CC BY
52
Ri'qi: - tmy Mcchanisms
înTïiosystems
* %
Regulatory Mechanisms
in Biosystems
ISSN 2519-8521 (Print) ISSN 2520-2588 (Online) Regul. Mech. Biosyst., 8(4), 469-475 doi: 10.15421/021772
Biological peculiarities of a rare medicinal mushroom Fomitopsis officinalis (Fomitopsidaceae, Polyporales) on agar media and plant substrates
О. B. Mykchaylova*, N. А. Bisko*, М. М. Sukhomlyn**, М. L. Lomberg*, М. V. Pasaylyuk***, Y. V. Petrichuk***, A. P. Gryganskyi****
*M. G. Kholodny Institute of Botany of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, Ukraine **Taras Shevchenko National University of Kyiv, Kyiv, Ukraine ***Hutsulshchyna National Nature Park, Kosiv, Ukraine ****LFLambert Spawn Co., Coatesville, USA
Mykchaylova, O. B., Bisko, N. A., Sukhomlyn, M M, Lomberg, M L., Pasaylyuk, M V., Petrichuk, Y V., & Gryganskyi, A P. (2017). Biological peculiarities of a rare medicinal mushroom Fomitopsis officinalis (Fomitopsidaceae, Polyporales) on agar media and plant substrates. Regulatory Mechanisms in Biosystems, 8(4), 469-475. doi:10.15421/021772
Fomitopsis officinalis (Vill.) Bondartsev & Singer is a rare and endangered medicinal mushroom, known in medical practice as agarikon. Strain 5004 of F. officinalis from the IBK Mushroom Culture Collection of M. G. Kholodny Institute of Botany was verified using morphological and molecular genetic techniques. DNA analysis shows 99% identity of the investigated strain to other F. officinalis sequences deposited in NCBI databases. The results of the study of the biological characteristics of F. officinalis 5004 on agar nutrient media and plant substrates of various compositions are presented. We observed the microstructures of F. officinalis culture using light and scanning electron microscopy. The hyphae have regular unilateral clamp connections of two types: without a slit and rare medallion-type clamps, some anastomoses and mycelial cords as well as blastoconidia after prolonged cultivation (more than 30 days). The incrustation of the hyphae in the form of thin villi is revealed for the first time. The morphology of the mycelial colonies of F. officinalis depended on the composition of the nutrient medium. According to the radial growth rate the culture of investigated species belongs to the fungi growing very slowly within 0.4-1.9 mm/day. The fastest growth of F. officinalis 5004 was observed on malt agar with the addition of larch sawdust: 1.8 ± 0.1 mm/day. The critical temperature for mycelial growth was 41 ± 0.1 °C. We tried three variants of plant substrates for fructification: sunflower husk, larch sawdust and larch chips. The substrate composition influenced the vegetative growth and the formation of teleomorph stage. The sunflower husk was the most favorable substrate for the growth of vegetative mycelium. The mycelium had completely colonized this substrate by the 30th day, in contrast to the larch chips, which were only partially colonized (ca. 50%) on 30-40th days of experiment. The fungus developed fruit bodies on both substrates: the sunflower husk and larch chips. The least suitable substrate for vegetative growth of this species was the larch sawdust. After two months of incubation, the mycelium covered only 27% of the visible surface of substrate blocks, with no primordia and fruiting bodies forming. Thus, the obtained mycelium growth parameters on nutrient media, micro- and macromorphological characteristics can be used as additional taxonomic characteristics of F. officinalis culture in the vegetative stage of growth. The strain IBK 5004 may become a potential producer for new fungal biotechnologies in Ukraine in the near future.
Keywords: scanning electron microscopy; mycelial colony; radial growth rate; critical temperature; fruiting
Article info
Received 07.09.2017 Received in revised form
20.10.2017 Accepted 23.10.2017
M. G. Kholodny Institute of Botany, National Academy of Sciences of Ukraine, Tereshenkivska Str., 2, Kyiv, 01601, Ukraine. E-mail:
mikhajlova. ok@gmail. com
Taras Shevchenko National University of Kyiv, Ukraine. Volodymyrs'ka Str., 64, Kyiv, 01033, Ukraine. E-mail: [email protected]
Hutsulshchyna National Nature Park, Kosiv, Ukraine. E-mail:
mashapascjlyuk@gmail com
LF Lambert Spawn Co., 1507 Valley Rd Coatesville, PA 19320, USA. E-mail:
andrii. gryganskyi@gmail. com
Бюлопчш особливосп рвдккного лжарського гриба Fomitopsis officinalis (Fomitopsidaceae, Polyporales) на агаризованих живильних середовищах i рослинних субстратах
О. Б. Михайлова*, Н. А. Бюько*, М. М. Сухомлин**, М. Л. Ломберг*, М. В. Пасайлюк***, Ю. В. Петричук***, А. П. Григанський****
*1нститут ботатки iMeui М. Г. Холодного НАН Украти, Кшв, Украта **Кт'вський нацюнальнийутверситет iMeHi Тараса Шевченка, Кшв, Украта ***Нацюнальний природний парк «Гуцульщина», Коав, Украта ****Компатя «LFLambert Spawn», Коатсвшь, США
Проведено верифжащю штаму Fomitopsis officinalis 5004 з Колекцй культур шапинкових грибiв (1ВК) i3 застосуванням молекулярно-генетичних i культурально-морфологiчних методiв дослщження. За результатами ДНК-типування рiвень гомологи штаму становив 99%. Наведено результата дослщження бюлопчних особливостей штаму на агаризованих живильних середовищах i рослинних субстратах рiзного складу. Вивчено мiкроструктури вегетативного мщелто методами оптично! та сканувально! електронно! м^оскопи. У культури F. officinalis 5004 спостершали гiфи з регулярними одж^чними пряжками без зазору, дуже рiдко пряжки медальйонного типу, незначну юльюсть анастомозiв i мiцелiальних тяж1в, пiсля тривалого культивування (понад 30 дiб) формувались бластоконщи. Вперше для виду F. officinalis виявлено iнкрустацiю гiф у виглядi тонких ворсинок. За показником радiальноi' швидкосп росту дослiджену культуру вiднесено до групи грибiв, що ростуть дуже повшьно. Найсприятливiшим для вегетативного росту виявився солодовий агар iз додаванням тирси модрини з максимальною швидюстю росту 1,8 мм/добу. З'ясовано критичну температуру для росту вегетативного мщелто штаму F. officinalis 5004 -41 ±0,1 °С. Протестовано рослиннi субстрати рiзного складу для культивування та отримання плодових тiл дослiдженого виду у штучних умовах. Найсприятливiшим субстратом виявилося лушпиння соняшника, повне обростання якого вiдбувалося на 30-ту добу експерименту, а формування зачатюв плодових тш починалося з 20-! доби культивування.
Ключовi слова: сканувальна електронна мiкроскопiя; пфи; мiцелiальна колотя; радiальна швидюсть росту; критична температура; плодоношення
Вступ
Fomitopsis officinalis (Vill.) Bondartsev & Singer - рщкюний лжарський гриб, вщомий у медичнш пракгищ як «модринова губкам». У «Червонш кния Укра!ни» F. officinalis наводиться п!д р1зними назвами: Boletus officinalis Vill., Fomes officinalis (Vill) Neum., Laricifomes officinalis (Vill.) Kotl. & Pouzar тощо га мае природоохоронний сгагус - «зниклий» (Diduh, 2009). F. offici-nalis - паразиг, який розвиваегься на сговбурах модрини (Larix sibirica Ledb., L. sukaczewii Dyl., L. gmelinii (Rupr) Rupr., L. kam-chatica (Rupr) Carr.) i деяких !нших вид!в хвойних, викликаючи буру кубiчну серцевинну гниль. Трапляегься у Сврази га П!в-нiчнiй Америцт Найбшьше його поширення спостер!гаеться у хвойних тсах Красноярського краю, Буряш, Туви. В Украш! ще у першш половин! XX столптя вид знаходили на територи Карпагських i зах!дноукра!нських люш, проте останн!м часом повщомлення про його знахщки вщсутн! (Diduh, 2009).
Модринова губка - ц!нний лжарський гриб, який мае три-валу гсторта використання (Wasser, 2010; Chang and Wasser, 2012; Hwang et al., 2013; Grienke et al., 2014; Wasser, 2014; Gabriel, 2016). Сучасн! дослiдження довели, що модринову губку можна вважаги не лише щнною природною сировиною, а i перспекгивним продуценгом для огримання фармакологiчних речовин широкого спекгра ди. 1з плодових хл га мщелта F. officinalis видшено каротинощи, стерини, ненасичен! жирн! кислоти, полюахариди, глюкозамни, агарицинову кислогу, бю-флавоно!ди, вггамши групи В, Е, А, еф!рн! олй, циток!н!ни (Oorzhak, 2006; Kovaleva, 2009; Wasser et al., 2011; Cukanova and Belikov, 2013; Vedenicheva et al., 2016). Водн! га вуглекис-лотн! ексгракги, отриман! з плодових хл F. officinalis, маюгь протимжробну активнiсть до умовно-пагогенних бактер!й, а також до патогенно! бакгерй Mycobacterium tuberculosis (Ayra-petova et al., 2009; Chang et al., 2013; Gregori et al., 2013). Дточа речовина, яка забезпечуе фармакологiчний ефекг, - агарицино-ва кислого (Gavrilin et al., 2006). Водн! ексгракги, отриман! з мщелто модриново! губки, проявляюгь онкостагичну актив-н!сть вщносно кл!гин асцитно! карциноми Ерлiха (АКЕ) (Kovaleva, 2009) га акгивт стосовно в!русу грипу р!зних субтитв (HjNi 1N = 3,00 ± 0,11 lg, H;N2 IN = 1,50 ± 0,25 lg) (Tepljakova et al., 2014).
Збирання плодових хл цього гриба разом !з неконгрольо-ваним вирубуванням лю!в викликали рiзке скорочення чисель-носх локалiтетiв виду (Gregori et al., 2013). Тому сьогодт F. officinalis включений до Червоних списюв шести европейських кра!н у кагегор!ях рщкюний (rare), критично рщюсний (extremely rare) чи зникаючий (declining species) та 13 регюшв Росгй-сько! Федерацй (Chlebicki et al., 2003).
Зважаючи на фармаколопчну цштсть F. officinalis та його природоохоронний статус, збереження цього виду - прюритет-не завдання науковцш (Hawksworth, 2004; Pi^tka and Grzywacz, 2005; Gregori et al., 2013). Оскшьки на територи Укра!ни у при-родних умовах вид гривалий час не реесгрували, пракгичний б!к охорони F. officinalis нин! реал!зуеться шляхом тдгриман-ня штамтв цього виду в Колекцй культур шапинкових гриб!в (1ВК) 1нстигуту боганжи !меш М. Г. Холодного НАН Укра!ни
(об'ект национального надбання Украïни) та внесена до м!жна-родноï бази даних Всесвiтньоï федерацй колекцй культур -WFCC (код доступу 1152; www.wfcc.info) (Lomberg et al., 2015; Bisko et al., 2016).
Загалом у баз! даних WFCC представлено дев'ять штам!в цього виду (http://gcm.wfcc.info). Три з них збер!гаються в Колекцй культур Ботатчного !нституту РАН (LE BIN), чотири зазначен в Колекцй культур CBS (Т!роль, Австр!я), один - у Колекцй MUT (Пьемонт, 1талш).
В!домост! щодо культурально-морфологиних характеристик F. officinalis до останнього часу залишалися досить обме-женими. Переважна бшьшкть опублжованих праць присвяче-на поширенню, екологiï та охоронному статусу цього виду у природ! або дослщженню б!ох!м!чного складу та кiлькiсноï щентифжагщ основних груп б!олог!чно активних речовин у плодових тшах, з!браних у природних умовах. Проте б!олог!ч-m властивост! губки модриновоï у культур! досл!джен фрагментарно. Таким чином, мета n!eï статх - встановити культу-рально-морфолог!чн! особливосх штаму F. officinalis 5004 на щшьних живильних середовищах i рослинних субстратах р1з-ного складу. Таке досл!дження - важливий етап ¿з погляду збереження цього виду в культур!, вщновлення у природному середовищ!, пошуку та розроблення бютехнологи отримання б!олог!чно активних речовин р!зноман!тного призначення.
MaTepiai i методи дослщжень
Об'ект дослщження - чиста культура F. officinalis 5004, яка зберпжться у Колекцй культур шапинкових гриб!в 1нституту ботанжи ¿мен! М. Г. Холодного НАН Украши (1ВК) (Bisko et al., 2016). Видову приналежтсть культур визначали культу-рально-морфологиними та молекулярно-генетичними методами. Молекулярно-генетичт досл!дження проведен! на баз! 1н-ституту ботан!ки ¡мен! М. Г. Холодного (Кшв, Украша) та ком-панiï L. F. Lambert Spawn Co. (Коатсвшь, США). Зг!дно з уста-леною практикою, джерелом ДНК у м!колог!чних досл!джен-нях виступала чиста аксен!чна культура (Kumar and Shukla, 2005). У нашому досл!дженн! використали 20-добовий вегетативний м!цел!й штаму F. officinalis 5004.
Екстракщю ДНК дослiдженоï культури здшснювали за модиф!кованою експрес-методикою, запропонованою Dörnte et al. (2013). Мlцелiалъну масу вагою 30-50 мг стерильно переносили до пластиковоï проб!рки-епендорфа для жшмеразнм ланцюговоï реакцiï (ПЛР) об'емом 200 мкл, у яку попередньо вносили 50 мкл стерильного буферного розчину. При цьому намагались уникнути переносу до проб!рки агаризованого середовища, тому що його присутн!сть у проб! пригшчуе ПЛР. Для приготування буферного розчину в м!рну колбу об'емом 100 мл вносили 10 мл розчину А ! 2 мл розчину Б (розчин А: TRIS 1,21 г розчиняли в 10 мл дистильоваж^ води; розчин Б: EDTA 1,46 г розчиняли в 10 мл дистильованоï води), доводили до мтки та автоклавували при 0,75 атм. рН розчину становить 8,0.
Готов! епендорфи з м!цел!ем щ!льно закривали, п!сля чого переносили в мжрохвильову п!ч на 1 хв за потужносп м!крохвил! 1,2 кВт, тa нагр!вали дв!ч! з перервою в 1,5 хв, щоб
запобити тепловш деформацп пробфок. При цьому ДНК по-трапляла у буфер, який, в!дпов!дно, являв собою готовий ек-стракт тотально! ДНК, одержано! з даного зразка. За допомо-гою птетки-дозатора 25 мкл надосадово! рщини переносили у двох повторах до стерильних 50 мкл пробфок для PCR. Готовий продукт збершали за температури -20 °С до подальшого використання. Надал1 заморожен! зразки транспортували до молекулярно! лаборатори L. F. Lambert Spawn Co. (Коатсвшь, Пенсильван!я, США), де були проведен! вс! подальш! молекулярн! дослщження.
ПЦР зд!йснювали в ампл!ф!катор! T100TM Thermal Cycler (Bio-Rad Laboratories, Inc., Геркулес, США), використовуючи стандартний протокол для дшянок внутр!шнього транскрибу-вального спейсера (ITS) у гриб!в (Kumar and Shukla, 2005). Для щдтвердження успшносп амшйфжаци зд!йснювали гель-елек-трофорез ампл1ф!кованих фрагмента ДНК в 1% агарозному гел1 на основ! буферу 1xSB (борат натрто, Faster Better Media LLC, Хант Велей, США) за напруги 120 В y PowerPac TM Basic (Bio-Rad Laboratories, Inc., Геркулес, США). Вгзуалгзацто продукпв ПЛР проводили в транс-iлюмiнаторi Universal Hood 75S (Bio-Rad Laboratories, Inc., Геркулес, США). Амптфжова-ний продукт PCR oчищали вiд залишкв потмеразно! сумтп за допомогою креветково! лужнo! фосфатази (GE Healthcare, Пршстон, США) - 0,1 одинищ, та екзонуклеази I (New England Biolabs, 1псв!ч, США) - 0,.23 одинищ на один зразок в!дпов!д-но. Для визначення нуклеотидних послiдовностей дослщжува-ного фрагмента геному очищет продукти ПЛР секвенували методом Сенгера з використанням праймера ITS4 y PrimBio Research Institute (Екстон, США). Послщовносп вщредаговат тa вирiвнянi з використанням програмного пакета Geneious v. 8.1.8 (Biomatters LTD, Окленд, Нова Зеландiя).
Верифжацто штаму 5004 проводили на основ! нуклеотид-но! послiдовностi генiв рДНК (ITS1-5,8S-ITS2), аналiзуючи отриманi данi в програмi MEGA 6. Для пошуку близько спо-рiднених послiдовностей використовували евристичний алгоритм на серверi BLAST (http://www.ncbi.n/m.nih.gov/blast), який дозволяе визначати гомологiчнi послiдовностi у доступнiй мiжнароднiй базi даних нуклешових кислот (NCBI) Нацональ-ного Центру бiотехнологiчно! шформащ Нацiонального шститу-ту Здоров'я США GenBank (http://www.ncbi.n/m.nih.gov/Genbank).
Морфологiю та зростання культури дослiджували на стан-дартних i модифiкованих агаризованих живильних середови-щах рiзного складу: 1) мальц екстракт агар (МЕА); 2) солодо-вий агар (8° по Балшгу) з додаванням 1% тирси модрини (САМ); 3) солодовий агар (8° за Балшгом) з додаванням 1% тирси вишт (САВ); 4) картопляно-декстрозний агар (DIFCO) (КДА); 5) глюкозо-пептон-дргжджовий агар (ГПДА), г/л: глюкоза -25,0; пептон - 5,0; дргжджовий екстракт - 3,0; агар-агар - 20, рН 5,5. Як погний матершл використанi 14-добовi культури, вирощет на САМ. Диски мiцелiю диметром 5 мм вирiзали стерильною стальною трубкою по краю (до 10 мм) активно ростучо! колони, переносили !х у центр чашки Петрi iз зазна-ченими вище середовищами та iнкубували в термостат! за 26 ± 0,1 °С. Визначення впливу екстремальних значень температу-ри на життездаттстъ дослiджено! культури F. officinalis проводили у пробiрках зi скошеним середовищем САМ за температур 30-42 °С iз кроком 1 ± 0.1 °С. Пгсля третьо! доби iнкубацii враховували наявтсть чи вiдсутнiстъ росту мiцелiю. Пробiрки, на яких рiст мiцелiю не спостершали, далi iнкубували за температури 26 ± 0.1 °С. Поновлення росту або втрату життездатно-стi мiцелiю культури фiксували тсля 10 д^б iнкубацii. Радиль-ну швидкiстъ росту розраховували за методикою (Solomko et al., 2000; Lomberg and Solomko, 2012). Мжро- та макромор-фологiчнi особливосп мiцелiю визначали на чотиритижневих колонiях за стандартними методиками, запропонованими П. Сталперсом (Stalpers, 1978). Макроморфологiчна характеристика колони включала в себе опис текстури мiцелiально! колони та !! котр, запах мiцелiю, колф реверзуму, мжромор-фологiчна - опис характерних особливостей пфально! системи,
наявнiсть на мщели пряжок i анаморф. Мжрострукгури вегетативного м!цел!ю дослiджували у свпловому мжроскот марки МБ1-6 та сканувальному електронному мiкроскопi JSM-35C (Япон!я), використовуючи модиф!кований метод Е. Кватель-баума i Г. Карнера (Buhalo et al., 2011).
Динамику росту вегетативного мщелто F. officinalis на рос-линних субстратах рiзного складу досл!джували в лабораторiï екологiчного мошторингу НПП «Гуцульщина». Використано так! субстрати: 1) модринова стружка; 2) модринова тирса; 3) лушпиння соняшника. Модринову стружку отримували у процесi стругання здорово! модриново! деревини, розм!ри де-рев'яних частинок складали 10 х 10-40 х 1 мм. Модринову тирсу отримували п!д час розпилювання здорово! модриново! деревини, розмгри дерев'яних частинок 1-2 мм (надання мод-ринового матерiалу для дослiджень погоджено Науково-тех-нiчною радою НПП «Гуцульщина» в!д 23.12.2015 р.).
Усi субстрати зволожували до 60% вологосп та розкладали в 1 л колби. Кожна колба мстила 40 ± 1,5 г зволоженого субстрату. Смност! з ус!ма варiантами субстрат!в автоклавували 90 хв за двох атмосфер.
Колби !з субстратами стерильно шокулювали пос!вним м!цел!ем 25-денного в!ку, вирощеним на САМ при 26 ± 0.1 °С. У кожну колбу вносили 1/4 частини колонй мщелто з чашки Петр!, дааметром 90 мм. Пос!ви !нкубували за температури 26 ± 0,1 °С. Щодня вiзуально контролювали та реестрували ступшь обростання субстрату м!целiем культури. Для цього лшшкою вимгрювали висоту субстрату, який обргс мiцелiем !з чотирьох взаемно перпендикулярних бок!в емност! Обчислю-вали середн! значення та визначали (у %) висоту оброслого м!цел!ем субстрату.
вс! достди проводили у трьох 6!олог!чних повторностях. Статистичну обробку отриманих результат!в проводили з використанням програми Statistica 8.0 (StatSoft Inc., USA).
Результата
Штам F. officinalis 5004 збернжтъся у Колекцп культур ша-пинкових гриб!в (1ВК) понад 35 рок!в (Bisko et al., 2016). Шдтвердження його таксоном!чного статусу необхщне для проведения подальших досл!джень ц!е! культури. П!дтвердження ви-дово! приналежност! F. officinalis 5004 проведено !з застосуван-ням молекулярно-генетичних i культурально-морфологiчних ме-тод!в досл!дження.
Для штаму F. officinalis 5004 проведене повне визначення нуклеотидних послщовностей внутр!шьного транскрипциного спейсера: ITS1, 5.8S тa ITS2 регютв рРНК, а також часткове визначення 18S тa 28S послiдовностей, що оточують ITS. У результат! пошуку в генбанку депонован! там послщовносп зразкiв F. officinalis показали 99% !дентичност! з отриманими нами постдовностями, подтвердивши тим самим вид досл!д-женого штаму. Найближчий штам !з бази даних NCBI до до-слiджуваноï нами культури F. officinalis 5004 (код доступу MF952886) - !золят 0KM-8050 Fomitopsis officinalis (код доступу KC585355.1).
Додаткову верифжацто штаму F. officinalis 5004 проведено класичними морфолого-культуральними ознаками: досл!дже-но мжро- та макроморфологто вегетативного мщелто за су-купн!стю ознак на стандартному живильному середовищi за традицшною класифiкацiею Stalpers (1978), ростов! показники (радiальна швидк!сть росту), в!дношення до температури, наявтсть генеративна стадо на певних живильних середовищах.
У результат! проведеного досл!дження мжроморфологи за допомогою свплового та сканувального електронного м!кро-скоп!в установлено, що вегетативний м!дел!й F. officinalis 5004 складаеться переважно з тонкост!нних, пом!рно розгалужених, регулярно септованих, незабарвлених генеративних пф даамет-ром 1,2-3,5 мкм. На пфах утворювались численн!, поодинок! пряжки без зазору (рис. 1), дуже рщко пряжки медальйонного типу, незначна к!льк!сть анастомоз!в та м!цел!альних тяж!в.
Крш того, вперше для F. officinalis спостершали шкрустацю г1ф у вигляд тонких ворсинок. Шсля тривалого культивування понад 30 даб на вегетативному мщели формувались товсто-стшт бластокотди елтсо!дно! форми.
У результат! проведених достджеш> на агаризованих жи-вильних середовищах р1зного складу виявлено мшлитсгъ мор-фолопчних ознак мщел1альних колонш F. officinalis залежно вщ складу середовищ. Формувались два основт типи колонш.
1. колон!! дуже щшьт, непрозор1, повстисп, рщше окса-митов1, бшого кольору з1 значною юльюстю коротких повпря-них г1ф. Край колони нерiвний, злегка гиднятий над субстратом, запах вщсутнш або слабо фруктовий. Кол1р реверзуму збнжться ¿з колюром середовища.
2. Колони розрщжеш, шерстист! або борошнисп, край не-р!вний, злегка щднятий над субстратом, запах вщсутнш. Забарв-лення реверзуму не спостершали
Висота та щшьтстъ колонш вартавали залежно вщ складу живильного середовища. Найсприятлившим для росту вияви-лосъ середовище САМ, до складу якого входила тирса модри-ни. На нъому формувались колони першого типу (рис. 2а). На середовищi ГПДА хоча i спостерггали колони першого типу, проте к розмiри навiтъ на 30-ту добу культивування не пе-ревищували 30 мм у дiаметрi (рис. 26). Колони другого типу формувались на МЕА та КДА (рис. 3а). На вж використаних середовищах iз вжом з'являлись крагш ексудату та шгмента-ця коричневого кольору (рис. 36).
Рис. 1. Fomitopsis officinalis 5004: пряжка на гiфi без зазору, шкрустащя пф
Визначено швидкють радаального росту на агаризованих живильних середовищах р1зного складу, встановлено залежтсть цього показника вщ складу поживних речовин (рис. 4).
Культура F. officinalis 5004 характеризуется низькою швидюстю радального росту та вимогливгстю до складу живильних середовищ. Для достдженого штаму максимальну швидюсть росту забезпечував солодовий екстракт ¿з додаван-ням тирси модрини (1,9 мм/добу). На решп живильних середовищ швидюсть радаального росту реестрували в межах 0,41,0 мм/добу. За швидкютю радально! росту F. officinalis можна вщнести до групи грибiв, як ростуть дуже повшьно (менше 2 мм/добу).
Дослщжено вплив критичних температур на рют i житте-здатнiстъ вегетативного мщелта. Культура F. officinalis 5004 за щдвищення температури шкубаци до 37 ± 0,1 °С не росла, проте не втрачала свое! життездатносп та вiдновлювала ргст гид час перенесення и за умов 26 ± 0,1 °С протягом тижня. Температура 41 ± 0,1 °С з експозицiею три доби виявилась критичною для росту вегетативного мщелта.
Вплив складу субстратв на ргст вегетативного мiцелiю та формування стадо телеоморфи дослiджували на трьох вар1ан-тах рослинних субстратв: лушпиння соняшника, модринова тирса та модринова стружка.
Аналiз отриманих результатв дав змогу встановити певнi показники та визначити специфiку росту культури F. officinalis 5004 на субстратах р1зного складу. Найсприятливiшим субстратом для росту вегетативного мщелта виявилось лушпиння соняшника, на 30-ту добу експерименту спостершали повне обростання субстрату, на вщмшу вщ модриново! тирси та мод-риново! стружки, як повнiстю не заростали. Вщсоток обростання модриново! стружки мщел1ем F. officinalis на 30-40-ву добу експерименту складав 50%. Найнижчий вщсоток оброс-472 Regul. Mech.
тання (27%) характерний для модриновоï тирси: показники виходили на плато на 20-ту добу експерименту та залишалися такими навпъ на 60-ту добу вщ дати внесення мщелта у субстрат (рис. 5).
Формування зачатюв плодових тш спостерпжш лише на двох субстратах - лушпинт соняшника та модриновш струж-щ. На лушпинт соняшника примордiï формувалися пiсля 20-ï доби кулътивування, вони були молочно-кремового колъору, покривали субстрат щшъним товстим шаром (рис. 6).
На модриновш стружЦ поодиною зачатки плодових т1л починали формуватись на 30-ту добу культивування. На противагу плодовим тшам, сформованим на лушпинт соняшника, швадж тша, сформован! на модриновш стружщ, були стжно-бшими, ïх краï мали зiрчастоподiбний вигляд (рис. 7). Таким чином, формування зачатюв плодових тш спостерпшш лише на лушпинт соняшника та модриновш стружщ. Модринова тирса - малопридат-ний субстрат для обростання мщетем F. officinalis 5004 та непри-датна для формування зачатюв плодових тш гриба.
Обговорення
Шд час роботи з культурами макромщетгв необхщно по-стшно контролювати ïх чистоту за встановленими мжро- та макроморфологiчними ознаками певного виду (Nobles, 1971). Одна з найважливших таксономiчних ознак год час щентифь кацiï базидiевих макромщепв у кулътурi - наявтстъ унжалъ-ноï структури - пряжок, яю утворюютъся на мiцелiï багатъох представниюв цiеï групи грибiв (Stalpers, 1978). Рiзнi види ха-рактеризуютъся певними вщмшностями в розташувант пряжок на мщели, частой ïх утворення, розмрах тощо (Buchalo et al., 2011; Volz and Nevo, 2009). Для даного виду встановлено два типи пряжок: класичт та медалъйонт.
Рис. 2. Мщетальт колони Fomitopsis officinalis 5004 на агаризованому живильному середовищ! САМ (а) i ГПДА (б) за температури шкубаци 26 ± 0,1 °С (30-та доба культивування)
У.
J б
Рис. 3. Мщапальт колони Fomitopsis officinalis 5004: а - на агаризованому живильному середовищ! МЕА (30-та доба культивування); б - на агаризованому живильному середовищ! САМ (60-та доба культивування); температура шкубаци 26 ± 0,1
а
а
САМ САВ МЕА КДА ГПДА Живильн! середовища
Рис. 4. Радаальна швидк!сть росту колонш F. officinalis 5004 на агаризованих живильних середовищах р!зного складу за температури 26 ± 0,1 °С
лушпиння соняшника
модринова стружка
1 10 20 30 40 50 60 Доба експерименту
Рис. 5. Динамжа обростання м!цел!ем F. officinalis 5004 субстратш р!зного складу
Рис. 6. Зачатки плодових тш Fomitopsis officinalis 5004 на лушпинт соняшника, 20-та доба експерименту
Рис. 7. Зачатки плодових тш Fomitopsis officinalis 5004 на модриновш стружщ, 30-та доба експерименту
У л1тератур1 наводяться дат (Kovaleva, 2009), що модринова губка тсля 30 д1б культивування здатна утворювати не-значну кiлъкiсть бластоконiдiй. Отриманi нами мжроморфоло-гiчнi характеристики F. officinalis 5004 важлив1 для щентиф1-кагщ та контролю чистоти культури пiд час збереження штаму в умовах колекци. Вс1 дослiдженi живилънi середовища при-датнi для росту мiцелiю гриба, проте додавання тирси модрини позитивно впливало на ростов1 показники культури. Наш1 результата повнiстю узгоджуються з даними, наведеними шши-ми досл1дниками. Kovaleva (2009) наводить дат щодо значень середньодобово! швидкост1 росту 1золяпв F. officinalis у межах в1д 0,75 до 0,96 мм/добу та значенням ростового коефшкнта в межах 24,5-25,6 на сусло-агар1 та сусло-агар1 з додаванням 13% тирси модрини. Автор пропонуе культивувати штами F. officinalis на сусло-агар1 з додаванням 1% тирси модрини.
Нит ще не розроблено ефективно! технологи штучного отримання плодових тiл F. officinalis. Одна з причин вщсутно-сп технологи - недосконале знання бюлопчних особливостей цього виду, тому проведення досл1джет> у напрямку науково-го обгрунтування основних етап1в культивування доцльне. Використання модриново! тирси та модриново! стружки як субстратiв для нарощування пос1вного шокуляту F. officinalis видаеться доцiлъним з огляду на субстратну приуроченiсть гриба. Однак !х використання виявилося менш успшним, нiж лушпиння соняшника, яке повнiстю обростало мщел1ем гриба на 30-ту добу експерименту, тод1 як в1дсоток обростання модриново! стружки та тирси не перевишував 50% i 27% в1дпо-в1дно. Очевидно, що тирса та стружка модрини - б1дт за вм1с-
том поживних речовин середовища, на вщмшу в1д соняшни-кового лушпиння. З огляду на отриман результата, тд час по-дальших експерименпв 1з використанням тирси та стружки модрини доцшьно додавати до цих субстрапв р1зн1 домшки. Результата досл1дження Kovaleva (2009) св1дчать про необх1д-н1сть для росту модриново! губки у рослинному субстрат1 60% л1гн1ну, 20% деревно! зелен ялиц1 та 20% кори ялищ.
Зважаючи на те, що в Украгт ц1нний лжарський гриб F. officinalis вважаеться зниклим, отриман1 нами дан1 (склад жи-вильних середовищ 1 рослинних субстрат1в, параметри росту мщелта, критична температура шкубаци) створюють науков1 засади технологи культивування цього виду, а також у подальшому можуть бути використан для рештродукци його в природт умови.
Висновки
Проведено верифжацто штаму F. officinalis 5004 1з застосу-ванням молекулярно-генетичних 1 культурально-морфолопч-них методв досл1дження. Видова належтсть штаму, ви-значена за морфолопчними ознаками, повтстю збгглася з результатами ДНК-типування, 1деншчтсть до посл1довностей 1нших 1золятгв та колекц1йних зразкв F. officinalis становить 99%. Отримано дан про р1ст 1 морфологта мiцел1алъних колонш F. officinalis 5004 на живильних агаризованих середовищах 1 рослинних субстратах р1зного складу. За швидкютю росту дослщжену культуру F. officinalis 5004 в1днесено до групи гри-б1в, що ростуть дуже повгльно (0,4-1,9 мм/добу). Пщбрано
склад середовища (солодовий агар Í3 додаванням тирси модри-ни) для культивування та збереження штамш у належному фiзiологiчному стат в умовах колекци. Встановлено критичну для життездатносп мщелта F. officinalis температуру - 41 ± 0,1 °С. Визначено мжро- та макроморфолопчт характеристики мщелта на певних середовищах, ростовi показники, яю можна використовувати як додатковi таксонотчт характеристики культур F. officinalis у вегетативнш стадо росту. Проведено випробування рослинних субстратш рiзного складу для культивування мщелта та отримання плодових тш F. officinalis у штучних умовах. Найсприятлившим субстратом для росту вегетативного мщелта та формування зачаткш плодових тш F. officinalis 5004 виявилось лушпиння соняшника.
Автори щиро вдячт В. I. Сапсаю за проведет дослщження микроструктур вегетативного мщелш пщ сканувальним електронним мкроскопом.
References
Bisko, N. A., Lomberg, M. L., Mytropolska, N. Y., & Mykchaylova O. B.
(2016). The IBK mushroom culture collection. Alterpres, Kyiv. Buchalo, A. S., Wasser, S. P., Mykchaylova, O. B., Bilay, V. T., & Lomberg, M. L. (2011). Taxonomical significance of microstructures in pure cultures of mac-romycetes. Proceedings of 1he 7th International Conference on Mushroom Biology and Mushroom Products (ICMBMP7), 10, 50-57. Chang, H., Birgit, J., Larry, K., McAlpine, L. D., Napolitano, J., Fryling, J., Franzblau, N., Sang, S. C., Stamets, H., Wang, P., & Guido, Y. P. (2013). Chlorinated coumarins from the polypore mushroom Fomitopsis officinalis and their activity against Mycobacterium tuberculosis. Journal of Natural Products, 76(10), 1-13. Chang, S. T., & Wasser, S. P. (2012). The role of culinary-medicinal mushrooms on human welfare with a pyramid model for human health. International Journal of Medicinal Mushrooms, 95(1), 95-134. Chlebicki, A., Mukhin, V., & Ushakova, N. (2003). Fomitopsis officinalis on
Siberian Larc in the Urals. Mycologist, 17(3), 1-6. Cukanova, P. A., & Belikov, V. G. (2013). Issledovanie himicheskogo sostava i standartizacija syr'ja listvennichnoj gubki [Investigation of the chemical composition and standardization of raw larch sponge]. Razrabotka, Isledova-nie i Marketing Novoj Farmacevticheskoj Produkcii, 68, 130-132 (in Russian). Diduh, J. P. (Ed.). (2009). Chervona knyga Ukrai'ny. Roslynnyj svit [Red Data Book
of Ukraine. Vegetable Kingdom]. Globalkonsaltyng, Kyiv (in Ukrainian). Dornte, B., & Kües, U. (2013). Fast microwave-based DNA extraction from vegetative mycelium and fruiting body tissues of Agaricomycetes for PCR amplification. Current Trends in Biotechnology and Pharmacy, 7(4), 825836.
Gabriel, J. (Ed.). (2016). Macromycetes: Medicinal properties and biological peculiarities. [Makromicety: Lekarstvennye svojstva i biologicheskie osobenno-sti]. Vol. 2. Nash Format, Kyiv (in Russian). Gavrilin, M. V., Belikov, V. G., Ajrapetova, A. J., & Cukatova, P. A. (2006). Identifi-kacija agaricinovoj kisloty metodom infrakrasnoj spektroskopi [Identification of agaric acid by infrared spectroscopy]. Vestnik Voronezhskogo Gosudarst-vennogo Universiteta Serija: Himija, Biologija, Farmacija, 2, 231-232 (in Russian).
Grienke, U., Zoll, M., Peintner, U., & Rollinger, J. M. (2014). European medicinal polypores - A modern view on traditional uses. Journal of Ettmoharmacolo-gy, 154(3), 564-583. Hawksworth, D. L. (2004). Fungal diversity and its implications for genetic resource collections. Studies in Mycology, 50, 9-18.
Hwang, C. H., Jaki, B. U., Klein, L. L., Lankin, D. C., McAlpine, J. B., & Napolitano, J. G. (2013). Chlorinated coumarins from 1he polypore mushroom Fomitopsis officinalis and their activity against Mycobacterium tuberculosis. Journal of National Products, 76(10), 1916-1923.
Kovaleva, G. K. (2009). Biologicheskie osobennosti i biohimicheskij sostav ksilotofnyh bazidiomicetov Fomitopsis officinalis (Vill.: Fr.) Bond. et Sing., Ganoderma applanatum (Pers.) Pat. i Trametes versicolor (L.: Fr.) Pilat. [Biological features and biochemical composition of xylotophic basidiomycetes Fomitopsis officinalis (Vill .: Fr.) Bond. et Sing., Ganoderma applanatum (Pers.) Pat. and Trametes versicolor (L .: Fr.)]. Moscow (in Russian).
Kumar, M., & Shukla, P. K. (2005). Use of PCR targeting of internal transcribed spacer regions and single-stranded conformation polymorphism analysis of sequence variation in different regions of rRNA genes in fungi for rapid diagnosis of mycotic keratitis. Journal of Clinical Microbiology, 43(2), 662-668.
Lomberg, M. L., & Solomko, E. F. (2012). Rost kul'tur makromicetov na agarizo-vannyh pitatel'nyh sredah i plotayh subsfratah [Growth of the macromycetes cultures on agar nutrient media and solid substrates]. In: Wasser, S. P. (ed.), Biological features of medicinal macromycetes in culture. Vol. 2. Alterpres, Kyiv, 345-371 (in Russian).
Lomberg, M. L., Mykchaylova, O. B., & Bisko, N. A. (2015). Kolekcija kul'tur shapynkovyh grybiv (IBK) jak ob'jekt nacional'nogo nadbannja [Mushroom culture collection (IBK) as a subject of national heritage of Ukraine]. Ukrainian Botany Magazine, 72(1), 22-28 (in Ukrainian).
Nobles, M. K. (1971). Cultural characters as a guide to the taxonomy of Polypora-ceae. International Symposium Evolution in Higher Basidiomycetes. University of Tennessee Press, Knoxville.
Oorzhak, U. S. (2006). Nauchno-prakticheskie aspekly racional'nogo ispol'zova-nija plodovyh tel Fomitopsis officinalis (Vill.: Fr.) Bond. et Sing. [Scientific and practical aspects of the rational use of fruit bodies of Fomitopsis officinalis]. Krasnojarsk (in Russian).
Pi^lka, J., & Grzywacz, A. (2005). In situ inoculation of larch with the threatened wood-decay fungus Fomitopsis officinalis (Basidiomycota) experimental studies. Polish Botanical Journal, 50(2), 225-231.
Solomko, E. F., Lomberg, M. L., & Mytropolska, N. J. (2000). Rist okremyh vydiv likars 'kyh makromicetiv na zhyvyl'nyh seredovyshhah riznogo skladu [Growth of some species of medicinal macromycetes on nutrient media of different composition]. Ukrainian Botany Magazine, 57(2), 119-126 (in Ukrainian).
Stalpers, J. A. (1978). Identification of wood-inhabiting Aphyllophorales in pure culture. Studies in Mycology, 16, 1-248.
Tepljakova, T. V., Kosogova, T. A., Anan'ko, G. G., Bardasheva, A. V., & Il'i-cheva, T. N. (2014). Protivovirusnaja aktivnost' bazidial'nyh gribov. Obzor literatury [Antiviral activity of basidiomycetes. Review of literature]. Problemy Medicinskoj Mikologii, 16(2), 15-25 (in Russian).
Vedenicheva, N. P., Al-Maali, G. A., Mytropolska, N. Y., Mykchaylova, O. B., Bisko, N. A., & Kosakivska, I. V. (2016). Endogenous cytokinins in medicinal Basidiomycetes mycelia biomass. Biotechnologia Acta, 9(1), 55-63.
Volz, P. A., & Nevo, E. (Eds.). (2009). Microstructures of vegetative mycelium of macromycetes in pure cultures. Alterpress, Kyiv.
Wasser, S. P. (2010). Medicinal mushroom science: History, current status, future trends, and unsolved problems. International Journal of Medicinal Mushrooms, 12, 1-16.
Wasser, S. P. (2014). Medicinal mushroom science: Current perspectives, advances, evidences, and challenges. Biomedical Journal, 37(6), 345-356.
Wasser, S. P. (Ed.). (2011). Biologicheskie osobennosti lekarstvennyh makromi-cetov v kul'ture [Biological features of medicinal macromycetes in culture]. Vol. 1. Alterpres, Kyiv (in Russian).
Wasser, S. P. (Ed.). (2012). Biologicheskie osobennosti lekarstvennyh makromi-cetov v kul'ture [Biological features of medicinal macromycetes in culture]. Vol. 2. Alterpres, Kyiv (in Russian).
