CC BY
86
БИОЛОГИЯ
УДК 579.222.2:579.252.5
НАУЧНЫЙ
ОТДЕЛ
БИОДЕГРАДАЦИЯ НЕФТЯНЫХ УГЛЕВОДОРОДОВ ШТАММОМ DIETZIA MARIS, ЕЕ ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ
Е.В, Плешакова, С.Н. Голубев*, О.В. Турковская*
Саратовский государственный университет, кафедра биохимии и биофизики E-mail: [email protected]
* Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов E-mail: [email protected]
Показана способность штамма Dietzia maris АМЗ, выделенного из нефтяного шлама, к активной утилизации углеводородов нефти. У данного штамма, способного разрушать нефтяные углеводороды на 50-70% и в кислой, и в нейтральной среде, выявлены плазмиды размером около 54 т.п.н. Частота индуцированной элиминации свойства деструкции углеводородов нефти у штамма D. man's АМЗ составила 14.0%. Клоны D. maris АМЗ, утратившие плазмид-ную ДНК, характеризовались частичной элиминацией способности к деструкции нефтяных углеводородов, что может свидетельствовать о плазмидной локализации генов деструкции.
Biodegradation of Petroleum Hydrocarbons by Strain Dietzia Maris and Its Genetic Peculiarities E.V. Pleshakova, S.N. Golubev, O.V. Turkovskaya
The ability of strain Dietzia maris AM3, isolated from oil-slime, for active utilization of petroleum hydrocarbons was shown. Plasmids (size, near 54 kb) were found in this strain, capable of degrading petroleum hydrocarbons by 50-70% both in acid and in neutral media. The frequency of induced elimination of the property of degrading petroleum hydrocarbons in strain D. maris AM3 was 14.0%. The clones of D. maris AM3, which had lost their plasmid DNA, were characterized by partial elimination of the ability to degrade petroleum hydrocarbons, which may suggest that the degradation genes are localized от the plasmid.
В настоящее время известно немало микроорганизмов-деструкторов нефти и нефтепродуктов, которые используются в технологиях биоремедиации загрязненных объектов окружающей среды [1-4]. Нефтеокисляющие штаммы, интродуцируемые в загрязненную почву или воду, должны обладать определенными свойствами: высокой метаболической активностью и скоростью потребления углеводородов (УВ) нефти, конкурентной способностью по отношению к аборигенным углеводородокис-ляющим микроорганизмам и способностью к длительному выживанию в изменяющихся условиях окружающей среды.
Перед применением таких специализированных штаммов требуется их всестороннее изучение. Исследование генетической организации нефтеокисляющих штаммов-интродуцентов, накопление знаний о функционировании, передаче и экспрессии хромосомных или плазмидных генов биодеградации, изучение возможности применения методов генетической инженерии к этим бактериям необходимы для их длительной биотехнологической эксплуатации [5-7].
© Е.В. Плешакова, С.Н. Голубев, О.В. Турковская, 2007
Е.В. Плешакова, СМ. Гопубев, О.В. Турковская. Бподеградацпя нефтяных углеводородов
Объектом наших исследований явился штамм Dietzia тапБ АМЗ, выделенный прямым высевом из нефтешлама (г. Саратов). Этот штамм был идентифицирован в ВКГГМ (г. Москва). Установлено, что изучаемый микроорганизм обладал рядом экологических преимуществ, поскольку хорошо рос в присутствии 10% ЫаС1, а также в достаточно широком диапазоне температур - от 10 до 40°С и pH - от 4 до 9 [8].
Способность штамма использовать для роста нефть и нефтепродукты определяли с помощью чашечного метода Мак-Кланга, согласно которому отмечалось наличие роста культуры вокруг и внутри капель нефтяного субстрата на поверхности плотной минеральной среды [9]. Способность штамма к деструкции индивидуальных углеводородов (0,4 г/л) определяли с помощью метода лунок [10]. В результате изучения субстратного спектра штамма И. таНь АМЗ было показано, что он способен использовать для роста в качестве единственного источника углерода и энергии широкий набор нефтепродуктов и индивидуальных углеводородов: //-алканов (октан, гексан, гептан, декан, тридекан, гексадекан, гептадекан); ароматических соединений (толуол, ксилол, фенол, псевдокумол, амилбензол) и нафтенов (декалин). Штамм хорошо рос на среде с вазелиновым маслом, дизельным топливом, сырой нефтью, исключением являлся керосин, на котором рост отсутствовал.
Степень деградации нефти (10 г/л) и мазута (25 г/л) данным штаммом в жидкой минеральной среде за 14 сут культивирования составила 70.0 и 8.1% соответственно. Эмульгирующая активность Г), таш АМЗ по отношению к нефти, определенная методом Купера [11], соответствовала достаточно высоким значениям: Е24= 48%; Е48 = 36%.
Интересной особенностью оказалась выявленная у изучаемого штамма способность к деструкции нефтяных углеводородов в кислой среде. По данным газовой хроматографии деструкция гептадекана (2.5%) в жидкой среде за 7 сут культивирования составила 53.6% при pH 7 и 51.5% при pH 4.6.
В связи с тем, что нередко встречаются кислые почвы и сточные воды, требующие очистки от нефтяных загрязнений [12], это свойство штамма В. таш АМЗ может использо-
ваться для биоремедиации нефтезагрязнен-ных объектов, характеризующихся повышенной кислотностью.
При плазмидном скрининге методом, основанном на распределении в системе по-лиэтиленгликоль-декстран [13], у исследуемого штамма обнаружены плазмидные ДНК размером около 54 т.п.н. Получены доказательства стабильности плазмидных ДНК при культивировании изучаемого штамма-деструктора D. marls АМЗ в неселективных условиях (до 10 пассажей на МПА) и в условиях длительного хранения (5 лет) в коллекции.
Для изучения индуцированной элиминации свойства биодеградации углеводородов нефти у штамма D. maris АМЗ исследовалось воздействие [14] различных ингибирующих агентов (митомицин С, этидий бромид, профлавин, акридиновый оранжевый, налидиксовая кислота) на жизнеспособность и изменчивость штамма. Результаты экспериментов показали, что микроорганизм чувствителен к действию даже незначительных (10 мкг/мл) концентраций большинства ингибиторов. В ходе исследований была установлена субингибирующая концентрация только для одного ДНК-тропного агента -налидиксовой кислоты, которая составила 25 мкг/мл. Обработка штамма D. maris АМЗ этим ингибитором привела к возникновению клонов с редуцированной способностью к утилизации нефтяных углеводородов. Частота выявления таких клонов на агаризованной среде, содержащей в качестве единственного источника углерода и энергии сырую нефть, составила 14.0%).
Последующий скрининг плазмидных ДНК в 38 отобранных элиминантных клонах показал наличие экстрахромосомных элементов в большинстве из них. В то же время было установлено, что 4 клона утратили 54-т.п.н. плазмиды. На рис.1 представлен результат одного из электрофоретических анализов клонов D. maris АМЗ с пониженной деструктивной активностью по отношению к углеводородам нефти, в котором были выявлены бесплазмидные варианты.
Морфологические колонии четырех бесплазмидных клонов: 15н, 34н, 44н, 45н не отличались от исходного штамма D. maris АМЗ, это были колонии с гладкой блестящей поверхностью и характерной яркой кораллово-
Бпологпя
55
I 2 3 4 5 6 7 8 9 10 И 12 13 14
Рис. 1. Выявление плазмидпых ДНК в клонах штамма D. maris АМЗ, частично утративших способность к деструкции нефтяных углеводородов: 1 - исходный штамм; 2- 15н; 3-17н; 4 — 21н; 5-23н; 6-31н;
11 -34н; 12 - 44н; 13 - 46н; 14 - 47н; маркерные плазмиды: 7-RP4 (39т.п.н.); £-Rl (93 т.н.н); 9- R16 (103,5 т.п.н.); 10 - R386 (117 т.п.н.)
красной окраской. Результат иммунодиффу-зионного анализа со специфическими антителами данного штамма, осуществленного по методу [15], показал, что углеводные антигены клеточной поверхности элиминантных клонов не претерпели каких-либо изменений и абсолютно идентичны данным структурам исходного штамма D. maris АМЗ.
Количественная оценка деструктивной активности четырех вышеназванных элими-нантов по отношению к сырой нефти (10 г/л) при культивировании их в жидкой среде показала (рис. 2) заметное снижение способности к деструкции сырой нефти (в 2-5 раз).
D.inansi 15 и j 34м і 'Ни
Г------------ 1 Г“ . . ,.. ! I
|о % деструкции I 70,1_^ 34,2 ) 48.5 13,8
Рис.2. Деструктивная активность члиминантов О. тагіз АМЗ по отношению к сырой нефти (10 г/л) при культивировании их в жидкой среде в течение 14 сут
Установлено также, что у элиминантов степень деградации индивидуального нефтяного углеводорода гептадекана в жидкой среде (2.5%) была сравнима с уровнем его разрушения исходным штаммом В. таш
АМЗ. С помощью качественного анализа показано, что у элиминантных клонов утрачивалась способность к утилизации декалина.
Необходимо отметить, что нефть - чрезвычайно гетерогенный субстрат, она состоит из углеводородов различных классов. И, несомненно, гены деструкции многочисленных нефтяных углеводородов не могут быть локализованы на одной плазмидной молекуле. Однако полученные данные о высокой частоте (14.0%) индуцированной элиминации свойства биодеградации углеводородов нефти, заметном снижении способности к деструкции нефти и декалина при утрате плазмидной ДНК штаммом D. maris АМЗ свидетельствуют об участии плазмидных генов в процессе биодеградации нефтяных углеводородов.
Библиографический список
1. Sharma S.L., Pant A. Biodegradation and conversion of aikanes and crude oil by a marine Rhodococcus sp. // Biodegradation. 2000. V.l 1. P.289-294.
2. El Fantroussi S., Agathos S. Is bioaugmentation a feasible strategy for pollutant removal and site remediation? // Current Opinion in Microbiology. 2005. V.8, №3. P.268-275.
3. Ouyang W., Liu //., Murygina V. et al. Comparison of bioaugmentation and composting for remediation of oily sludge: A field-scale study in China // Process Biochem. 2005. V.40. P.3763-3768.
4. Андреева И.С., Емельянова E.K., Загребельный C.H. и др. Психротолерантные штаммы-нефтедеструкторы для биоремедиации почв и водной среды // Биотехнология. 2006. №1. С.43-52.
5. Larkin M.J., De Mot R., Kulakov L.A., Nagy /. Applied aspects of Rhodococcus genetics // Antonie van Leeuwenhoek. 1998. V.74.P.133-153.
6. Pepper I.L., Gentry T.J., Newby D.T. et al. The role of cell bioaugmentation and gene bioaugmentation in the remediation of co-contaminated soils // Environmental Health Perspectives Supplements. 2002. V.l 10, №6. P.943-946.
7. Ахметов Л.И., Иванова E.C., Пунтус И.Ф. и др. Горизонтальный перенос плазмиды биодеградации нафталина в процессе микробной деструкции дизельного топлива и нефти в открытом проточном биореакторе // Биотехнология. 2006. №4. С.79-86.
8. Плешакова Е.В., Матора Л.Ю., Турковская О. В. Интродукция нефтеокисляющего штамма Dietzia maris в загрязненную почву: Сб. ст. / Под ред. О.В. Турковской. Саратов: Научная книга, 2005. С.148-156.
9. Теннер Е.З., Шгшьникова В.К., Переверзева Г.И. Практикум по микробиологии. М.: Колос, 1993. 175 с.
10. Практикум по микробиологии. / Под ред. Н.С. Егорова. М.: Изд-во МГУ, 1976.307 с.
11. Cooper D.G.. Goldenberg B.G. Surface active agents from two Bacillus species // Appl. Environ. Microbiol. 1987. V.53, №2. P.224-229.
56
Научный отдел
Е.В. Степанова, 8.6. Игнатов. Влияние ионов кадмия на активность аминотрансфераз
12. Gemmell R.T., Knowles C.J. Utilisation of aliphatic compounds by acidophilic heterotrophic bacteria. The potential for bioremediation of acidic wastewaters contaminated with toxic organic compounds and heavy metals // FEMS Microbiology Letters. 2000. V.192. P. 185-190.
13. Голубее C.H. Критические миниплазмидьг азосни-рилл: разработка эффективных методов выделения и характеристика репликонов: Дис. ... канд. биол. наук. Саратов, 2002. 209 с.
14. Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике. М.: Мир, 1976. 440 с.
15. Ouchterlony О., Nilsson L.-A. Immunodiffusion and im-munoelectrophorcsis // Handbook of experimental immunology. V.l. Immunochemistry / Ed. D.M. Weiz. Oxford: Alden Press, 1979. P. 19-33.
