CC BY
3Ветеринарный врач. 2024. № 6. С. 50 - 57 The Veterinarian. 2024; (6): 50- 57
Научная статья УДК 619:578.81
DOI: 10.33632/1998-698Х_2024_6_50
БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БАКТЕРИОФАГОВ К COR YNEBA CTERIUM PSEUDOTUBERCULOSIS С СЕЛЕКЦИЕЙ ШТАММА-КАНДИДАТА ДЛЯ СПЕЦИФИЧНОГО БИОПРЕПАРАТА
Хасан Абдулвахаб Мохаммад Джавад Алмуслимави , [email protected]. Николай Васильевич Пименов, доктор биологических наук, pimenov-nikolai@yandex. ru
Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии - МВА имени К. И. Скрябина, Москва, Российская Федерация
Автор, ответственный за переписку: Хасан Абдулвахаб Алмуслимави.
Аннотация. Альтернативная стратегия борьбы с патогенными бактериями на фермах -фаготерапия и фагопрофилактика, а также селективная деконтаминация. Corynebacterium pseudotuberculosis, вызывает лимфаденит у овец, коз, а также, реже, у коров и лошадей, в том числе участвуя в неспецифических инфекционно-воспалительных процессах, что приводит к значительным экономическим потерям. При этом методы контроля и лечения оказываются ограниченными и неэффективными. В данном исследовании были выделены новые бактериофаги, специфичные для C. pseudotuberculosis. Зона ингибирования бактериофагов имеет различную морфологию и размеры в диапазоне от 0,5 до 3 мм в диаметре. Все фаги идентифицированы как литические, результаты согласно методу Аппельмана варьируют от (10-2 до 10-7), а по методу Грациа - от (1х103 до 3*108). Отбор по литической активности позволил селекционировать наиболее вирулентный бактериофаг vB_Cps-H для дальнейших исследований. Отмечено, что этот бактериофаг обладает высокой специфичностью к хозяину, скоростью адсорбции (10 минут), латентным периодом (40 минут), урожайностью (34), широким спектром литической активности, удовлетворяющим свойствам штамма-кандидата. Стабилен в широком диапазоне рН (6,0-9,0) и температур (-20°C до 50°C), что может способствовать его применению в фаготерапии.
Ключевые слова: казеозный лимфаденит, Corynbacterium pesudotuberclosis, бактериофаг, штамм-кандидат, литическая активность, фаговый биопрепарат
Для цитирования: Алмуслимави Х.А, Пименов Н.В. Биологические свойства бактериофагов к Corynebacterium pseudotuberculosis с селекцией штамма-кандидата для специфичного биопрепарата // Ветеринарный врач. 2024. № 6. С.50 - 57. DOI: 10.33632/1998-698Х_2024_6_50
BIOLOGICAL PROPERTIES OF BACTERIOPHAGES TO CORYNEBACTERIUM PSEUDOTUBERCULOSIS WITH SELECTION OF A CANDIDATE STRAIN FOR A SPECIFIC
BIOLOGICAL PRODUCT
Hasan Abdulwahhab M. J. Almuslimawi, [email protected].
Nikolay V. Pimenov \ doctor of biological sciences, [email protected].
Moscow State Academy of Veterinary Medicine and Biotechnology - M.I. Skryabin MBA, Moscow, Russian Federation
Corresponding author: Hasan Abdulwahhab M. J. Almuslimawi.
Abstract. An alternative strategy for controlling pathogenic bacteria on farms is phage therapy and phage prophylaxis, as well as selective decontamination. Corynebacterium pseudotuberculosis causes lymphadenitis in sheep, goats, and also, less often, in cows and horses, including participating in nonspecific infectious and inflammatory processes, which leads to significant economic losses. At the same
time, the methods of control and treatment are limited and ineffective. In this study, new bacteriophages specific to C. pseudotuberculosis were isolated. The bacteriophage inhibition zone has different morphologies and sizes ranging from 0.5 to 3 mm in diameter. All phages were identified as lytic, the results according to the Appelman method range from (10-2 to 10-7), and according to the Grazia method -from (1x103 to 3*108). Selection by lytic activity allowed the selection of the most virulent bacteriophage vB_Cps-H for further research. It was noted that this bacteriophage has high host specificity, adsorption rate (10 minutes), latency period (40 minutes), yield (34), and a wide range of lytic activity satisfying the properties of the candidate strain. It is stable in a wide range of pH (6.0-9.0) and temperatures (-20°C to 50°C), which may contribute to its use in phage therapy.
Keywords: caseous lymphadenitis, Corynebacteriumpseudotuberculosis, bacteriophage
Введение. Казеозный лимфаденит (КЛА) у мелких жвачных вызывается Corynebacterium pseudotuberculosis, грамположительным факультативным внутриклеточным возбудителем. Это легко передающееся инфекционное заболевание, которым обычно заражаются овцы и козы [2]. Заболевание вызывает воспаление лимфатических узлов, приводящее к образованию казеозной творожистой массы, образованию абсцессов в поверхностных и внутренних лимфатических узлах, а также во внутренних органах [1]. Это заболевание широко распространено по всему миру и приводит к экономическим потерям при производстве мяса и молока [7]. Лечение пораженных животных заключается в дренировании абсцессов с последующим очищением и химическим прижиганием, обычно 10% раствором йода, или даже удалении пораженных поверхностных лимфатических узлов. Эта процедура может оказаться не столь эффективной, как ожидалось, из-за наличия внутренних абсцессов. Дренирование абсцесса должно быть произведено таким образом, чтобы избежать загрязнения окружающей среды, с дезинфекцией хирургического материала до и после процедуры, а все одноразовые материалы должны быть сожжены и закопаны в землю, включая пластик и бумагу [5]. Другим вариантом лечения является антибактериальная терапия, которая не достаточно эффективна, даже, несмотря на то, что C. pseudotuberculosis чувствителен in vitro почти ко всем протестированным антибиотикам. Внутриклеточное расположение бактерий и образование биопленки при естественных инфекциях снижают антибактериальную эффективность лекарств. Низкая эффективность и высокая стоимость лечения антибиотиками делают его неприемлемым мероприятием на уровне стада [4]. Целью данного исследования является поиск альтернативных методов лечения C. pseudotuberculosis, проявляющих высокую антибактериальную эффективность в отношении возбудителя, а, именно, выделение и характеристика литических бактериофагов, которые могут быть использованы в качестве антимикробных средств при C. pseudotuberculosis.
Материалы и методы. Целевые штаммы, к которым подбирали бактериофаги, были предоставлены из коллекции МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского, а также выделены авторами лично (Corynebacterium pseudotuberculosis (n = 6), C. xerosis (n =2), C. amycolatum (n =2), C. ammoniagenes (n = 4), C. minutissimum (n = 2), C. confusum (n = 2), C. stationis, Escherichia coli (n=3), Klebsiella pneumonia (n=3) и Staphylococcus aureus (n=2)). Во всех экспериментах Corynebacterium сначала высевали на колумбийский агар с добавлением 5 %-ной овечьей крови (производства «Condalab»), а затем выращивали на жидкой среде с сердечно-мозговой (СМ) вытяжкой («Condalab») с аэрацией, достигаемой встряхиванием, или высевали на СМ-агар. E. coli, K. pneumoniae, S. aureus культивировали на 5 %-ном кровяном агаре, а затем выращивали в мясопептонном бульоне (МПБ). C. pseudotuberculosis использовали для выделения и размножения бактериофагов и во всех других экспериментах. Другие виды бактерий использовали для определения спектра литической активности.
Для выделения ряда фагов в Московской области и Москве (виварий ФГБОУ ВО МГАВМиБ - МВА имени К.И. Скрябина) были собраны образцы речной воды, сточных вод, почвы и навоза. Бактериофаги, специфичные к Corynebacterium pseudotuberculosis, были выделены стандартными методами с некоторой модификацией [3, 6]. Речную и сточные воды центрифугировали при 10 000 х g в течение 10 мин для удаления твердых частиц, образцы почвы и навоза измельчали в ступке, эмульгировали, отфильтровывали через фильтровальную бумагу и центрифугировали при 10 000 х g в течение 30 мин для удаления твердых частиц. Затем супернатант использовали для выделения фагов различными методами.
Прямой метод выделения бактериофагов проводили путем спот-теста на газоне штамма-хозяина (без фильтра и с фильтром с диаметром пор 0,45 мкм). Выделение бактериофага методом обогащения «без подсева» проводили следующим образом: в супернатант добавляли жидкую
питательную среду («Brain heart infusion»), смесь инкубировали в термостате при температуре 37 °C в течение 18-20 часов. По истечении указанного срока полученную жидкость подвергали центрифугированию при 10 000 х g в течение 30 мин и затем проводили спот-тест на газоне штамма-хозяина (без фильтра и с фильтром с диаметром пор 0,45 мкм).
Выделение бактериофагов методом обогащения «с подсевом»: в супернатант добавляли жидкую питательную среду и одновременно с исследуемым материалом вводили 0,5-1 мл 3-6-часовой бульонной культуры или смыва с суточного агара культуры бактерий Corynebacterium pseudotuberculosis, Посевы инкубировали в термостате при температуре 37 °C в течение 18-24 часов. После центрифугирования смеси при 10 000 xg в течение 30 мин отбирали несколько миллилитров жидкости и затем ставили спот-тест на газоне штамма-хозяина (в образцах, полученных без фильтрации и с фильтрованием через фильтры с диаметром пор 0,45 мкм). Застывший верхний слой (BHI с 4 %-ным содержанием агара) содержал 107 КОЕ/мл клеток-хозяев [8]. Для обеспечения чистоты фага эту процедуру повторяли три раза подряд.
Литическую активность определяли количественным методом, а также полуколичественным по Аппельману. Стандартные чашки Петри заполняли 20-30 мл среды BHI, содержащей 1,5 % агара. На следующем этапе 2-3 мл 1 %-ной агарозы смешивали с 0,2 мл ранней фазы экспонирования (107) культур клеток-хозяев и выливали на нижний слой агара. Для определения титра фага в суспензии (количества фагов в мл) готовили серийные 10-кратные разведения в физиологическом растворе (NaCl 0,9 %; рН 7,1) или питательных средах. Затем по 25 мкл каждого разведенного фаголизата наносили на двойной слой агар/агарозы. Далее инкубировали при температуре 37 °C в течение 18-24 часов. Концентрацию фага определяли количественно, основываясь на количестве бляшек. Исследование методом Аппельмана было проведено в последовательном ряду десятикратных разведений тест-бактериофага. Затем во все пробирки добавляли по 1 капле (0,2 мл) 18-часовой бульонной культуры Corynebacterium pseudotuberculosis. Дополнительные пробирки 11 и 12 служили контрольными пробирками: одна из них содержала жидкую питательную среду и культуру (без фага), другая - питательную среду (контроль стерильности). Все пробирки выдерживали при температуре 37 °С в течение 18 часов. Литическую активность фага, выраженную в титре, определяли по последней пробирке, в которой нет помутнения или осадка. Титр фага по Аппельману выражали максимальным разведением фага, при котором происходил полный лизис соответствующей культуры.
Для определения диапазона специфичности и спектра литической активности для всех выделенных фагов тестировали различные штаммы бактерий: Corynebacterium, E. coli, K. pneumoniae и S. aureus. Диапазон хозяев был определен путем наблюдения за образованием зон ингибирования при помощи капельного анализа.
Для оценки стабильности фага в ходе теста на термическую инактивацию были изучены различные температуры: -20 °C (1 ч), 40 °C (1 ч), 50 °C (1 ч), 60 °C (1 ч), 70 °C (1 ч), 80 °C (1 час). Для посева готовили и использовали последовательные 10-кратные разведения в соответствующей среде. В качестве контроля использовали фаги, которые не подвергались термической инактивации. После инкубации в течение 18 часов при температуре 37 °C был рассчитан процент оставшихся фагов, способных образовывать бляшки. Стабильность фага при различных значениях рН (2-12) оценивали путем инкубации при 25°С в течение 1 ч. Титр бактериофага оценивали по Грациа. Все анализы повторяли трижды.
Адсорбцию бактериофага, специфичного для C. pseudotuberculosis, оценивали следующим образом: экспоненциально растущие бактериальные клетки смешивали с бактериофагом (M0I=0,001) и инкубировали при комнатной температуре. Через 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 13, 15, 20 и 25 минут отбирали аликвоты по 100 мкл, смешивали с 900 мкл буфера SM и двумя каплями хлороформа. Затем образцы центрифугировали при 5000 g в течение 5 минут при температуре 4 °C. Титр фага определяли путем расчета БОЕ в 500 мкл супернатанта методом двойных слоев агара. Титр фага в нулевой момент времени определяли как 100 % от относительного титра фага.
Латентный период и размер взрыва (урожайность) фагов C. pseudotuberculosis определяли путем мониторинга динамических изменений количества фаговых частиц в течение репликативного цикла на штамме Corynebacterium pseudotuberculosis 1463. Для этого 5 мл бактериальных клеток инкубировали при 37 °C до середины экспоненциальной стадии роста (0D600=0,3), далее 5 мл полученной жидкой бактериальной культуры центрифугировали при 4 °С, 5 минут, 7000 g. Осадок ресуспендировали в 0,5 мл свежего бульона CM и смешивали с бактериофагом таким образом, что M0I=0,01-0,005. Смесь бактериофага и бактериальных клеток инкубировали 5 минут при температуре 37 °С. Не адсорбированные фаги удаляли путём центрифугирования в течение 3 минут
при 13000 g. Осадок ресуспендировали в 10 мл предварительно подогретой обогащенной среде -luria broth (LB). Образцы отбирали через 10 минутные интервалы в течение 2 часов и немедленно титровали. Выход бактериофага определяли как отношение максимального количества высвободившихся фаговых частиц (максимального количества негативных колоний) в конце размножения к количеству инфицированных бактериальных клеток (к числу негативных колоний) во время латентного периода. Результаты представлены как средний титр фага, а размер взрыва был рассчитан как отношение среднего максимального количества высвободившихся частиц в конце размножения к среднему значению фаговых частиц во время латентного периода. Результаты представляли собой среднее трех повторностей ± стандартное отклонение.
Статистический анализ проводился путем применения одностороннего метода ANOVA к полученным данным с использованием программного обеспечения GraphPad Prism версии 5.0 («GraphPad Software»).
Результаты исследований и их обсуждение. Согласно результатам выборочного анализа, представленным в таблице 1, мы обнаружили бактериофаги в навозе из 7 образцов материала, полученных в Московской области (ПР «Васильевское», МТФ «Озерецкое», «Алферьево» Сергиев-Посадского района - КРС, ООО «Шульгино» Волоколамского района - МРС (козы)) и виварии МГАВМиБ - МВА имени К.И. Скрябина (конюшня и отделение для КРС и МРС). В других материалах мы не обнаружили бактериофагов, специфичных к C. pseudotuberculosis. Идентифицированные фаги были очищены ультрацентрифугированием. В результате мы получили 10 выделенных фагов, таблица 1 содержит результаты о происхождении, свойствах и литической активности выделенных фагов. Номенклатура была разработана в соответствии с А.М. Кропинским [9]. Зона ингибирования бактериофагов имеет различную морфологию и размеры - от 0,5 до 3 мм в диаметре. Все фаги были идентифицированы как литические бактериофаги, результаты по методу Аппельмана варьировали от (10-2 до 10-7), по методу Грациа - от (1х103 до 3х108).
Таблица 1 - Свойства и литическая активность бактериофагов Corynebacterium pseudotuberculosis
Наименование изолята бактериофага Corynebacterium pseudotuberculosis и номер штамма приложения Происхождение Негативные колонии Литическая активность
Морфология Диаметр, мм по методу Аппельмана по методу Грациа, БОЕ / мл
vB Cps-Z1 B-826 навоз МТФ «Озерецкое» прозрачный центр 0,5- 1,0 10-2 1х103
vB Cps-Z2 B-826 навоз МТФ «Озерецкое» прозрачный центр 0,5- 1,0 10-4 2х104
vB Cps-H B-1463 навоз телятник МТФ «Озерецкое» прозрачный центр с ореолом 2,0-3,0 10-7 3х108
vB Cps-N B-1089 навоз МТФ «Алферьево» прозрачный центр,мутный край 1,0-2,0 10-4 2 х 105
vB Cps-M1 B-826 навоз МТФ изолятор «Озерецкое» прозрачный центр с ореолом 1,0-2,0 10-6 8х106
vB Cps-M2 B-826 навоз МТФ изолятор «Озерецкое» прозрачный центр 0.5- 1,0 10-7 5х107
vB Cps-M3 B-1463 навоз из козьего сарая ООО «Шульгино» мутный центр 0.5- 1,0 10-6 1х106
vB Cps-E1 B-1463 навоз из козьего сарая ООО «Шульгино» прозрачный центр 0.5- 1,0 10-5 2х105
vB Cps-E2 B-1089 навоз из вивария МГАВМиБ, отдел КРС, МРС прозрачный центр с ореолом 0.5- 1,0 10-3 4х104
vB Cps-E3 B-1089 навоз из вивария МГАВМиБ, конюшня прозрачный центр 0.5- 1,0 10-6 6х106
Для дальнейших исследований определили бактериофаг vB_Cps-H как наиболее литически активный. Рисунок 1 представляет морфологию зоны ингибирования роста гомологичной культуры фага vB_Cps-H на Corynebacterium pseudotuberculosis. vB_Cps-H фаги имеют большую зону ингибирования (2-3 мм) и способность образовывать пустотелую зону (3-5 мм). В течение 48-72 ч инкубации эти фаги обладают высокой литической активностью по методикам Аппельмана (10-7) и Грациа (3*108 БЕ/мл). Бактериофаг vB_Cps-H был устойчив к хлороформу, но фаг не может пройти через мембранный фильтр (0,22 мкм, 0,45 мкм), возможно, фаг vB_Cps-H принадлежит к группе бактериофагов-гигантов (джамбо-фаги).
Рисунок 1 - Морфология зоны ингибирования фага C. pseudotuberculosis vB_Cps-H после
72-часовой инкубации
L_J
Чтобы определить диапазон хозяев фага vB_Cps-H была протестирована его вирулентность на грамположительные и отрицательные (28) бактерии C. pesudotubeclosis (n = 6), C. xerosis (n =2), C. amycolatum (n =2), C. ammoniagenes (n = 4), C. minutissimum (n = 2), C. confusum (n = 2), C. stationis (n = 2), E. coli (n = 3), S. aureus (n = 3), K. pneumoniae (n = 2). Фаг демонстрирует четкую отрицательную зону ингибирования на всех шести культурах Corynbacterium pseudotuberclosis и фаг не образовывал зон негативного роста на других бактериях. Фаг vB_CpsH продемонстрировал очень высокую специфичность и литическую активность к хозяину. vB_CpsH не проявлял никакой литической активности в отношении штаммов E. coli, S. aureus, K. pneumoniae и других видов коринебактерий, что делает его подходящим средством для фаготерапии C. pseudotuberculosis без повреждения нормальной флоры и полезных бактерий.
Стабильность фага определяли путем мониторинга изменения титра при различных значениях рН и температуры. Активность фага оставалась на высоком уровне после 1 часа инкубации при температуре от -20 до 50 °C, тогда как после инкубации при 60 °C наблюдалось значительное снижение титров (Р <0,001). Данные представлены графически на рисунке 2.
Фаг был стабилен в течение 1 часа при значениях рН в диапазоне от 6 до 9, в то время как значительное снижение активности наблюдалось при значениях рН 4, 5, 10, 11 и 12 (Р<0,001). Активный фаг не был обнаружен при значениях рН 3 и 2 после 1 часа инкубации (см. рисунок 3). Его стабильность делает его пригодным для большинства терапевтических применений, за исключением перорального приема, поскольку кислая среда желудка инактивирует фаг.
Рисунок 2 - Влияние различных температур на бактериофаг уВ_Ср8-Н. Значения Р (***р <0,001) СТ: Сравнение с контролем в каждом эксперименте
Рисунок 3 - Влияние различных рН на бактериофаг vB_Cps-H. Значения Р (***р <0,001) СТ: Сравнение с контролем в каждом эксперименте
Чтобы рассчитать скорость адсорбции фага его бактериальным хозяином измеряли зависящую от времени адсорбцию фагов бактериальными клетками путем простой совместной инкубации и последующего подсчета фаговых частиц, присутствующих в супернатанте. После инкубации со штаммом-хозяином C. pesudotuberclosis (№1463 коллекции МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского) в течение 10 мин более 90 % фагов адсорбировались на поверхности бактерии. Через 20 мин более 95 % фагов остались прикрепленными к хозяину (см. рисунок 4). Наблюдаемые скорости адсорбции могут быть сопоставлены с экспоненциальной реакцией распада, при которой половина фага присоединяется к клетке-хозяину примерно за 9 минут. Для определения скорости адсорбции фага vB_Cps-H его использовали для заражения растущей культуры C. pseudotuberculosis 1463 с MOI, равным 0,01, и наблюдали высвобождение фаговых частиц после латентного периода, составляющего приблизительно 40 минут (см. рисунок 5). Полный лизис всех клеток наблюдался через 100 минут. Измерение количества фаговых частиц, которые высвобождались из каждой клетки, позволило определить, что приблизительно 34±4 фага, образуются в среднем на одну клетку. Урожайность фага vB_Cps-H составила 34±4 вирионов из клетки (рисунок 5), что, наряду с уставноленными биологическими свойствами литической активности, устойчивости, специфичности, спектра вирулентности, латентного периода и скорости адсорбции, удовлетворяет свойствам штамма-кандидата для прототипирования лечебно-профилактических препаратов.
Рисунок 4 - Скорость адсорбции бактериофаг vB_Cps-H. Значения скорости адсорбции бактериофага являются средними ± SD (стандартное отклонение) по результатам трехкратных анализов
Рисунок 5 - Латентный период и урожайность бактериофаг vB_Cps-H. Значения латентного периода и размера порции бактериофага являются средними ± SD (стандартное отклонение) по результатам трехкратных анализов
Заключение. В результате проведенной работы на первоначальном этапе полевыми скрининговыми исследованиями получены и исследованы десять новых бактериофагов, специфичных для Corynebacterium pseudotuberculosis. Фаг vB_Cps-H проявил высокий потенциал для контроля и ингибирования роста C. pseudotuberculosis благодаря своей способности к адсорбции, стабильности, активности лизиса. Также выделены вирулентные фаги (vB_Cps-M1, vB_Cps-M2, vB_Cps-E3), которые требуют дополнительного изучения с целью создания эффективной комбинации фагов, воздействующих на возбудителя. Полученные данные позволят создать платформу нового лекарственного средства со специфическим антибактериальным действием против Corynebacterium pseudotuberculosis, возбудителя казеозного лимфаденита (КЛА) у мелких жвачных и вероятного участника патогенеза ряда других инфекционно-воспалительных патологий животных.
Список источников
1. de Oliveira Zamprogna T., Ribeiro D., Azevedo V.A.C., et al. Bacteriological, cytological, and molecular investigation of Corynebacterium pseudotuberculosis, mycobacteria, and other bacteria in
caseous lymphadenitis and healthy lymph nodes of slaughtered sheep // Braz J Microbiol. - 2021. - N 52(1). - pp. 431-438.
2. de Pinho R. B., de Oliveira Silva M. T., Bezerra F. S. B., Borsuk S. Vaccines for caseous lymphadenitis: up-to-date and forward-looking strategies // Applied microbiology and biotechnology. -2021. -N. 105(6). - pp. 2287-2296.
3. Kropinski A. M., Mazzocco A., Waddell T. E., Lingohr E., Johnson R. P. Enumeration of bacteriophages by double agar overlay plaque assay // Methods in molecular biology. -2009. - N. 501. - pp.69-76.
4. Marques da Silva W., Seyffert N., Silva A., Azevedo V. A journey through the Corynebacterium pseudotuberculosis proteome promotes insights into its functional genome // Peer J. - 2021. - N. 9.
5. Terab A. M. A., Abdel Wahab, G. E. D., Ishag H. Z. A., Khalil N. A. H., El Tigani-Asil, E. T. A., Hashem, F. M., Khalafalla A. I., Shah A. A. M. Al Muhairi, S. S. M. Pathology, bacteriology, and molecular studies on caseous lymphadenitis in Camelus dromedarius in the Emirate of Abu Dhabi, UAE, 2015-2020 // PloS one. - 2021. - N. 16(6).
6. Wommack K. E., Williamson K. E., Helton R. R., Bench, S.R., Winget, D M. Methods for the Isolation of Viruses from Environmental Samples. In: Clokie, M.R., Kropinski, A.M. (eds) // Bacteriophages. Methods in Molecular Biology™. - 2009. - N. 501.
7. Алмуслимави Х. А., Пименов Н. В. Эпизоотология зоопатогенных коринебактерий // Ветеринария, зоотехния и биотехнология. -2022. 12, - №2. - С. 33-42.
8. Общая и санитарная микробиология с техникой микробиологических исследований: Учебное пособие / Под ред. А.С. Лабинской, Л.П. Блинковой, А.С.Ещиной. - М.: Медицина, 2004.-576 с.
References
1. de Oliveira Zamprogna T., Ribeiro D., Azevedo V.A.C., et al. Bacteriological, cytological, and molecular investigation of Corynebacterium pseudotuberculosis, mycobacteria, and other bacteria in caseous lymphadenitis and healthy lymph nodes of slaughtered sheep // Braz J Microbiol. - 2021. - No 52(1). - P. 431-438.
2. de Pinho R. B., de Oliveira Silva M. T., Bezerra F. S. B., Borsuk S. Vaccines for caseous lymphadenitis: up-to-date and forward-looking strategies // Applied microbiology and biotechnology. - 2021. -No.105(6). - P. 2287-2296.
3. Kropinski A. M., Mazzocco A., Waddell T. E., Lingohr E., Johnson R. P. Enumeration of bacteriophages by double agar overlay plaque assay // Methods in molecular biology. - 2009. - No. 501. - P. 69-76.
4. Marques da Silva W., Seyffert N., Silva A., Azevedo V. A journey through the Corynebacterium pseudotuberculosis proteome promotes insights into its functional genome // Peer J. - 2021. - No. 9.
5. Terab A. M. A., Abdel Wahab, G. E. D., Ishag H. Z. A., Khalil N. A. H., El Tigani-Asil, E. T. A., Hashem, F. M., Khalafalla A. I., Shah A. A. M. Al Muhairi, S. S. M. Pathology, bacteriology, and molecular studies on caseous lymphadenitis in Camelus dromedarius in the Emirate of Abu Dhabi, UAE, 2015-2020 // PloS one. - 2021. No- 16(6).
6. Wommack K. E., Williamson K. E., Helton R. R., Bench, S.R., Winget, D M. Methods for the Isolation of Viruses from Environmental Samples. In: Clokie, M.R., Kropinski, A.M. // Bacteriophages. Methods in Molecular Biology™. - 2009. - No. 501.
7. Almuslimavi H. A., Pimenov N. V. Epizootology of zoopathogenic corynebacteria // Veterinary medicine, animal science and biotechnology. - 2022. 12, - No 2. - P. 33-42.
8. General and sanitary microbiology with microbiological research techniques: Textbook / Edited by A.S. Labinskaya, L. P. Blinkova, A.S. Eschina. - M.: Medicine, 2004. - 576 p.
Все авторы сделали эквивалентный вклад в подготовку публикации.
Авторы подтверждают отсутствие конфликта финансовых/нефинансовых интересов, связанных с
написанием статьи.
All authors have made an equivalent contribution to the preparation of the publication.
The authors declare that there is no conflict of interest.
Принята к публикации / accepted for publication 08.05.2024;
© Алмуслимави Х.А, Пименов Н.В. 2024
