CC BY
2Ветеринарный врач. 2024. № 6. С. 75 - 79 The Veterinarian. 2024; (6): 75 - 79
Научная статья
УДК 619 :617.711/713-002-022
DOI: 10.33632/1998-698Х_2024_6_75
СЕЛЕКЦИЯ ШТАММОВ-КАНДИДАТОВ БАКТЕРИОФАГОВ ПРОТИВ
MORAXELLA BOVOCULI
Захраа Сахиб Мохаммед, [email protected]
Николай Васильевич Пименов, доктор биологических наук, [email protected]
Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии - МВА имени К. И. Скрябина, Москва, Российская Федерация
Автор, ответственный за переписку: Захраа Сахиб Мохаммед.
Аннотация. В связи с появлением штаммов Moraxella spp. с множественной лекарственной устойчивостью становится необходимым поиск альтернативных противомикробных средств лечения и профилактики моракселлезной инфекции, в частности, инфекционного кератоконьюнктивита крупного рогатого скота. Целью данного исследования было выделение новых видоспецифичных бактериофагов против Moraxella bovoculi и оценка их потенциала и эффективности для использования в качестве терапевтического антибактериального средства. M. bovoculi были использованы в качестве штамма-хозяина. Из проб воды был выделен литический фаг, обозначенный как vB_Mboc-ISR003. Активность фага оставалась на высоком уровне после 1 часа инкубации при температуре от 4 до 30°C и была довольно стабильной в течение 1 часа при значениях рН от 5 до 9. Латентный период и размер вспышки составляли приблизительно 40 мин и 54 ± 9 фагов на клетку-хозяина соответственно. Было продемонстрировано, что использование фага vB_Mboc-ISR003 обладает высоким потенциалом для разработки альтернативной стратегии борьбы с Moraxella bovoculi при воспалении глаз у крупного рогатого скота.
Ключевые слова: Moraxella bovoculi, инфекционный кератоконъюнктивит, фаг, крупный рогатый скот, воспаление глаз
Для цитирования: Мохаммед З.С., Пименов Н.В. Селекция штаммов-кандидатов бактериофагов против Moraxella bovoculi // Ветеринарный врач. 2024. №6. С. 75 - 79. DOI: 10.33632/1998-698Х_2024_6_75
SELECTION OF CANDIDATE STRAINS OF BACTERIOPHAGES AGAINST MORAXELLA BOVOCULI
Zahraa S. Mohammed, [email protected]
Nikolay V. Pimenov, doctor of biological sciences, [email protected]
Moscow State Academy of Veterinary Medicine and Biotechnology - M.I. Skryabin MBA, Moscow, Russian Federation
Corresponding author: Zahraa Sahib Mohammed.
Abstract. Due to the appearance of strains of Moraxella spp. With multidrug resistance, it becomes necessary to search for alternative antimicrobial agents for the treatment and prevention of moraxella infection, in particular, infectious bovine keratoconjunctivitis. The aim of this study was to isolate new species-specific bacteriophages against Moraxella bovoculi and evaluate their potential and effectiveness for use as a therapeutic antibacterial agent. M. bovoculi was used as a host strain. A lytic phage designated as vB_Mboc-ISR003 was isolated from water samples. Phage activity remained at a high level after 1 hour of incubation at temperatures from 4 to 30 °C and was fairly stable for 1 hour at pH values from 5 to 9. The latency period and flash size were approximately 40 min and 54 ± 9 phages per host cell, respectively. It has been demonstrated
that the use of the vB_Mboc-ISR003 phage has a high potential for developing an alternative strategy to combat Moraxella bovoculi in bovine eye inflammation.
Keywords: Moraxella bovoculi, infectious keratoconjunctivitis, phage, cattle, eye inflammation
Введение. Moraxella bovoculi - грамотрицательные диплококки, относящиеся к типу протеобактерий классу гаммапротеобактерий отряду псевдомонад семейства Moraxellaceae [1]. Сообщалось, что Moraxella bovoculi ассоциируется с заболеваемостью инфекционным кератоконъюнктивитом (ИК) крупного рогатого скота [1]. ИК поражает крупный рогатый скот и овец, характеризуется развитием конъюнктивита и язв роговицы [2]. Это заболевание является наиболее распространенным глазным заболеванием крупного рогатого скота, включая такие симптомы, как изъязвление и отек роговицы, блефароспазм, светобоязнь и слезотечение. Его экономический ущерб весьма значителен, поскольку стратегии профилактики и лечения часто неэффективны [3]. Тактика лечения ИК в большинстве случаев основана на применении антибактериальных композиций на основе химиотерапевтически активных веществ. Как правило, средства в хозяйствах используют на основе эмпирического опыта, без проведения исследования чувствительности к антибиотикам полевых штаммов возбудителя, и, следовательно, получают противоречивые результаты. Часто первоначальная положительная клиническая динамика сменяется рецидивами, кератопатиями, приводит к помутнению роговицы, снижению племенных качеств и продуктивности крупного рогатого скота [4]. Этим обосновывается актуальность поиска альтернативных методов лечения с достоверной и стабильной эффективностью, среди которых - использование бактериофагов при лечении бактериальных инфекций. Отдельные попытки использовать различные бактериофаги при лечении инфекционных заболеваний животных предпринимались еще в 1910-1930-х годах. Феликс Д'Эрель (1917) пытался использовать фаги при пуллорозе-сыпном тифе у кур. На современном этапе фаготерапия вновь приобретает актуальность ввиду глобализации проблемы антибиотикорезистентности бактериальных патогенов. Ввиду вышесказанного, выделение специфических бактериофагов к Moraxella для лечения этого заболевания из-за его экономической важности имеет научно-практический интерес.
Цель исследования: изоляция бактерии Moraxella из глаз скота, пораженного инфекционным кератоконъюнктивитом; изоляция бактериофагов из окружающей среды, эффективных против изолированной бактерии Moraxella, и их использование для разработки лечения против кератоконъюнктивита и ограничения его распространения.
Материалы и методы. Moraxella bovoculi была выделена из глаз инфицированного крупного рогатого скота, при выделении использовались стандартные микробиологические методы. Полученные изоляты были использованы для выделения и размножения бактериофагов, а, также, использовались во всех других экспериментах. Бактерии культивировали на 10 % кровяном агаре и в соевом бульоне с триптофаном и добавлением МПБ с сывороткой при температуре 37 °C.
Из московского водоканала было взято несколько проб сточных вод, которые затем были использованы для выделения специфического фага M. bovoculi в соответствии со стандартным методом (spot test) с некоторыми изменениями [5]. После фильтрации материала 5 мл образцов смешивали с 5 мл ранней экспоненциальной культуры M. bovoculi и инкубировали при 37 °C в течение 24 часов, затем культуры центрифугировали при 10 000 об/мин. в течение 10 мин, а надосадочные жидкости фильтровали через мембрану с размером пор 0,22 мм для удаления остатков бактерий. 50 мкл отфильтрованного обогащенного материала вносили на поверхность отвердевшего верхнего слоя агара (BHI с 6 %-ным содержанием агара) после добавления бактериальной клетки-хозяина, которая содержала 107 КОЕ/мл из суточной культуры. После появления налета отфильтрованный обогащенный материал, полученный на предыдущем этапе, последовательно разбавляли (10-1 -10-10 ) в физиологическом растворе (рн 7,5) путем добавления 0,5 мл бактерий к 4,5 мл физиологического раствора, а затем добавляли 1 мл расплавленного мягкого агара (BHI с 0,7%-ным содержанием агара) при температуре 42 °C. Наконец, смесь переливали на агар с твердым слоем (Агар Мюллера-Хинтона), чтобы получить двухслойные агаровые пластины. Через 24 часа стерильной пастеровской пипеткой удаляли единичный прозрачный налет и переносили его в пробирку, содержащую 500 мкл физиологического раствора, затем подвергали гомогенизации и инкубации (при температуре 4 °C в течение 1 часа).
Специфичность фагов исследовали методом выборочного тестирования [5]. Как описано выше, в этом тесте были использованы штаммы M. bovoculi, другие виды Moraxella, а также различные грамположительные и отрицательные стандартные штаммы.
Исследование активности бактериофагов проводили по методу Аппельмана. В ряд стерильных пробирок наливали по 4,5 мл питательной среды. В первую пробирку добавляли 0,5 мл тестируемого
фага, который затем последовательно разбавляли кратностью 10 десять разведений. Затем во все пробирки добавляли по 1-2 капли суточной культуры раннего логарифмического роста и инкубировали в термостате при температуре 37 °C в течение 18 часов.
Испытания на стабильность проводили, как описано ранее, с некоторыми изменениями [5]. Чтобы оценить стабильность фага при различных температурах, суспензии фагов (разведенные в физиологическом растворе, 100 мкл) помещали в микротрубочки и инкубировали при температуре -20, 4, 25, 30, 40, 50, 60, 70 и 80°C в течение 1 часа. Стабильность фага при различных значениях рН (212) оценивали путем инкубации при 25 °С в течение 1 ч. Титр бактериофага оценивали методом двухслойного агара [6].
Для оценки адсорбционных свойств было приготовлено 200 мл культуры M. bovoculi в ранней логарифмической фазе (0,5 по шкале McFarland'а) и поровну разлито в два стерильных флакона. Для определения скорости адсорбции фага в один флакон добавляли суспензию фага в концентрации 106. В другой фаг не добавляли, он содержал только питательную среду и культуру (контроль). После определенных интервалов инкубации (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 и 25 мин) при температуре 40 °C отбирали образцы (50 мкл) и удаляли адсорбированные фагами клетки центрифугированием при 13000 об. /мин. в течение 30 с. Наконец, титр свободных фагов в супернатанте определяли двухслойным методом [6].
Латентный период и урожайность фаговых культур исследовали в цикле одиночного развития. Клетки M. bovoculi собирали центрифугированием после того, как их культура достигала соответствующей оптической плотности (OD) (OD600 = 0,5). Затем полученный осадок ресуспендировали в 0,5 мл физиологического раствора и смешали с 200 мкл разведенного фага 106. После этого смесь инкубировали в течение 1 минуты, а затем центрифугировали для удаления не впитавшихся фагов. Гранулы ресуспендировали в 10 мл свежей бульонной среды и инкубировали при температуре 37 °C. Каждые 5 мин отбирали пробы по 500 мкл и использовали метод двухслойного агара для определения титров фагов. Все процедуры были повторены в трех независимых повторениях.
Результаты исследований и их обсуждение. Из проб сточных вод Московского водоканала были выделены пять фагов, среди которых один фаг с прозрачным налетом (диаметром 1 -2 мм) был выбран для дальнейших исследований и обозначен как vB_Mboc-ISR003. Чтобы оценить диапазон хозяев vB_Mboc-ISR003, его инфекционность была протестирована на трех видах Moraxella методом точечного тестирования. Для определения литического спектра и специфичности фага vB_Mboc-ISR003 использовали Moraxella bovis (n = 3), M. bovoculi (n = 3), М. ovis (n = 1), Escherichia coli (n=1), Klebsiella pneumoniae (n=2), Streptococcus pneumoniae (n=2). Фаг vB_Mboc-ISR003 показал очень высокий уровень специфичности и способность лизировать все штаммы M. bovoculi, а также способность частично ингибировать М. ovis и M. bovis. vB_Mboc-ISR003 не проявил никакой литической активности в отношении другогих протестированных штаммов бактерий. Этот фаг показал высокую специфичность в отношении ряда хозяев, что делает его подходящим средством для фаготерапии и биоконтроля, не повреждая нормальную флору и полезные бактерии.
Результаты полуколичественного определения титра, или титрования по Аппельману, определяются максимальным разведением фага, при котором произошел полный лизис соответствующей культуры. Литическую активность фага, выраженную в титре, определяли по последней пробирке, в которой нет помутнения или осадка. Выделенный бактериофаг vB_Mboc-ISR003 давал лизис в первых 8 пробирках серии.
Стабильность фага определяли путем мониторинга изменений титра vB_Mboc-ISR003 при различных значениях рН и температуре. Испытания на термостабильность показали, что фаг vB_Mboc-ISR003 был активен в значительно широком диапазоне температур, а именно от минус 20° C до плюс 50° C в течение 1 часа. Фаг vB_Mboc-ISR003 был полностью неактивен при температуре плюс 70°C, при этом активность фага значительно снижалась при температуре 60°C (значение P <0,001), однако стабильность фага не снижалась после инкубации в течение одного часа в диапазоне температур от плюс 4° до плюс 30°C (рисунок 1А). Кроме того, фаг vB_Mboc-ISR003 сохранял свою активность в широком диапазоне рН(5-9), при этом наибольший титр наблюдался при рН = 7. Однако активность резко снижалась как при рН = 3, так и при рН = 10 (значение Р<0,001) и была неактивной при рН = 2 (рисунок 1B).
Результаты анализа скорости адсорбции были представлены в виде линейного графика на рисунке 2, который иллюстрирует процентное содержание не адсорбированного фага в течение определенного времени. Уровень адсорбции фаговых частиц бактериальными клетками (0,5 по шкале McFarland^) при температуре 40 °C показал, что время, необходимоеM. bovoculi для начала адсорбции фагов, составляет почти 3 минуты после представления фага его хозяину. Более того, результаты также
показали, что наибольшее количество фагов адсорбировалось через 20 минут, когда адсорбировалось 85,29 %.
Рисунок 1 - Стабильность фага уБ_МЬос-КЯ003 в различных условиях. (А) Термостабильность фага уБ_МЬос-18Я003, инкубированного при различных температурах в течение одного часа. (В) Стабильность рН фага уБ_МЬое-18Я003, инкубированного при различных значениях рН в течение одного часа
о 10 20 30
время (минуты)
Рисунок 3 - Латентный период действия фага \ B_IVIboc-ISR003
10вп
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130
время мин
Был оценен латентный период действия фага vB Mboc-ISR003 против M. bovoculi (время между адсорбцией фага и высвобождением) в дополнение к размеру вспышки (количеству высвобожденных вирионов на одну бактерию) фага vB Mboc-ISR003. Результаты показали, что латентный период и размер вспышки составляли приблизительно 40 мин и 54 фага на клетку-хозяина соответственно (рисунок 3). Большой размер спышки может повысить эффективность фаготерапии, поскольку размер вспышки, очевидно, связан с литической активностью и размножением фага. Фаг vB_Mboc-ISR003 имеет относительно большой размер вспышки (54 ± 9 вирионов на клетку) и средний латентный период (40 мин); это указывает на то, что фаг vB_Mboc-ISR003 обладает достаточной литической активностью для использования в терапии.
Заключение. В этом исследовании был охарактеризован новый специфический для M. bovoculi фаг (vB_Mboc-ISR003). Основываясь на диапазоне хозяев, характеристиках стабильности, активности лизиса, размере вспышки, фаг vB_Mboc-ISR003 показал большой потенциал для разработки в качестве альтернативной терапевтической стратегии против M. bovoculi, вызывающих воспаление глаз у крупного рогатого скота. Но для разработки нового терапевтического препарата необходимо изучение генетического материала фага, выделение новых вирулентных фагов для приготовления фагового коктейля и испытание прототипа.
Финансирование исследования. Исследование выполнено за счёт гранта Российского научного фонда № 24-26-00168 https://rscf.ru/project/24-26-00168/
Список источников
1. John A. Angelos, Phillip Q. Spinks, Louise M. Ball, Lisle W. George. Moraxella bovoculi sp.nov., isolated from calves with infectious bovine keratoconjunctivitis // Int J Syst Evol Microbiol. 2007, № 57. - pp.789795.
2. Baptista PJHP. Infectious bovine keratoconjunctivitis: a review // Br Vet J. 1979, № 135. - pp. 225-242.
3. Snowder G.D., Van Vleck L.D., Cundiff L.V., Bennett G.L. Genetic and environmental factors associated with incidence of infectious bovine keratoconjunctivitis in preweaned beef calves // J Anim Sci .2005, № 83. - pp. 507-518.
4. Мохаммед З.С., Пименов Н.В. Патогенная роль Moraxella и направления в борьбе с моракселлезной инфекцией. // Ветеринария, зоотехния и биотехнология. - 2023, №1. - С. 73-83.
5. А.С.Лабинской, Л.П.Блинковой, А.С. Ещиной" (редакцией)" (2004) Общая и санитарная микробиология с техникой мик 029 робиологических исследований: Учебное пособие . — 576 с.
6. Kropinski AM, Mazzocco A, Waddell TE, Lingohr E, Johnson RP. // Enumeration of bacteriophages by double agar overlay plaque assay, Bacteriophages Methods Protoc .2009, № 1. - pp. 69-76.
References
1. John A. Angelos, Phillip Q. Spinks, Louise M. Ball, Lisle W. George. Moraxella bovoculi sp. nov., isolated from calves with infectious bovine keratoconjunctivitis // Int J Syst Evol Microbiol. 2007, No 57. - p.789-795.
2. Baptista PJHP. Infectious bovine keratoconjunctivitis: a review // Br Vet J. 1979, No 135. - p. 225-242.
3. Snowder G.D., Van Vleck L.D., Cundiff L.V., Bennett G.L. Genetic and environmental factors associated with incidence of infectious bovine keratoconjunctivitis in preweaned beef calves // J Anim Sci .2005, No 83. - p. 507-518.
4. Mohammed Z.S., Pimenov N. V. Pathogenic role of Moraxella and directions in the fight against moraxella infection. // Veterinary medicine, animal science and biotechnology. - 2023, No 1. - p. 73-83.
5. A.S. Labinskaya, L.P. Blinkova, A.S. Eshchina."(Eds)" (2004) General and sanitary microbiology with microbiological research techniques. textbooks. — 576 p.
6. Kropinski AM, Mazzocco A, Waddell TE, Lingohr E, Johnson RP. // Enumeration of bacteriophages by double agar overlay plaque assay, Bacteriophages Methods Protoc .2009, No 1. - p. 69-76.
Все авторы сделали эквивалентный вклад в подготовку публикации.
Авторы подтверждают отсутствие конфликта финансовых/нефинансовых интересов, связанных с написанием статьи.
All authors have made an equivalent contribution to the preparation of the publication. The authors declare that there is no conflict of interest.
Принята к публикации / accepted for publication 08. 05. 2024;
© Мохаммед З.С., Пименов Н. В. 2024
