 9,0 11,3 [151]

Pichia anomalia PY1 Бобова олія, 40,0 0,2 0,5 [153]

Starmerella bombicola NBRC 10243 Меляса, 150,0 22,8 15,2 [154]

Starmerella bombicola ATCC 22214 Глюкоза і соняшникова олія, по 100,0 12,3 6,2 [155]

Манозил-еритри-тол ліпі ди Pseudozyma hubeiensis SY62 Глюкоза і оливкова олія, по 100,0 129,0 64,5 [172]

Pseudozyma tsukubaensis 1E5 Оливкова олія, 100,0 73,1 73,1 [170]

Ustilago scitaminea NBRC 32730 Сік цукрової тростини (19,3% цукру, масова частка) 25,1 13,0 [171]

3-тю добу) дало змогу досягти концентрації цільового продукту 129 г/л за тиждень культивування.

Вивченню здатності молекул МЕЛ до самозбирання також присвячено низку досліджень. Так, у [173] досліджували властивості МЕЛ-Б, одержаного гідролізом ацетатних груп МЕЛ-В (продуцент Pseudozyma tsukuЬaensis МБИС 1940). Показано, що МЕЛ-Б у дуже низьких концентраціях (5 мМ) утворював зворотні везикули у таких гідрофобних речовинах, як н-алкани, циклогексан, сква-

лан і силіконові олії. Здатність формувати ліотропні кристалічні фази встановлено і для МЕЛ-В и. scitaminea ЫБИС 32730 [171].

Показано, що МЕЛ-А (продуцент P. апЬагс-иса Т-34), МЕЛ-В (^ tsukuЬaensis ЫБКС1940) і МЕЛ-С (^ huЬeiensis КМ-59) можуть бути ефективними компонентами засобів догляду за шкірою [174]. Зокрема, за оброблення досліджуваними ПАР у концентрації 1-5% (масова частка) відновлювалося до 80% клітин шкіри людини (тривимірна модель). Нанесення 5% МЕЛ-В на шкіру передпліччя

людини уможливило підвищення її здатності до утримання вологи на 186% (у контрольному варіанті: шкіра, оброблена 5%-м 1,3-бу-тиленгліколем, — лише 125%) та знизити потовиділення до 74% за 2 год. МЕЛ-С у концентрації 10 мкг/мл на 17% ефективніше захищав клітини людських фібробластів шкіри (лінія ЫБШОБ), ніж арбутин (комерційний аналог) від Н2О2-індукованого окиснюваль-ного стресу, що свідчить про антиоксидантні властивості цих ПАР [175].

Узагальнені дані щодо продуктивності деяких штамів — продуцентів гліколіпідів наведено в табл. 2.

Як випливає з них, селекціоновані нами штами не поступаються і навіть перевершують за показниками синтезу ПАР відомі у світі продуценти гліколіпідів.

Таким чином, найбільш вивченими на сьогодні мікробними ПАР є рамноліпіди, які вперше було описано 70 років тому. За цей період накопичено достатньо знань про їхню хімічну структуру, властивості, умови культивування продуцентів, проте й на сьогодні ці ПАР є об’єктами інтенсивних досліджень, спрямованих на оптимізацію процесу біосинтезу (підбір оптимальних умов культивування) і здешевлення технологій за рахунок використання як субстратів відходів виробництв (гліцерол, відпрацьована соняшникова олія тощо). Окрім того, детально досліджують біохімічні основи

REFERENCES

1. Banat I. M., Franzetti A., Gandolfi I., Bestetti G., Martinotti M. G., Fracchia L., Smyth T. J., Marchant R. Microbial biosurfactants production, applications and future potential. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2010, 87(2), 427-444.

2. Bergstrom S., Theorell H, Davide H. Pyoli-pic acid. A metabolic product of Pseudomonas pyocyanea active against Mycobacterium tuberculosis. Arch. Biochem. Biophys. 1946, V. 10, P.165-166.

3. Jarvis F. G, Johnson M. J. A glyco-lipide produced by Pseudomonas aeruginosa. J. Am. Chem. Soc. 1949, 71(12), 4124-4126.

4. Lang S. Biological amphiphiles (microbial biosurfactants). Curr. Opin. Colloid. Interface Sci. 2002, 7(1-2), 12-20.

5. Makkar R. S., Cameotra S. S., Banat I. M. Advances in utilization of renewable substrates for biosurfactant production. AMB Express.

2011. doi: 10.1186/2191-0855-1-5.

6. Marchant R, Banat I. M. Biosurfactants: a sustainable replacement for chemical surfactants. Biotechnol. Lett. 2012, 34(9), 1597-1605.

синтезу цих гліколіпідів з метою створення мутантів з порушеною системою регуляції або рекомбінантних продуцентів (P. putida і E. coli) замість патогенних P. aeruginosa. Іншими відомими бактеріальними ПАР є трегалозоліпіди, які синтезуються переважно представниками роду Rhodococcus на гідрофобних н-алканах. Конкурентоспроможними продуцентами поверхнево-активних трегалозоміколатів є селекціоновані нами R. erythropolis ІМВ Ас-5017, A. calcoaceticus ІМВ В-7241 і N. vaccinii ІМВ В-7405, які утворюють позаклітинні ПАР у високих концентраціях як на гідрофільних (етанол, гліцерол), так і гідрофобних (н-гексадекан, пересмажена соняшникова олія) субстратах. Серед дріжджів гліколіпіди в основному синтезуються представниками роду Candida (софороліпіди) і Pseudozyma (манозилери-тритолліпіди). Сучасні дані присвячено підбору оптимальних умов культивування цих продуцентів (концентрація компонентів живильного середовища, рН, температура), а також дослідженню біологічних властивостей синтезованих ПАР (антимікробна та антиадгезивна дія). Таким чином, інтерес до мікробних ПАР як альтернативі хімічним аналогам зростає з кожним роком, а різні біотехнологічні прийоми інтенсифікації синтезу дають змогу підвищити концентрацію цільового продукту, здешевити технологію і зробити її конкурентоспроможною.

7. Mulligan C. N. Environmental applications for biosurfactants. Environ. Pollut. 2005, 133(2), 183-198.

8. Nguyen T. T., Sabatini D. A. Characterization and emulsification properties of rhamnolipid and sophorolipid biosurfactants and their applications. Int. J. Mol. Sci. 2011, 12(2), 1232-1244.

9. Pacwa-Plociniczak M., Plaza G.A., Piotrowska-Seget Z., Cameotra S. S. Environmental applications of biosurfactants: recent advances. Int. J. Mol. Sci. 2011, 12(1-2), 633-654.

10. Rodrigues L. R. Inhibition of bacterial adhesion on medical devices, Adv. Exp. Med. Biol. 2011, V. 715, P. 351-367.

11. Ron E. Z., Rosenberg E. Biosurfactants and oil bioremediation. Curr. Opin. Biotechnol. 2002, 13(3), 249-252.

12. Singh A., Van Hamme J. D., Ward O. P. Surfactants in microbiology and biotechnology. Part 2 Application aspects. Biotechnol. Adv. 2007, 25(1), 99-121.

13. Lang S., Philp J. C. Surface-active lipids in rhodococci. Antonie. Van. Leeuwenhoek. 1998, 74(1-3), 59-70.

14. Rosenberg E., Ron E. Z. High- and low-molecular-mass microbial surfactants. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1999, 52(2), 154-162.

15. Van Hamme J. D., Singh A., and Ward O. P. Physiological aspects. Part 1 in a series of papers devoted to surfactants in microbiology and biotechnology. Biotechnol. Adv. 2006, 24(6), 604-620.

16. Arutchelvi J. I., Bhaduri S., Uppara P. V., Doble M. Mannosylerythritol lipids. a review. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2008, 35(12), 1559-1570.

17. Van Bogaert I. N. A., Zhang J., Soetaert W. Microbial synthesis of sophorolipids. Proc. Biochem. 2011, 46(4), 821-833.

18. Muller M. M., Hausmann R. Regulatory and metabolic network of rhamnolipid biosynthesis. traditional and advanced engineering towards biotechnological production. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2011, 91(2), 251-264.

19. Abdel-Mawgoud A M., Lepine F., Deziel E. Rhamnolipids: diversity of structures, microbial origins and roles. Appl. Microbiol. Biotechnol. Proc. Biochem. 2010, 86(5), 1323-1336.

20. Abalos A., Pinazo A., Infante M., Casals M., Garcia F., Manresa A. Physicochemical and antimicrobial properties of new rhamnolipids produced by Pseudomonas aeruginosa AT10 from soybean oil refinery wastes. Langmuir. 2001, 17(5), 1367-1371.

21. Nguyen T. T., Youssef N. H., Mcinerney M. J., Sabatini D. A. Rhamnolipid biosurfactant mixtures for environmental remediation. Water Res. 2008, 42(6-7), 1735-1743.

22. Darvishi P., Ayatollahi S., Mowla D., Niazi A. Biosurfactant production under extreme environmental conditions by an efficient microbial consortium, ERCPPI-2. Coll. Surf.

B. Biointerfaces. 2011, 84(2), 292-300.

23. Dusane D. H., Dam S., Nancharaiah Y. V., Kumar A. R., Venugopalan V. P., Zinjarde S. S. Disruption of Yarrowia lipolytica biofilms by rhamnolipid biosurfactant. Aquat. Biosyst. 2012. doi. 10.1186/2046-9063-8-17.

24. Vatsa P., Sanchez L., Clement C., Baillieul F., Dorey S. Rhamnolipid biosurfactants as new players in animal and plant defense against microbes. Int. J. Mol. Sci. 2010, 11(12), 5095-5108.

25. Marsudi S., Unno H., Hori K. Palm oil utilization for the simultaneous production of polyhydroxyalkanoates and rhamnolipids by Pseudomonas aeruginosa. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2008,78(6), 955-961.

26. Wei Y.-H., Chou C.-L., Chang J.-S. Rhamno-lipid production by indigenous Pseudomonas aeruginosa J4 originating from petrochemical wastewater. Biochem. Eng. J. 2004, 27(2), 146-154.

27.Aguirre-Ramirez M., Medina G., Gonzalez-Valdez A., Grosso-Becerra V., Soberon-

Chavez G. The Pseudomonas aeruginosa rmlBDAC operon, encoding dTDP-L-rhamno-se biosynthetic enzymes, is regulated by the quorum-sensing transcriptional regulator RhlR and the alternative sigma factor ctS. Microbiology. 2012, 158(4), 908-916.

28. Toribio J., Escalante A. E., Soberon-Chavez G. Rhamnolipids: production in bacteria other than Pseudomonas aeruginosa. Eur. J. Lipid Sci. Technol. 2010, 112(10), 1082-1087.

29. Chrzanowski L., Lawniczak L., Czaczyk K. Why do microorganisms produce rhamnolipids? World J. Microbiol. Biotechnol. 2012, 28(2), 401-419.

30. Nitschke M., Costa S. G., Contiero J. Structure and applications of a rhamnolipid surfactant produced in soybean oil waste. Appl. Biochem. Biotechnol. 2010, 160(7), 2066-2074.

31. Pereira J. F., Gudina E. J., Doria M. L., Domi-ngues M. R., Rodrigues L. R., Teoxeira J. A., Coutinho J. A. Characterization by electrospray ionization and tandem mass spectrometry of rhamnolipids produced by two Pseudomonas aeruginosa strains isolated from Brazilian crude oil. Eur. J. Mass Spectrom. 2012, 18(4), 399-3406.

32. Sha R., Jiang L., Meng Q., Zhang G., Song Z. Producing cell-free culture broth of rhamnolipids as a cost-effective fungicide against plant pathogens. J. Basic. Microbiol.

2012, 52(4), P. 458-466.

33. Wadekar S. D., Kale S. B., Lali A. M., Bhowmick D. N., Pratap A. P. Microbial synthesis of rhamnolipids by Pseudomonas aeruginosa (ATCC 10145) on waste frying oil as low cost carbon source. Prep. Biochem. Biotechnol. 2012, 42(3), 249-266.

34. Edwards J. R., Hayashi J. A. Structure of a rhamnolipid from Pseudomonas aeruginosa // Arch. Biochem. Biophys. 1965, 111(2), 415-421.

35. Hauser G., Karnovsky M. L. Studies on the production of glycolipide by Pseudomonas aeruginosa. J.Bacteriol. 1954, 68(6), 645-654.

36. Hirayama T., Kato I. Novel methyl rhamno-lipids from Pseudomonas aeruginosa. FEBS Lett. 1982, 139(1), 81-85.

37. Ito S., Honda H., Tomita F., Suzuki T. Rhamnolipids produced by Pseudomonas aeruginosa grown on n-paraffin (mixture of C 12 , C 13 and C 14 fractions). J. Antibiot. 1971, 24(12), 855-859.

38. Syldatk C., Lang S., Wagner F., Wray V., Witte L. Chemical and physical characterization of four interfacial-active rhamnolipids from Pseudomonas spec. DSM 2874 grown on n-alkanes. Zh. Naturforsch. C. 1985, 40(1-2), 51-60.

39. Rendell N. B., Taylor G. W., Somerville M., Todd H., Wilson R., Cole P. J. Characte ri sa-tion of Pseudomonas rhamnolipids. Bio chim. Biophys. Acta. 1990, 1045(2), 189-193.

40. Haba E., Abalos A., J auregui O., Espuny M. J., Manresa A. Use of liquid chromatography-mass spectroscopy for studying the

composition and properties of rhamnolipids produced by different strains of Pseudomonas aeruginosa. J. Surfact. Deterg. 2003, 6(2), 155-161.

41. Sharma A., Jansen R., Nimtz M., Johri B. N, Wray V. Rhamnolipids from the rhizosphere bacterium Pseudomonas sp. GRP(3) that reduces damping-off disease in Chilli and tomato nurseries. J. Nat. Prod. 2007, 70(6) 941-947.

42. Gunther N. W., Nunez A., Fett W., Solai-man D. K. Production of rhamnolipids by Pseudomonas chlororaphis, a nonpathogenic bacterium. Appl. Environ. Microbiol. 2005, 71(5), 2288-2293.

43. Guo Y. P., Hu Y. Y., Gu R. R., Lin H. Characterization and micellization of rhamnolipidic fractions and crude extracts produced by Pseudomonas aeruginosa mutant MIG-N146. J. Coll. Interface Sci. 2009, 331(2), 356-363.

44. Manso PajarronA., De Koster C. G., Heerma W., Schmidt M., Haverkamp J. Structure iden-ti fi cation of natural rhamnolipid mixtures by fast atom bombardment tandem mass spectrometry. Glycoconj. J. 1993, 10(3), 219-226.

45. Andra J., Rademann J., Howe J., Koch M. H.,

Heine H., Zahringer U., Brandenburg K. Endotoxin-like properties of a rhamnolipid exotoxin from Burkholderia (Pseudomonas) plantarii: immune cell stimulation and

biophysical characterization. Biol. Chem.

2006, 387(3), 301-310.

46. Howe J., Bauer J., Andra J., Schromm A. B., ErnstM., Rossle M., ZahringerU., RademannJ., Brandenburg K. Biophysical characterization of synthetic rhamnolipids. FEBS J.

2006, 273(22), 5101-5112.

47. Dubeau D., Deziel E., Woods D. E., Lepine F. Burkholderia thailandensis harbors two identical rhl gene clusters responsible for the biosynthesis of rhamnolipids. BMC Microbiol. 2009. doi: 10.1186/1471-2180-9-263.

48. Gunther N. W., Nunez A., Fortis L., Solai-man D. K. Proteomic based investigation of rhamnolipid production by Pseudomonas chlororaphis strain NRRL B-30761. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2006, 33(11), 914-920.

49. Onbasli D., Aslim B. Biosurfactant production in sugar beet molasses by some Pseudomonas spp. J. Environ. Biol. 2009, 30(1), 161-163.

50. Rooney A. P., Price N. P., Ray K. J., Kuo T. M. Isolation and characterization of rhamno-lipid-producing bacterial strains from a biodiesel facility. FEMS Microbiol. Lett. 2009, 295(1), 82-87.

51. NayakA.S.,VijaykumarM.H.,KaregoudarT.B. Charac te rization of biosurfactant produced by Pseudoxanthomonas sp. PNK-04 and its application in bioremediation. Int. Biodeterior. Biodegrad. 2009, 63(1), 73-79.

52. Vasileva-TonkovaE.,GeshevaV.Biosurfactant production by antarctic facultative anaerobe Pantoea sp. during growth on hydrocarbons. Curr. Microbiol. 2007, 54(2), 136-141.

53. Abouseoud M., Yataghene A, Amrane A., Maachi R. Biosurfactant production by free and alginate entrapped cells of Pseudomonas fluorescens. J. Ind. Microbiol. Biotechnol.

2008, 35(11), 1303-1308.

54. Celik G. Y., Aslim B., Beyatli Y. Enhanced crude oil biodegradation and rhamnolipid production by Pseudomonas stutzeri strain G11 in the presence of Tween-80 and Triton X-100. J.Environ.Biol. 2008, 29(6), 867-870.

55. Oliveira F. J. S., Vazquez L., de Campos N. P., de Franca F. P. Production of rhamnolipids by a Pseudomonas alcaligenes strain. Proc. Biochem. 2009, 44(4), 383-389.

56. Ohlendorf B., Lorenzen W., Kehraus S., Krick A., Bode H. B., Konig G. M. Myxotyrosi-des A and B, unusual rhamnosides from Myxo-coccus sp. J.Nat.Prod. 2009, 72(1), P. 82-86.

57. Christova N., Tuleva B., Lalchev Z., Jordano-va A., Jordanov B. Rhamnolipid biosurfactants produced by Renibacterium sal mo ni na-rum 27BN during growth on n-hexadecane. Z. Naturforsch. C. 2004, 59(1-2), 70-74.

58. Vasileva-Tonkova E., Gesheva V. Glycolipids produced by Antarctic Nocardioides sp. during growth on n-paraffin. Process Biochem. 2005, 40(7), 2387-2391.

59. Lee M., Kim M. K., Vancanneyt M., Swings J., Kim S. H., Kang M. S., Lee S. T. Tetra-genococcus koreensis sp. nov., a novel rhamnolipid-producing bacterium. Int. J. Syst.EV.Microbiol. 2005, 55(4), 1409-1413.

60. Reis R. S., Pereira A G., Neves B. C., Freire D. M. Gene regulation of rhamnolipid production in Pseudomonas aeruginosa: a review. Bioresour. Technol. 2011, 102(11), 6377-6384.

61. Sober on-Chavez G., Lepine F., Deziel E. Production of rhamnolipids by Pseudomonas aeruginosa. Appl. Microbiol. Biotechnol.

2005, 68(6), 718-725.

62. Deziel E., Lepine F., Milot S., Villemur R. rhlA is required for the production of a novel biosurfactant promoting swarming motility in Pseudomonas aeruginosa:

3-(3-hydroxyalkanoyloxy)alkanoic acids (HAAs), the precursors of rhamnolipids. Microbiology. 2003, 149(8), 2005-2013.

63. Zhu K., Rock C. O. RhlA converts beta-hydro xy acyl-acyl carrier protein inter me dia-tes in fatty acid synthesis to the beta-hyd-roxydecanoyl-beta-hydroxydecanoate component of rhamnolipids in Pseudomonas aeruginosa. J. Bacteriol. 2008, 190(9), 3147-3154.

64. Ochsner U. A, Fiechter A., Reiser J. Isolation, characterization, and expression in Escherichia coli of the Pseudomonas aeruginosa rhlAB genes encoding a rhamno-syltransferase involved in rhamnolipid

biosurfactant synthesis. J. Biol. Chem. 1994, 269(31), 19787-19795.

65. Rahim R., Ochsner U. A., Olvera C., Granin-ger M., Messner P., Lam J. S., Soberon-Cha-vez G. Cloning and functional characterization of the Pseudomonas aeruginosa rhlC gene that encodes rhamnosyltransferase 2, an enzyme responsible for di-rhamnolipid biosynthesis. Mol. Microbiol. 2001, 40(3), 708-718.

66. Pham T. H., Webb J. S., Rehm B. H. The role of polyhydroxyalkanoate biosynthesis by Pseudomonas aeruginosa in rhamnolipid and alginate production as well as stress tolerance and biofilm formation. Microbiology. 2004, 150(10), 3405-3413.

67.Allard S., Giraud M. F., Whitfield C, Graninger M., Messner P., Naismith J. H. The crystal structure of dTDP-D-Glucose 4,6-dehydratase (RmlB) from Salmonella enterica serovar Typhimurium, the second enzyme in the dTDP-l-rhamnose pathway. J. Mol. Biol. 2001, 307(1), 283-295.

68. Graninger M., Nidetzky B., Heinrichs D. E., Whitfield C., Messner P. Characterization of dTDP-4-dehydrorhamnose 3,5-epimerase and dTDP-4-dehydrorhamnose reductase, required for dTDP-L-rhamnose biosynthesis in Salmonella enterica serovar Typhimurium LT2. J. Biol. Chem. 1999, 274(35), 25069-25077.

69. Rehm B. H., Mitsky T. A., Steinbuchel A. Role of fatty acid de novo biosynthesis in polyhydroxyalkanoic acid (PHA) and rhamnolipid synthesis by pseudomonads: establishment of the transacylase (PhaG)-mediated pathway for PHA biosynthesis in Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 2001, 67(7), P. 3102-3109.

70. Miller D. J ., Zhang Y. M., Rock C. O., White S. W. Structure of RhlG, an essential beta-ketoacyl reductase in the rhamnolipid biosynthetic pathway of Pseudomonas aeruginosa. J. Biol. Chem. 2006, 281(26), 18025-18032.

71. Campos-Garcia J., Caro A D., Najera R, Miller-Maier R. M., Al-Tahhan R. A., Soberon-Chavez G. The Pseudomonas aeruginosa rhlG gene encodes an NADPH-dependent beta-ketoacyl reductase which is specifically involved in rhamnolipid synthesis. J. Bacte-riol. 1998, 180(17),. 4442-4451.

72. Byrd M. S., Sadovskaya I., Vinogradov E., Lu H., Sprinkle A. B., Richardson S. H., Ma L., Ralston B., Parsek M. R.,Anderson E. M., Lam J. S., Wozniak D. J. Genetic and biochemical analyses of the Pseudomonas aeruginosa Psl exopolysaccharide reveal overlapping roles for polysaccharide synthesis enzymes in Psl and LPS production. Mol. Microbiol. 2009, 73(4), 622-638.

73. Lindhout T., Lau P. C., Brewer D., Lam J. S. Truncation in the core oligosaccharide of lipopolysaccharide affects flagella-mediated

motility in Pseudomonas aeruginosa PAO1 via modulation of cell surface attachment. Microbiology. 2009, 155(10), 3449-3460.

74. Rahim R., Burrows L. L., Monteiro M. A., Perry M. B., Lam J. S. Involvement of the rml locus in core oligosaccharide and O polysaccharide assembly in Pseudomonas aeruginosa. Microbiology. 2000, 146(11), 2803-2814.

75. Blankenfeldt W., Giraud M. F., Leonard G., Rahim R., Creuzenet C., Lam J. S., Nai-smith J. H. The purification, crystallization and preliminary structural characterization of glucose-1-phosphate thymidylyl-transferase (RmlA), the first enzyme of the dTDP-L-rhamnose synthesis pathway from Pseudomonas aeruginosa. Acta Crystallogr. D.Biol.Crystallogr. 2000, 56(11), 1501-1504.

76. Williams P., Camara M. Quorum sensing and environmental adaptation in Pseudomonas aeruginosa: a tale of regulatory networks and multifunctional signal molecules. Curr. Opin. Microbiol. 2009, 12(2), 182-191.

77. Deziel E., Gopalan S., Tampakaki A. P., Lepine F., Padfield K. E., Saucier M., Xiao G., Rahme L. G. The contribution of MvfR to Pseudomonas aeruginosa pathogenesis and quorum sensing circuitry regulation: multiple quorum sensing-regulated genes are modulated without affecting lasRI, rhlRI or the production of N-acyl-L-homoserine lactones. Mol. Microbiol. 2005, 55(4), 998-1014.

78. Abalos A., Maximo F., Manresa M. A., Bastida J. Utilization of response surface methodology to optimize the culture media for the production of rhamnolipids by Pseudomonas aeruginosa AT10. J. Chem. Technol. Biotechnol. 2002, 77(7), 777-784.

79. Costa S. G. V., Nitschke M., Lepinec F., D eziel E. Structure, properties and applications of rhamnolipids produced by Pseudomonas aeruginosa L2-1 from cassava wastewater. Proc. Biochem. 2010, 45(9), 1511-1516.

80. De Lima C. J., Franga F. P., Servulo E. F., Re-sende M. M., Cardoso V. L. Enhancement of rhamnoplipid production in residual soybean oil by an isolated strain of Pseudomonas aeruginosa. Appl. Biochem. Biotechnol. 2007, 137-140(1-12), 463-470.

81. Lee K. M.,HwangS., Ha S. D.,JangJ.-H., Lim D.-J., Kong J.-Y. Rhamnolipid production in batch and fed-batch fermentation using Pseudomonas aeruginosa BYK-2 KCTC 18012P. Biotechnol. Bioprocess Eng. 2007, 9(4), 267-273.

82. Muller M. M., Hormann B., Kugel M., Syldatk C., Hausmann R. Evaluation of rhamnolipid production capacity of Pseudomonas aeruginosa PAO1 in comparison to the rhamnolipid over-producer strains DSM 7108 and DSM 2874. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2011, 89(3), 585-592.

83. Onwosi C. O., Odibo F. J. Effects of carbon and nitrogen sources on rhamnolipid

biosurfactant production by Pseudomonas nitroreducens isolated from soil. World J. Microbiol. Biotechnol. 2012, 28(3), 937-942.

84. Saikia R. R., Deka S., Deka M., Banat I. M. Isolation of biosurfactant-producing Pseudomonas aeruginosa RS29 from oil-contaminated soil and evaluation of different nitrogen sources in biosurfactant production. Ann. Microbiol. 2012, 62(2), 753-763.

85. Silva S. N., Farias C. B., Rufino R. D., Luna J. M., Sarubbo L. A. Glycerol as substrate for the production of biosurfactant by Pseudomonas aeruginosa UCP0992. Coll. Surf. B. Biointerfaces. 2010, 79(1), 174-183.

86. Trummler K., Effenberger F., Syldatk C. An integrated microbial/enzymatic process for production of rhamnolipids and L-(+)-rhamnose from rapeseed oil with Pseudomonas sp DSM 2874. Eur. J. Lipid. Sci. Technol. 2003, 105(10), 563-571.

87. Xia W. J., Luo Z. B., Dong H. P., Yu L., Cui Q. F., Bi Y. Q. Synthesis, characterization, and oil recovery application of biosurfactant produced by indigenous Pseudomonas aeruginosa WJ-1 using waste vegetable oil. Appl. Biochem. Biotechnol. 2012, 166(5), 1148-1166.

88. Yin H., Qiang J., Jia Y., Ye J., Peng H., Qin H., Zhang N., He B. Characteristics of biosurfactant produced by Pseudomonas aeruginosa S6 isolated from oil-containing wastewater. Proc. Biochem. 2009, 44(3), 302-308.

89. Chen S. Y., Wei Y. H., Chang J. S. Repeated pH-stat fed-batch fermentation for rhamnolipid production with indigenous Pseudomonas aeruginosa S2. Appl. Microbiol. Biotechnol.

2007, 76(1), 67-74.

90. Muller M. M., Hormann B., Syldatk C., Hausmann R. Pseudomonas aeruginosa PAO1 as a model for rhamnolipid production in bioreactor systems. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2010, 87(1), 167-174.

91. Heyd M., Franzreb M., Berensmeier S. Conti nuous rhamnolipid production with integrated product removal by foam fractionation and magnetic separation of immo-bi lized Pseudomonas aeruginosa. Biotechnol. Prog. 2011, 27(3), 706-716.

92. Duetz W. A Microtiter plates as mini-bioreactors: miniaturization of fermentation methods. Trends Microbiol. 2007, 15(10), 469-475.

93. Weuster-Botz D. Parallel reactor systems for bioprocess development. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 2005, V. 92, P. 125-143.

94. Ochsner U. A., Reiser J., Fiechter A., Witholt B. Production of Pseudomonas aeruginosa rhamnolipid biosurfactants in heterologous hosts. Appl. Environ. Microbiol. 1995, 61(9), 3503-3506.

95. Wang Q., Fang X., Bai B., Liang X., Shuler P. J., Goddard W. A,. Tang Y. Engineering bacteria

for production of rhamnolipid as an agent for enhanced oil recovery. Biotechnol. Bioeng.

2007, 98(4), 842-853.

96. Cha M., Lee N., Kim M., Kim M., Lee S. Heterologous production of Pseudomonas aeru gi no sa EMS1 biosurfactant in Pseudomonas putida. Bioresour. Technol. 2008, 99(7), 2192-2199.

97. Cabrera-Valladares N., Richardson A. P., Olvera C. Monorhamnolipids and 3-(3-hydro-xyalkanoyloxy) alkanoic acids (HAAs) production using Escherichia coli as a heterologous host. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2006, 73(1), 187-194.

98. Wittgens A., Tiso T., Arndt T. T., Wenk P., Hemmerich J., Muller C., Wichmann R., Kupper B., Zwick M., Wilhelm S., Hausmann R., Syldatk C., Rosenau F., Blank L. M. Growth independent rhamnolipid production from glucose using the non-pathogenic Pseudomonas putida KT2440. Microb. Cell. Fact. 2011. doi: 10.1186/1475-2859-10-80.

99. Suzuki T., Tanaka K., Matsubara J., Kimoshita S. Trehalose lipid and a-branched-P-hydroxy fatty acids formed by bacteria grown on n-alkanes. Agric. Biol. Chem. 1969, 33(11), 1619-1625.

100. Rapp P., Bock H., Wray V., Wagner F. Formation, isolation and characterization of trehalose dimycolates from Rhodococcus erythropolis grown on n-alkanes. J. Gen. Microbiol. 115(2), 491-503.

101. Kretschmer A., Bock H., WagnerF. Chemical and physical characterization of interfacial-active lipids from Rhodococcus erythropolis grown on n-alkanes, Appl. Environ. Microbiol. 1982, 44(4), 864-870.

102. Espuny M. J., Egido S., Rodon I., Manresa A., Mercade M. E. Nutritional requirements of a biosurfactant producing strain Rhodo coccus sp. 51T7, Biotechnol. Lett. 1996, V. 18, P. 521-526.

103. Kim J. S., Powalla M., Lang S., Wagner F., Lunsdorf H., Wray V. Microbial glycolipid production under nitrogen limitation and resting cell conditions. J. Biotechnol. 1990, 13(4), 257-266 .

104. Bouchez-Na'itali M., Vandecasteele J. P. Biosurfactants, an help in the biodegradation of hexadecane? The case of Rhodococcus and Pseudomonas strains. World J. Microbiol. Biotechnol. 2008, 24(9), 1901-1907.

105. Franzetti A, Bestetti G., Caredda P., La Colla P., Tamburini E. Surface-active compounds and their role in the access to hydrocarbons in Gordonia strains, FEMS Microbiol. Ecol. 2008, 63(2), 238-248.

106. Philp J. C., Kuyukina M. S., Ivshina I. B., Dunbar S. A., Christofi N., Lang S., Wray V. Alkanotrophic Rhodococcus ruber as a biosurfactant producer, Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002, 59(2-3), 318-324.

107. Rapp P., Gabriel-Jurgens L. H. Degradation of alkanes and highly chlorinated benzenes, and production of biosurfactants, by a psych-rophilic Rhodococcus sp. and genetic characterization of its chlorobenzene dioxygenase. Microbiology. 2003, 149(10), 2879-2890.

108. Tokumoto Y., Nomura N., Uchiyama H., Imura T., Morita T., Fukuoka T., Kitamoto

D. Structural characterization and surface-active properties of a succinoyl trehalose lipid produced by Rhodococcus sp. SD-74, J. Oleo. Sci. 2009, 58(2), 97-102.

109. Tuleva B., Christova N., Cohen R., Stoev G., Stoineva I. Production and structural elucidation of trehalose tetraesters (biosurfactants) from a novel alkanothrophic Rhodococcus wratislaviensis strain. J. Appl. Microbiol. 2008, 104(6), 1703-1710.

110. Ciapina E. M., Melo W. C., Santa A. L. M., Santos A. S., Freire D. M., Pereira N. Jr. Biosurfactant production by Rhodococcus erythropolis grown on glycerol as sole carbon source. Appl. Biochem. Biotechnol.

2006, 131(1-3), 880-886.

111. Franzetti A., Gandolfi I., Bestetti G., Smyth T. J. P., Banat I. M. Production and applications of trehalose lipid biosur-factants.Eur. J. Lipid Sci. Technol. 2010, V. 112, Р. 617-627.

112. Mutalik S. R., Vaidya B. K., Joshi R. M., Desai K. M., Nene S. N. Use of response surface optimization for the production of biosurfactant from Rhodococcus sp. MTCC 2574. Bioresour. Technol. 2008, 99(16), 7875-7880.

113. Ortiz A., Teruel J A., Espuny M. J., Marqu es A, Manresa A., Aranda F. J. Interactions of a Rhodococcus sp. biosurfactant trehalose lipid with phosphatidylethanolamine membranes. Biochim. Biophys. Acta. 2008, 1778(12), 2806-2813.

114. Peng F., Liu Z., Wang L., Shao Z. An oil-degrading bacterium: Rhodococcus erythro-polis strain 3C-9 and its biosurfactants. J. Appl. Microbiol. 2007, 102(6), 1603-1611.

115. Ruggeri C., Franzetti A, Bestetti G., Cared-daa P., La Collaa P., Pintusa M., Sergia S., Tamburinia E. Isolation and characterisation of surface active compoundproducing bacteria from hydrocarbon-contaminated environments. Int. Biodeterior. Biodegrad.

2009, 63(7), 936-942.

116. Sadouk Z., Hacene H., Tazerouti A. Biosurfactants production from low cost substrate and degradation of diesel oil by a Rhodococcus strain. Oil. Gas. Sci. Technol.

2008, 63(6), 747-753.

117. Dogan I., Pagilla K. R., Webster D. A., Stark B. C. Expression of Vitreoscilla hemoglobin in Gordonia amarae enhances biosurfactant production. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2006, 33(8), 693-700.

118. Singer M. E., Finnerty W. R. Physiology of biosurfactant synthesis by Rhodococcus species H13-A. Can. J. Microbiol. 1990, 36(11), 741-745.

119. Kurane R., Hatamochi K., Kakuno T., Kiyohara M., Tajima T., Hirano M., Taniguchi Y. Chemical structure of lipid bioflocculant produced by Rhodococcus erythropolis. Biosci. Biotechnol. Biochem. 1995, 59(9), 1652-1656.

120. Ron E. Z., Rosenberg E. Natural roles of biosurfactants. Environ. Microbiol. 2001, 3(4), 229-236.

121. Pirog T. P., Grytsenko N. A., Homyak D. I., Konon A. D., Antonyuk S. I. Optimization of synthesis of biosurfactants of Nocardia vaccinii K-8 under bioconversion of biodiesel production waste. Mikrobiol. Zh,

2011, 73(4), 15-24. (In Russian).

122. Pirog T. P., Antonuk S. I., Karpenko Y. V., Shevchuk T. A. The influence of conditions of Acinetobacter calcoaceticus K-4 strain cultivation on surface-active substances synthesis. Prikl. Biokhim. Microbiol. 2009, 45(3.), 272-278. (In Russian).

123. Pirog T. P., Shevchuk T. A., Voloshina I. N., Gregirchak N. N. Use of claydite-immobilized oil-oxidizing microbial cells for purification of water from oil. Prikl. Biokhim. Microbiol. 2005. 41(1), 51-55. (In Russian).

124. Pirog T. P., Shevchuk T. A., Volishina I. N., Karpenko E. V. Production of surfactants by Rhodococcus erythropolis strain EK-1, grown on hydrophilic and hydrophobic substrates. Prikl. Biokhim. Microbiol. 2004, 40(5), 470-475. (In Russian).

125. Bach H., Berdichevsky Y., Gutnick D. An exocellular protein from the oil-degrading microbe Acinetobacter venetianus RAG-1 enhances the emulsifying activity of the polymeric bioemulsifier emulsan. Appl. Environ.Microbiol. 2003, 69(5), 2608-2615.

126. Zhao Z., Wong J. W. C. Biosurfactants from Acinetobacter calcoaceticus BU03 enhance the solubility and biodegradation of phenanthrene. Environ. Technol. 2009, 30(3), 291-299.

127. Kim S. H., Lim E. J., Lee S. O., Lee J. D., Lee T. H. Purification and characterization of biosurfactants from Nocardia sp. L-417. Biotechnol. Appl. Biochem. 2000, 31 (3), 249-253.

128. Pirog T., Sofilkanych A., Konon A., Shevchuk T., Ivanov S. Intensification of surfactants’ synthesis by Rhodococcus erythropolis IMV Ac-5017, Acinetobacter calcoaceticus IMV В-7241 and Nocardia vaccinii K-8 on fried oil and glycerol containing medium. Kharchova i pere rob na promislovist. 2013, 91(2), 149-157. (In Ukrainian).

129. Pirog T. P., Konon A. D., Skochko A. B. Microbial surface active substances use

in biology and medicine. Biotechnologiya.

2011, 4(2), 24-38. (In Ukrainian).

130. Pirog T. P., Konon A. D., Sofilkanich A. P., Skochko A. B. Effect of biosurfactants Acineto bacter calcoaceticus K-4 та Rhodo-coccus erythropolis EK-1 on some microorganisms. Mikrobiol.Zh. 2011, 73(3), 14-

20. (In Ukrainian).

131. Skochko A. B., Konon A. D., Pirog T. P. Research of antiadhesion properties of surface-active substances of Acinetobacter calcoaceticus IMV В-7241. Kharchova promis-lovist. 2012, N 13, P. 77-80. (In Ukrainian).

132. Filyuk І., Sofilkanych A., Konon A., Parfe-nyuk S., Pirog T. Protective properties of surface-active substances of Rhodococcus erythropolis IMV Ас-5017 and Acinetobacter calcoaceticus IMV B-7241. Naukovipratsi NUFT.

2012, N 43, P. 36-31. (In Ukrainian).

133. PirogT.P., ShulyakovaM.O., Shevchuk T.A., Sofylkanich A.P. Biotechnological potencial of bacteria of Rhodococcus strain and their metabolites. Biotechnologiya. 2011, 5(2), 51-67. (In Ukrainian).

134. Pirog T. A., Antonyuk S. I., Sorokina A. I. The influence of Acinetobacter calcoaceticus K-4 surface-active substances on the efficiency of microbial destruction of oil pollutans. Mikrobiol. Zh. 2009, 71(5), 8-13. (In Ukrainian).

135. Pirog T. P., Homyak D. I., Grytsenko N. A., Sofilkanych A. P., Konon A. D., Pokora K. A. Bacteria of Nocardia genus as object of biotechnology. Biotechnologiya. 2013, 6(3), P. 23-35. (In Ukrainian).

136. Takayama K., Wang C., Besra G. S. Pathway to synthesis and processing of mycolic acids in Mycobacterium tuberculosis. Clin. Microbiol. Rev. 2005, 18(1), 81-101.

137. Kuyukina M. S., Ivshina I. B., Philp J. C., Christofi N., Dunbar S. A., Ritchkova M. I. Recovery of Rhodococcus biosurfactants using methyl tertiary-butyl ether extraction. J.Microbiol.Methods. 20Gl, 46(2), 149-156.

138. Pirog T. P., Shevchuk T. A., Konon A D., Shulyakova M., Iutinska G. Synthesis of surfactants Acinetobacter calcoaceticus IMV B-7241 and Rhodococcus erythropolis IMV Ac-5017 in the medium with glycerol. Mikrobiol. Zh. 2012, 74(1), 20-27. (In Russian).

139. Pirog T. P., Shevchuk T. A,. Konon A. D,. Dolotenko E. Yu. Production of surfactants by Acinetobacter calcoaceticus K-4 grown on ethanol with organic acids. Prikl. Biokhim. Microbiol. 2012, 48(6), 569-576. (In Russian).

140. Pirog T.P., Shevchuk T.A., Shulyakova M.A. The influence of organic acids on biosurfactant synthesis by strain Acinetobacter calcoaceticus IMV B-7241 strain on glycerol medium. Biotechnologiya. 2012, 5(4), 88-

95. (In Ukrainian).

141. Pirog T.P., Shevchuk T.A., Shulyakova M.A., Tarasenko D. O. Influence of citric acid оп synthesis of biosurfactants of Rhodo coc cus erythropolis IMV Ас-5017. Mikrobiol. Zh., 2011, 73(5), 21-27. (In Ukrainian).

142. Homyak D. I., Grytsenko N. A., Konon A. D.,

Pirog T. P. The influence of organic acids on synthesis of surface-active substances under the conditions of growth of Nocardia vaccinii K-8 on glycerol. Microbiol. i Biotechnol. 2012, 1(17), 31-38. (In

Ukrainian).

143. Pirog T., Sofilkanych A., ShevchukT., Shulya-kova M. Biosurfactants of Rhodococcus erythropolis IMV Ас-5017: synthesis intensification and practical application. Prikl. Biokhim. Microbiol. 2013, 170(4), 880-894. (In Russian).

144. Pirog T. P., Ignatenko S. V. Scaling of the process of biosynthesis of biosurfactants by Rhodococcus erythropolis EK-1 on hexadecane. Prikl. Biokhim. Microbiol. 2011, 47(4), 393-399. (In Russian).

145. Hu Y., Ju L. K. Sophorolipid production from different lipid precursors observed with LC-MS. Enz. Microb. Technol. Rev. 2001, 29(10), 593-601.

146. Cutler A. J., Light R. J. Regulation of hydro-xydocosanoic acid sophoroside production in Candida bogoriensis by the levels of glucose and yeast extract in the growth medium. J. Biol. Chem. 1979, 254(6), 1944-1950.

147. Ito S., Inoue S. Sophorolipids from Torulop-sis bombicola. possible relation to alkane uptake. Appl. Environ. Microbiol. 1982, 43(6), 1278-1283.

148. Batista R. M., Rufino R. D., Luna J. M., de Souza J. E., Sarubbo L. A. Effect of medium components on the production of a biosurfactant from Candida tropicalis applied to the removal of hydrophobic contaminants in soil. Water. Environ. Res.

2010, 82(5), 418-425.

149. De Gusmao C. A. B., Rufino R. D., Sarubbo L. A. Laboratory production and characterization of a new biosurfactant from Candida glabrata UCP1002 cultivated in vegetable fat waste applied to the removal of hydrophobic contaminant. Antonie. Van. Leeuwenhoek. 2010, 26(9), 1683-1692.

150. Luna J. M., Rufino R. D., Albuquerque C. D., Sarubbo L. A, Campos-Takaki G. M. Economic optimized medium for tensio-active agent production by Candida sphaerica UCP0995 and application in the removal of hydrophobic contaminant from sand. Int. J. Mol. Sci. 2011, 12(4), 2463-2476.

151. Luna J. M., Rufino R. D., Sarubbo L. A., Rodrigues L. R., Teixeira J. A., de Campos-Takaki G. M. Evaluation antimicrobial and antiadhesive properties of the biosurfactant Lunasan produced by Candida sphaerica

UCP 0995. Curr. Microbiol. 2011, 62(5), 1527-1534.

152. Rufino R. D., Luna J. M., Sarubbo L. A. Antimicrobial and anti-adhesive potential of a biosurfactant Rufisan produced by Candida lipolytica UCP 0988. Coll. Surf. B. Biointerfaces. 2011, 84(1). 1-5.

153. Thaniyavarn J., Chianguthai T., Sangva-nich P., Roongsawang N., Washio K., Mori-kawa M., Thaniyavarn S. Production of sopho ro lipid biosurfactant by Pichia anomala.Biosci.Biotechnol.Biochem. 2008, 72(8), 2061-2068.

154. Takahashi M., Morita T., Wada K., Hirose N., Fukuoka T., Imura T., Kitamoto D. Production of sophorolipid glycolipid biosurfactants from sugarcane molasses using Starmerella bombicola NBRC 10243. J. Oleo. Sci. 1998, 60(5), 267-273.

155. Wadekar S., Kale S., Lali A., Bhowmick D., Pratap A. Sophorolipid production by Starmerella bombicola (ATCC 22214) from virgin and waste frying oils, and the effects of activated earth treatment of the waste oils. J.Am. Oil. Chem. Soc. 2012, 89(6), 1029-1039.

156. Wadekar S. D., Kale S. B., Lali A. M., Bhowmick D. N., Pratap A. P. Utilization of sweetwater as a cost-effective carbon source for sophorolipids production by Starmerella bombicola (ATCC 22214). Prep. Biochem. Biotechnol. 2012, 42(2), 125-142.

157. Ribeiro I. A., Bronze M. R., Castro M. F., Ribeiro M. H. Optimization and correlation of HPLC-ELSD and HPLC-MS/MS methods for identification and characterization of sophorolipids. J. Chromatogr. B. Analyt. Technol.Biomed.Life Sci. 2012, 899, 72-80.

158. Price N. P., Ray K. J., Vermillion K. E., Dunlap C. A, Kurtzman C. P. Structural characterization of novel sophorolipid biosurfactants from a newly identified species of Candida yeast. Carbohydr. Res. 2012, V. 348, P. 33-41.

159. Kitamoto D., Akiba S., Hioki C., Tabuchi T. Extracellular accumulation of mannosyl-erythritol lipids by a atrain of Candida antarctica. Agric. Biol. Chem. 1990, 54(1),

31-36.

160. Rau U., Nguyen L. A., Schulz S., Wray V., Nimtz M., Roeper H., Koch H., Lang S. Formation and analysis of mannosylerythritol lipids secreted by Pseudozyma aphidis. Appl. Microbiol.Biotechnol. 2005, 66(5), 551-559.

161. Morita T., Konishi M., Fukuoka T., Imura T., Kitamoto D. Discovery of Pseudozyma rugulosa NBRC 10877 as a novel producer of the glycolipid biosurfactants, mannosyl-erythritol lipids, based on rDNA sequence. Pseudozyma aphidis. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2006, 73(2), 305-313.

162. KonishiM., Morita T.,Fukuoka T., Imura T., Kakugawa K., Kitamoto D. Efficient pro-

duction of mannosylerythritol lipids with high hydrophilicity by Pseudozyma hu-beiensis KM-59. Pseudozyma aphidis. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2008, 78(1), 37-46.

163. Morita T., KonishiM., Fukuoka T., Imura T., Yamamoto S., Kitagawa M., Sogabe A, Kitamoto D. Identification of Pseudozy-ma graminicola CBS 10092 as a producer of glycolipid biosurfactants, mannosyl-erythritol lipids. J. Oleo. Sci. 2008, 57(2), 123-131.

164. Morita T.,KonishiM., Fukuoka T., Imura T., Kitamoto D. Production of glycolipid biosurfactants, mannosylerythritol lipids, by Pseudozyma siamensis CBS 9960 and their interfacial properties. J. Biosci. Bioeng.

2008, 105(5), 493-502.

165. Fukuoka T., Morita T., KonishiM., Imura T., Kitamoto D. Characterization of new types of mannosylerythritol lipids as biosurfactants produced from soybean oil by a basidiomycetous yeast, Pseudozyma shan-xien sis. J. Oleo. Sci. 2007, 56(8), 435-442.

166. Morita T., Ishibashi Y., Fukuoka T., Imura T., Sakai H., Abe M., Kitamoto D. Pro duc tion of glycolipid biosurfactants, mannosyl-erythritol lipids, by a smut fungus, Ustilago scitaminea NBRC 32730. Biosci. Biotechnol. Biochem. 2009, 73(3), 788-792.

167. Fukuoka T., Morita T., KonishiM., Imura T.,

Kitamoto D. A basidiomycetous yeast, Pseudo zyma tsukubaensis, efficiently

produces a novel glycolipid biosurfactant. The identification of a new diastereomer of mannosylerythritol lipid-B. Carbohydr. Res. 2008, 343(3), 555-560.

168. Worakitkanchanakul W., Imura T., Fukuoka T., Morita T., Sakai H., Abe M., Rujirava nit R.,Chavadej S., Minamikawa H., Kitamoto D. Aqueous-phase behavior and vesicle formation of natural glycolipid biosurfactant, mannosylerythritol lipid-B. Coll. Surf. B. Biointerfaces. 2008, 65(1), 106-112.

169. Morita T.,OguraY., TakashimaM.,HiroseN., Fukuoka T.,Imura T., Kondo Y., Kitamoto D. Isolation of Pseudozyma churashimaensis sp. nov., a novel ustilaginomycetous yeast species as a producer of glycolipid biosurf actants, mannosylerythritol lipids. J. Biosci. Bioeng. 2011, 112(2), 137-144.

170. Morita T., Takashima M., Fukuoka T., Konishi M., Imura T., Kitamoto D. Isolation of basidiomycetous yeast Pseudozyma tsukubaensis and production of glycolipid biosurfactant, a diastereomer type of mannosylerythritol lipid-B. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2010, 88(3), 679-688.

171. Morita T., Ishibashi Y., Hirose N., Wada K., Takahashi M., Fukuoka T., Imura T., Sakai H., Abe M., Kitamoto D. Production and characterization of a glycolipid biosurfactant, mannosylerythritol lipid B,

from sugarcane juice by Ustilago scitaminea NBRC 32730. Biosci. Biotechnol. Biochem.

2011, 75(7), 1371-1376.

172. Konishi M., Nagahama T., Fukuoka T., Mo-rita T., Imura T., Kitamoto D., Hatada Y. Yeast extract stimulates production of glycolipid biosurfactants, mannosylery-thritol lipids, by Pseudozyma hubeiensisSY62. J. Biosci. Bioeng. 2011, 111(6), 702-705.

173. Fukuoka T., Yanagihara T., Ito S., Imura T., Morita T., Sakai H., Abe M., Kitamoto D. Reverse vesicle formation from the yeast glycolipid biosurfactant mannosylerythritol lipid-D. J. Oleo. Sci. 2012, 61(5), 285-289.

174. Yamamoto S., Morita T., Fukuoka T., Imura T., Yanagidani S., SogabeA., Kitamoto D., Kitagawa M. The moisturizing effects of glycolipid biosurfactants, mannosyl-erythritol lipids, on human skin. J. Oleo. Sci. 2012, 61(7), 407-412.

175. Takahashi M., Morita T., Fukuoka T., Imura T., Kitamoto D. Glycolipid biosurfactants, mannosylerythritol lipids, show antioxidant and protective effects against H(2)O(2)-induced oxidative stress in cultured human skin fibroblasts. J. Oleo. Sci. 2012, 61(8), 457-464.

МИКРОБНЫЕ ПОВЕРХНОСТНО-АКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВА. I. ГЛИКОЛИПИДЫ

Т. П. Пирог, A. Д. Конон

Национальный университет пищевых технологий, Киев, Украина

E-mail: [email protected]

Обзор посвящен поверхностно-активным веществам гликолипидной природы. Приведена общая характеристика, описана физиологическая роль рамнолипидов, трегалозолипидов, со-форолипидов, маннозилэритритоллипидов и их традиционных продуцентов — представителей родов Pseudozyma, Pseudomonas, Rhodococcus и Candida. Детально рассмотрены химическая структура, этапы биосинтеза и регуляции некоторых низкомолекулярных поверхностноактивных веществ гликолипидной природы. Обобщены экспериментальные данные авторов об интенсификации синтеза, физиологической роли и практическом использовании поверхностно-активных веществ Rhodococcus erythropolis ІМВ Ас-5017, Acinetobacter calcoaceticus ІМВ В-7241 и Nocardia vaccinii ІМВ В-7405, которые по химической природе являются комплексом глико-, фосфо-, амино-и нейтральных липидов (гликолипиды всех штаммов представлены трегалозомиколатами).

Установлено, что поверхностно-активные вещества R. erythropolis ІМВ Ас-5017, A. calco-ace ticus ІМВ В-7241 и N. vaccinii ІМВ В-7405 обладают протекторными (защита клеток продуцента от действия тяжелых металлов), а также антимикробными и антиадгезивны-ми свойствами. Показано, что поверхностноактивные вещества R. erythropolis ІМВ Ас-5017, A. calcoaceticus ІМВ В-7241 и N. vaccinii ІМВ В-7405 в виде культуральной жидкости интенсифицируют деструкцию нефти в воде вследствие активации естественной нефтеокисляющей микрофлоры.

MICROBIAL SURFACTANTS. I. GLYCOLIPIDS

T. Р. Pirog, A. D. Konon

National University of Food Technologies, Kyiv, Ukraine

E-mail: [email protected]

The review is devoted to surface-active glycolipids. The general characteristics, the physiological role of the rhamnolipids, trehalose lipids, sophorolipids, mannosylerythritol lipids and their traditional producers — the representatives of the genera Pseudozyma, Pseudomonas, Rhodococcus and Candida are given. The detailed analysis of the chemical structure, the stages of the biosynthesis and the regulation of some low molecular glycolipids are done. The own experimental data concerning the synthesis intensification, the physiological role and the practical use of Rhodococcus erythropolis IMV Ac-5017, Acinetobacter calcoaceticus IMV B-7241 and Nocardia vaccinii IMV B-7405 surfactants, which are a complex of the glyco-, phospho-, amino- and neutral lipids (glycolipids of all strains are presented by trehalose mycolates) are summarized.

It was found that R. erythropolis IMV Ac-5017, A. calcoaceticus IMV B-7241 and N. vaccinii IMV B-7405 surfactants have protective, antimicrobial and antiadhesive properties. It was shown that R. erythropolis IMV Ac-5017, A. calcoaceticus IMV B-7241 and N. vaccinii IMV B-7405 surfactants preparation of cultural liquid intensified the degradation of oil in water due to the activation of the natural petroleum-oxidizing microflora.

Key words: surfactants, glycolipids, biosynthesis, industrial waste.

Ключевые слова: поверхностно-активные вещества, гликолипиды, биосинтез, промышленные отходы.